CN112773801A

CN112773801A - 1,2,4三唑并4,3-b哒嗪衍生物在制备抗新冠病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN112773801A
Application number: CN202011429563.4A
Authority: CN
Inventors: 赵勇; 谢晨; 陈艳莲; 金和平
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112773801B

Abstract

本发明公开了miRNA let‑7或其激动剂在制备治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2药物中的应用。本发明还提供了式（I）所示[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物、其药学上可接受的盐或多晶型物在制备治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2药物中的应用。本发明提供的miRNA let‑7及其激动剂、式（I）所示[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物都可以作为双功能靶向药物控制病毒增殖的同时抑制炎症因子风暴从而治疗新冠肺炎，具有广泛的应用前景。

Description

1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗新冠病毒药物中的应用

技术领域

本发明医药技术领域，更具体地，涉及1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗新冠病毒药物中的应用。

背景技术

新冠肺炎目前已经进入全球大流行的阶段，然而目前仍然没有针对新冠肺炎的特效药物，尤其是对重症患者缺乏有效的治疗手段，这也是新冠肺炎死亡率居高不下的主要原因。病毒感染导致的炎症因子风暴是新冠肺炎重要的致死因素，阻断病毒复制，控制炎症因子风暴是新冠肺炎特效药开发的重要方向。

新冠肺炎的症状类似流感，常见症状包括：发热（占98.6%），疲劳（占69.6%），干咳（占59.4%），肌痛和呼吸困难等呼吸道症状[4]。部分患者还伴有腹泻和恶心等消化道症状。患者初期大多症状较轻，但若不及时治疗会有很大几率转化为重症，重症患者会出现肺炎、肺纤维化、严重急性呼吸综合征、肾衰竭等症状，甚至死亡。从首发症状到呼吸困难的中位时间为5.0天，到急性呼吸窘迫综合征的中位时间为8.0天。根据世界卫生组织统计，新冠肺炎的重症患者死亡率超过50%。与SARS相似，死于新冠肺炎感染的患者的组织学病例显示出弥漫性肺泡损伤，透明膜形成。相比于年轻人，老年人更容易感染新冠病毒，并且具有更高的发病和死亡风险，80％的死亡发生在65岁及65岁以上的患者中。

目前，全世界的新冠肺炎患者已经超过两千万，死亡人数超过八十万，严重威胁全人类的健康生活与经济发展。新冠肺炎是由新冠病毒（SARS-CoV-2）感染所致，新冠病毒感染后激活人体炎症反应，刺激以IL-6和CCL2为代表的炎症因子，大量的炎症因子一方面使得患者发烧，另一方面募集大量的免疫细胞吞噬病毒及被病毒侵染的细胞，这一过程中大量的细胞“尸体”形成粘液覆盖呼吸道从而导致患者产生咳嗽和呼吸困难；此外，CCL2等炎症因子还能促进肺纤维化进一步加剧患者的呼吸困难。

目前为止，人类对新冠病毒尚无靶向药物及疫苗上市。疫苗的临床研究以及流行病学研究表明，疫苗接种者和新冠病毒感染康复者仅能获得几个月的保护期，仍然具有二次感染的风险，这暗示人类仅依靠疫苗无法战胜新冠病毒。氯喹类药物能广泛抑制含囊膜的病毒增殖和扩散，然而羟氯喹在治疗新冠肺炎的临床研究中效果不佳并且表现出较强副作用。中药制剂连花清瘟胶囊能轻微抑制新冠病毒增殖并且防止新冠病毒诱导的炎症因子风暴，在轻症患者中疗效显著，对重症患者没有显著的改善作用。瑞德西韦是目前治疗新冠肺炎最有效的小分子药物，然而该化合物虽然体外实验中抗病毒效果显著，但在临床应用中并未显著抑制患者体内的病毒载量，并且该药也只能缩短轻症患者的康复时间，对重症患者缺乏疗效。目前对重症患者只能采取呼吸治疗等辅助治疗手段，辅以抗炎症因子药物及康复者血清进行治疗。除了连花清瘟胶囊外，目前所有用于新冠肺炎治疗的药物还面临着成本过高，患者难以承受的缺点。因此深入研究新冠病毒致病机理，开发更加经济、高效的靶向药物对于新冠肺炎的防控具有重大意义。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于提供miRNA let-7或其激动剂在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用、制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2增殖药物中的应用、制备新型冠状病毒SARS-CoV-2结构蛋白S和M的表达抑制剂中的应用以及制备IL-6和/或CCL2炎症因子抑制剂中的应用。

本发明第二个方面的目的，在于提供[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用、制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2增殖药物中的应用、制备新型冠状病毒SARS-CoV-2结构蛋白S和M的表达抑制剂中的应用以及制备IL-6和/或CCL2炎症因子抑制剂中的应用。

本发明第三个方面的目的，在于提供一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物。

本发明第四个方面的目的，在于提供一种治疗新冠肺炎的药物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供miRNA let-7或其激动剂在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。

本发明的第一个方面，还提供miRNA let-7或其激动剂在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2增殖药物中的应用。

本发明的第一个方面，还提供miRNA let-7或其激动剂在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2结构蛋白S和M的表达抑制剂中的应用。

本发明的第一个方面，还提供miRNA let-7或其激动剂在制备IL-6和/或CCL2炎症因子抑制剂中的应用。

根据本发明第一个方面所述的应用，所述miRNA let-7的激动剂为上调miRNAlet-7或增强miRNA let-7活性的试剂或组合物。

优选地，含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅰ. miRNA let-7或其模拟物的RNA分子；

Ⅱ. 含有miRNA let-7或其模拟物核酸序列的RNA分子；

Ⅲ. 含有编码miRNA let-7的核酸序列的病毒、载体；

Ⅳ. 靶向上调miRNA let-7或增强miRNA let-7活性的化合物。

本发明的第二个方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（I）。

本发明的第二个方面，还提供[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2增殖药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（I）。

本发明的第二个方面，还提供[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2结构蛋白S和M的表达抑制剂中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（I）。

本发明的第三个方面，提供一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物，所述药物中含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅰ. miRNA let-7或其模拟物的RNA分子；

Ⅱ. 含有miRNA let-7或其模拟物核酸序列的RNA分子；

Ⅲ. 含有编码miRNA let-7的核酸序列的病毒、载体；

Ⅳ. 靶向上调miRNA let-7或增强miRNA let-7活性的化合物。

优选地，所述化合物为式（I）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（I）。

本发明的第四个方面，提供一种治疗新冠肺炎的药物，所述药物中含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅰ. miRNA let-7或其模拟物的RNA分子；

Ⅱ. 含有miRNA let-7或其模拟物核酸序列的RNA分子；

Ⅲ. 含有编码miRNA let-7的核酸序列的病毒、载体；

Ⅳ. 靶向上调miRNA let-7或增强miRNA let-7活性的化合物。

（I）。

本发明的有益效果是：

本发明提供了miRNA let-7在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。在本发明部分实施例中，验证了miRNA let-7具有抑制新冠病毒结构蛋白S和M的表达，从而抑制新冠病毒复制的作用；此外，还验证了miRNA let-7能抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达和分泌。新冠病毒感染后激活人体炎症反应，刺激以IL-6和CCL2为代表的炎症因子，大量的炎症因子一方面使得患者发烧，另一方面募集大量的免疫细胞吞噬病毒及被病毒侵染的细胞，这一过程中大量的细胞“尸体”形成粘液覆盖呼吸道从而导致患者产生咳嗽和呼吸困难。

本发明还提供了miRNA let-7的激动剂在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。miRNA let-7的激动剂可以通过上调miRNA let-7或增强miRNA let-7活性从而进一步抑制新冠病毒结构蛋白S和M的表达、抑制新冠病毒复制以及炎症因子IL-6和CCL2的表达和分泌。在本发明部分实施例中，miRNA let-7的激动剂可以是含有miRNA let-7的表达载体或慢病毒。在本发明的部分实施例中miRNA let-7的激动剂可以是[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物C1632。

C1632为已知的小分子药物，能溶于水或者DMSO，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，能通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。针对新冠肺炎高传染性、高致死率并且无特效药的现状，提供了小分子化合物C1632的一种全新的应用，即将C1632作为抗新冠肺炎药物，为新冠肺炎的防治提供了新的思路和方案。

在本发明部分实施例中，验证了C1632能显著抑制新冠病毒的增殖，并且抑制新冠病毒引起的炎症因子表达。其作用机理是通过靶向抑制Lin28从而促进let-7加工成熟。通过上调let-7，C1632一方面能抑制新冠病毒结构蛋白S和M的表达；另一方面能抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达和分泌。

根据本发明提供的miRNA let-7及其激动剂、C1632都可以作为双功能靶向药物控制病毒增殖的同时抑制炎症因子风暴从而治疗新冠肺炎，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1. let-7抑制S蛋白和M蛋白表达。用于说明let-7抑制S蛋白和M蛋白表达。(A,C)生物信息学预测SARS-CoV-2上潜在的let-7作用位点；用RegRNA2软件在线预测SARS-CoV-2基因组上潜在的let-7结合位点，结果表明let-7在其S基因(A)和M基因(C)上有潜在的结合位点。(B, D)验证let-7对S和M的抑制作用；将let-7表达载体与S蛋白(B)和M蛋白(D)表达载体分别转染HEK293T细胞，转染后2天，裂解细胞进行免疫印迹分析，结果表明let-7d、7f、7e、7g、7i和miR-98能有效抑制S蛋白的表达；let-7a、7b、7c、7g、7i和miR-98能够有效抑制M蛋白的表达。其中，Tubulin作为内参以校正上样量，GFP反映转染效率。

图2. let-7抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达。用于说明let-7抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达。(A,B)检测let-7a和let-7c的过表达效率，用慢病毒载体构建过表达let-7a和let-7c的THP1细胞系，并用QRT-PCR检测过表达效率。(C) 过表达let-7和let-7c均能显著抑制THP1细胞表达IL-6和CCL2。100ng/ml PMA处理THP1细胞过夜，接着QRT-PCR检测IL-6和CCL2的mRNA水平。(D)检测let-7-5p和let-7-3p的抑制效率。用表达let-7-5p sponge和let-7-3p sponge的慢病毒载体构建THP1细胞系，QRT-PCR检测let-7-5p和let-7-3p的表达水平。(E) 抑制let-7-5p和let-7-3p均能显著促进正常及炎症反应中IL-6和CCL2的表达。抑制let-7-5p和let-7-3p的细胞及对照用100 ng/ml PMA诱导分化后，次日用100 ng/mlLPS刺激炎症反应12h，QRT-PCR检测IL-6和CCL2的表达水平。

图3. C1632促进let-7并抑制S和M蛋白表达。(A)C1632能促进HEK293T细胞表达let-7成熟体，其中左边为let-7-5p成熟体的表达水平，右边为let-7-3p成熟体的表达水平。(B, C) C1632能显著抑制HEK293T细胞中外源表达SARS-CoV-2的S和M蛋白。

图4. C1632促进let-7并抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达。用于说明C1632促进let-7并抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达。(A,C) C1632处理能增加A549(A)和Huh-7(C)细胞中let-7的表达水平。 (B,D) C1632处理能减少A549 (B)和Huh-7 (D)细胞中IL-6和CCL2的表达水平。(E) C1632能刺激THP1衍生的巨噬细胞表达let-7。THP1用PMA刺激分化后，用240μM的C1632处理2天，QRT-PCR检测let-7成熟体的表达水平；(F) C1632能抑制THP1细胞炎症反应中IL-6和CCL2的mRNA水平。THP1分化为巨噬细胞后用240μM的C1632处理2天，接着QRT-PCR检测IL-6和CCL2的表达水平；(G) C1632能抑制LPS刺激的THP1细胞IL-6的蛋白表达。THP1分化为巨噬细胞后用240μM的C1632处理2天，接着用LPS刺激细胞炎症反应，ELISA检测细胞培养上清中IL-6的含量；(H) C1632能刺激PBMC细胞表达let-7。C1632处理PBMC细胞1天后，加LPS刺激，随后用QRT-PCR检测let-7表达水平； (I) C1632能抑制PBMC细胞炎症反应中IL-6和CCL2的mRNA水平。C1632处理PBMC细胞1天后，加LPS刺激，随后用QRT-PCR检测IL-6和CCL2的表达水平。

图5. C1632抑制SARS-CoV-2复制及其引起的炎症反应。用于说明C1632能抑制SARS-CoV-2增殖及病毒引发的IL-6和CCL2表达。(A,B) C1632抑制SARS-CoV-2在Huh-7细胞中增殖。C1632处理Huh-7细胞后接种SARS-CoV-2，随后QRT-PCR检测病毒N基因(A)和ORF1基因(B)的表达水平。(C)C1632抑制SARS-CoV-2感染的Huh-7细胞表达S蛋白和N蛋白。(D,E)C1632抑制SARS-CoV-2感染的Huh-7细胞表达IL-6和CCL2。

图6 pll3.7-mU6-miRNA载体图谱。

图7 pcDNA6B-FLAG载体图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。

实验材料：

人类肝癌细胞株Huh-7、人白血病细胞株THP1、人胚肾上皮细胞HEK293T、肺腺癌细胞株A549，均购自中国典型物种保藏中心（CTCC）。

PBMC细胞购自雷德贝尔。

[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物C1632由本实验室合成，其结构式如式（I）所示：

（I）。

合成路径如下所示：

C1632为已知的小分子药物，能溶于水或者DMSO，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。

miRNA表达载体由中山大学蒋嵩山老师实验室提供。

从人基因组DNA中扩增如下let-7a和let-7c序列，连接到pll3.7-mU6-miRNA载体的XhoI和BamHI之间，pll3.7-mU6-miRNA载体的图谱如附图6所示。

let-7a：ttcaacgtaagtgaatgaaaatggtctaatactatttttcttatcactcacacaggaaaccaggattaccgaggaggaaaaaaagccttcctgtggtgctcaactgtgattccttttcaccattcaccctggatgttctcttcactgtgggatgaggtagtaggttgtatagttttagggtcacacccaccactgggagataactatacaatctactgtctttcctaacgtgatagaaaagtctgcatccaggcggtctgatagaaagtcagttaactaattgtacaatatttaagattaacttgtcttaaagagatgtagtgcagcatttgtttatggcctggaaata（SEQ ID NO.1）。

let-7c：tgagaaacagttagcagcaaagtttactggtaaaatgttagaatattatatctatatccttgccaagcccttaggtgtatggctgccatatttggaggagctgactgaagatatgataaggagtttgaagcaacattggaagctgtgtgcatccgggttgaggtagtaggttgtatggtttagagttacaccctgggagttaactgtacaaccttctagctttccttggagcacacttgagccgtcgaggaattcttcatcactttaacctgattgagccaatttgtgtgcaagaaggtaatgtgtcatgagtatcttggatcattgatttgggcctttattacattaaaatgatcatttcagccctattagattattcca（SEQ ID NO.2）。

M基因表达载体：合成M基因DNA，并以EcoRI和XhoI连接到商业化载体pcDNA6B-FLAG中，pcDNA6B-FLAG载体图谱如附图7所示，商业化载体pcDNA6B-FLAG由山东大学王培会老师实验室提供。

M基因：ATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAAGAGCTTAAAAAGCTCCTTGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTTACATGGATTTGTCTTCTACAATTTGCCTATGCCAACAGGAATAGGTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTTCCTCTGGCTGTTATGGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTTTACAGAATAAATTGGATCACCGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTGGTCATTCAATCCAGAAACTAACATTCTTCTCAACGTGCCACTCCATGGCACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAACTCGTAATCGGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGCTGGACACCATCTAGGACGCTGTGACATCAAGGACCTGCCTAAAGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGCTGCATACAGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAACACAGACCATTCCAGTAGCAGTGACAATATTGCTTTGCTTGTACAG（SEQID NO.3）。

S基因表达载体pcDNA3.1-S-3×flag：合成S-3×flag基因，以NheI和XhoI克隆到商业化的pcDNA3.1载体中。pcDNA3.1载体购自淼灵菌种保藏中心。

S-3×flag的序列：ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA（SEQ ID NO.4）。

let-7-5p和let-7-3p sponge载体：合成sponge序列，并以NotI和XbaI克隆到商业化载体pLVX-AcGFP中。pLVX-AcGFP由本实验室构建并保藏。

let-7-3p sponge：tttGGAAAGCTAGGAGCTGTACAGGCGGtttCCtGCGAAAGACAGTAGTTGTATAGCgGGGGAAGGCAGAGGTTGTATAGGCtgttGGgGGAAAGCTAGAGGTTGTACAGCGCttttAGAAAGGCAGCAGTCGTATAGgACATTGGAAAGCTAGGGGCCGTATAGGAttTCCGGGAAGGCAATGATTGTATAGTcaaaaaGGGGAAAGACAGTGACTGTATAGAACGgacGCAAGGCAGTGCCTGTACAGGAttTCCAGCAAGGCAGTACTTGCGCAGTcaaaaaGGGGGAAAGTAGTAGTTGTATAGtttGGAAAGCTAGGctGCTGTACAGGCGGtttCCtGCGAAAGACAGagATTGTATAGCgGGGGAAGGCAGTtaGTTGTATAGGCtgttGGgGGAAAGCTAGgAGGTTGTACAGCGCttttAGAAAGGCAGCcGGTCGTATAGgACATTGGAAAGCTAGGctGCCGTATAGGAttTCCGGGAAGGCAATccATTGTATAGTcaaaaaGGGGAAAGACAGccGACTGTATAGAACGgacGCAAGGCAGgtGCCTGTACAGGAttTCCAGCAAGGCAGggGCTTGCGCAGTcaaaaaGGGGGAAAGTAGccAAGTTGTATAG（SEQ ID NO.5）。

let-7-5p sponge：tttAACTATACAATGACTACCTCAGCGGtttCCtGCAACTATACAAGGACTACCTCACgGAACTATACGATGACTACCTCAGCtgttGGgaaCaATACAAGGACTACCTCaCGCttttcgCAgCAcACAAGGACTACCTCagACATTaaCTgTACAAGGACTACCTCaGAttTCCaaCTATACAAcGACTACCTCaTcaaaaaGGaaCTATgCAATGACTACCTCaAACGgac（SEQ ID NO.6）。

S和N蛋白抗体购自北京义翘神州。

鼠抗β-actin和Tubulin抗体购自santa公司。

HRP标记的羊抗小鼠和羊抗兔购自联科生物。

实施例1 let-7 对SARS-CoV-2的抑制作用

发明人团队通过生物信息学预测SARS-CoV-2上潜在的miRNA作用位点，筛选出目标miRNA后，通过免疫印迹验证目标miRNA对SARS-CoV-2的作用。

生物信息学预测miRNA和靶基因相互作用：从NCBI上下载SARS-CoV-2基因组序列，采用RegRNA软件在线预测在SARS-CoV-2上潜在的miRNA作用位点。结果表明let-7在SARS-CoV-2生物S基因和M基因上有潜在的结合位点。

验证miRNA与靶基因的相互作用：将S或M蛋白表达质粒与miRNA表达质粒共转HEK293T细胞，转染后48h，裂解细胞进行western blot分析蛋白表达水平。

免疫印迹：细胞用含SDS和巯基乙醇的裂解液裂解后，煮沸10min。用8~12%的SDS-PAGE胶进行电泳，每个泳道上样10μg蛋白。电泳结束后，250mM，90min转印到PVDF膜上；1%BSA封闭1h后，加一抗4℃过夜；次日，用TBST洗膜3遍每次5min；再加入HRP标记的二抗室温孵浴1h，然后再用TBST洗膜3遍，每次5min；用ECL化学发光检测。Flag抗体购自sigma公司按1:5000稀释后使用，S和N蛋白抗体购自北京义翘神州按1:1000稀释后使用；β-actin和Tubulin购自santa公司，按1:5000稀释；HRP标记的羊抗小鼠和羊抗兔购自联科生物，按1:5000稀释使用。

结果如图1所示，通过生物信息学分析发明人发现let-7在SARS-CoV-2的S基因（图1中A）和M基因（图1中C）上具有潜在的结合位点。免疫印迹实验（图1中B、D）表明，let-7d、7f、7e、7g、7i和miR-98能有效抑制外源S蛋白在HEK293T细胞中的表达；而let-7a、7b、7c、7g、7i和miR-98能够有效抑制外源M蛋白在HEK293T细胞中的表达。

以往的研究表明let-7能抑制细胞因子IL-6表达，为了验证这一结果并且探究let-7是否也能调控肺纤维化关键因子CCL2的表达，发明人用慢病毒载体构建了过表达let-7a和let-7c的THP1细胞系，并通过QRT-PCR检测了上述THP1衍生的巨噬细胞IL-6和CCL2基因的mRNA水平。

慢病毒构建稳定细胞系：用pspax2和pMD2.G作为包装载体在lentix-293细胞中包装过表达或者敲低let-7的慢病毒。5×105个THP1细胞加终浓度为10ng/ml的polybrene处理，接着感染相应慢病毒，2天后加入终浓度为1μg/ml的嘌呤霉素筛选得到阳性细胞。

检测基因过表达或敲低对THP1炎症因子表达的影响：过表达或者敲低目的基因的THP1细胞以5×105每孔种12孔板，每孔1ml PRMI1640完全培养基，种板同时加入终浓度为100 ng/μl的PMA诱导细胞分化。次日，将培养基更换为新鲜培养基继续培养2天。加入终浓度为100ng/ml的LPS或50 ng/ml的TNFα刺激8~12 h，收集细胞培养上清进行ELISA分析，细胞用Trizol裂解提取RNA进行QRT-PCR分析，结果见附图2。

结果表明：所构建的过表达载体可以稳定表达let-7a和let-7c（图2中A、B）。过表达let-7a和let-7c均能显著降低细胞中CCL2的表达水平（图2中C）。进一步，发明人利用sponge载体分别敲低THP1细胞中的let-7-5p和let-7-3p（图2中D），无论是否存在LPS刺激THP1细胞炎症，抑制let-7-5都能有效促进IL-6的表达，而抑制let-7-3p都能有效抑制CCL2表达。在LPS刺激的情况下抑制let-7-5p也有促进CCL2表达的作用。

以上结果说明let-7能抑制SARS-CoV-2的S蛋白和M蛋白表达，从而抑制SARS-CoV-2病毒增殖。此外，let-7还能抑制炎症因子IL-6和CCL2的表达，对新冠病毒感染人体后，主要刺激的IL-6和CCL2炎症因子的表达和分泌也有抑制作用，可以作为双功能靶向药物控制病毒增殖同时由新冠肺炎引起的抑制炎症因子风暴，此外，let-7本身也可以作为抑制新冠肺炎的作用靶点。

实施例2 C1632对SARS-CoV-2的抑制作用

C1632是一种let-7激动剂，为了确定C1632是否能通过调控细胞let-7表达水平从而抑制SARS-CoV-2表达S和M蛋白，发明人用C1632处理细胞2天后，QRT-PCR检测let-7的表达水平。

结果如图3所示。结果表明C1632处理使得HEK293T细胞中的let-7a-5p，let-7d-5p，let-7e-5p，let-7a-3p，let-7b-3p，let-7e-3p，let-7f-1，let-7f-2，let-7g，let-7i和miR-98显著上调（图3中A）。免疫印迹表明C1632能显著抑制HEK293T细胞中外源S蛋白（图3中B）和M蛋白（图3中C）的表达。

为了探索let-7激动剂C1632是否也具有炎症因子调节功能，检测C1632对HEK293T、A549、Huh-7中let-7和炎症因子表达水平的影响：细胞以2×106/孔，铺6孔板，每孔2ml DMEM完全培养基，次日加240μM C1632处理48h，用Trizol裂解细胞提取RNA，进行QRT-PCR分析。结果见图4中A至D。

结果显示，用C1632处理A549（图4中A）和Huh-7（图4中C）后let-7显著上调，同时C1632处理也能显著下调A549（图4中B）和Huh-7（图4中D）细胞中IL-6和CCL2的mRNA水平。

除了上皮细胞肿瘤外，发明人还检测了C1632对人免疫细胞肿瘤THP1、原代人外周血单个核细胞PBMC中C1632对let-7以及炎症因子的影响。

C1632处理THP1细胞：THP1细胞按5×105每孔种12孔板，每孔1ml PRMI1640完全培养基，种板同时加入终浓度为100 ng/μl的PMA诱导细胞分化。次日，将培养基更换为新鲜培养基并加入C1632处理2天。加入终浓度为100 ng/ml的LPS或TNFα刺激8~12 h，收集细胞培养上清进行ELISA分析，细胞用Trizol裂解提取RNA进行QRT-PCR分析。

C1632处理PBMC细胞：PBMC细胞用C1632处理1天后，加终浓度为100ng/μl的LPS或者TNF-α刺激8~12h，离心取上清进行ELISA分析，细胞用Trizol裂解后提RNA进行QRT-PCR分析。

结果显示，除了上皮细胞肿瘤外，C1632还能刺激人免疫细胞肿瘤THP1中let-7的表达水平（图4中E），并抑制LPS和TNFα诱导的炎症反应中IL-6和CCL2的增加（图4中F），C1632还能极显著的抑制THP1炎症反应中IL-6蛋白分泌水平的增加（图4中G）。在原代人外周血单个核细胞PBMC中C1632也能显著let-7水平，尤其在LPS刺激的炎症反应中这种上调更为显著（图4中H），同时C1632还能PBMC细胞在炎症反应中上调IL-6和CCL2的mRNA。

为了进一步明确C1632对新冠病毒及其引发的炎症反应是否具有抑制作用。发明人用不同浓度的C1632处理Huh-7细胞再接种SARS-CoV-2，2天后QRT-PCR用于检测细胞中的病毒含量。

C1632抑制SARS-CoV-2增殖和IL-6、CCL2表达：Huh-7种板后24h，按0.1MOI加入SARS-CoV-2和C1632，48h后用Trizol裂解细胞，提取RNA进行QRT-PCR分析。病毒培养实验在P3实验室完成。

结果表明：不同浓度的C1632处理Huh-7细胞再接种SARS-CoV-2，2天后QRT-PCR检测细胞中的病毒含量（图5中A、B），可以看出随着C1632浓度增加，细胞中的病毒载量逐渐降低。免疫印迹显示随C1632的加入S蛋白的表达水平开始降低，当C1632浓度达到240μM的时候N蛋白的表达水平也显著降低（图5中C），这很好的佐证了C1632对SARS-CoV-2的抑制作用。同时发明人还发现C1632也能显著降低SARS-CoV-2感染的细胞中炎症因子IL-6和CCL2的水平（图5中D、E）。

综合以上结果可见，化合物C1632能有效抑制新冠病毒增殖同时抑制IL-6和CCL2表达，可作为抗新冠肺炎的双功能靶向药物，控制病毒增殖同时由新冠肺炎引起的抑制炎症因子风暴。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗新冠病毒药物中的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 349

<212> DNA

<213> let-7a

<400> 1

ttcaacgtaa gtgaatgaaa atggtctaat actatttttc ttatcactca cacaggaaac 60

caggattacc gaggaggaaa aaaagccttc ctgtggtgct caactgtgat tccttttcac 120

cattcaccct ggatgttctc ttcactgtgg gatgaggtag taggttgtat agttttaggg 180

tcacacccac cactgggaga taactataca atctactgtc tttcctaacg tgatagaaaa 240

gtctgcatcc aggcggtctg atagaaagtc agttaactaa ttgtacaata tttaagatta 300

acttgtctta aagagatgta gtgcagcatt tgtttatggc ctggaaata 349

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> let-7c

<400> 2

tgagaaacag ttagcagcaa agtttactgg taaaatgtta gaatattata tctatatcct 60

tgccaagccc ttaggtgtat ggctgccata tttggaggag ctgactgaag atatgataag 120

gagtttgaag caacattgga agctgtgtgc atccgggttg aggtagtagg ttgtatggtt 180

tagagttaca ccctgggagt taactgtaca accttctagc tttccttgga gcacacttga 240

gccgtcgagg aattcttcat cactttaacc tgattgagcc aatttgtgtg caagaaggta 300

atgtgtcatg agtatcttgg atcattgatt tgggccttta ttacattaaa atgatcattt 360

cagccctatt agattattcc a 381

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> M基因

<400> 3

atggcagatt ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg 60

aacctagtaa taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc 120

aacaggaata ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta 180

actttagctt gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt 240

gctatcgcaa tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc 300

agactgtttg cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc 360

aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc 420

ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac 480

atcaaggacc tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa 540

ttgggagctt cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg 600

attggcaact ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt 660

gtacag 666

<210> 4

<211> 3819

<212> DNA

<213> S基因-3×flag

<400> 4

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacaca 3819

<210> 5

<211> 627

<212> DNA

<213> let-7-3p sponge

<400> 5

tttggaaagc taggagctgt acaggcggtt tcctgcgaaa gacagtagtt gtatagcggg 60

ggaaggcaga ggttgtatag gctgttgggg gaaagctaga ggttgtacag cgcttttaga 120

aaggcagcag tcgtatagga cattggaaag ctaggggccg tataggattt ccgggaaggc 180

aatgattgta tagtcaaaaa ggggaaagac agtgactgta tagaacggac gcaaggcagt 240

gcctgtacag gatttccagc aaggcagtac ttgcgcagtc aaaaaggggg aaagtagtag 300

ttgtatagtt tggaaagcta ggctgctgta caggcggttt cctgcgaaag acagagattg 360

tatagcgggg gaaggcagtt agttgtatag gctgttgggg gaaagctagg aggttgtaca 420

gcgcttttag aaaggcagcc ggtcgtatag gacattggaa agctaggctg ccgtatagga 480

tttccgggaa ggcaatccat tgtatagtca aaaaggggaa agacagccga ctgtatagaa 540

cggacgcaag gcaggtgcct gtacaggatt tccagcaagg caggggcttg cgcagtcaaa 600

aagggggaaa gtagccaagt tgtatag 627

<210> 6

<211> 233

<212> DNA

<213> let-7-5p sponge

<400> 6

tttaactata caatgactac ctcagcggtt tcctgcaact atacaaggac tacctcacgg 60

aactatacga tgactacctc agctgttggg aacaatacaa ggactacctc acgcttttcg 120

cagcacacaa ggactacctc agacattaac tgtacaagga ctacctcaga tttccaacta 180

tacaacgact acctcatcaa aaaggaacta tgcaatgact acctcaaacg gac 233

Claims

1.[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（I）。

2.[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2增殖药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（I）。