CN112740038A - 脂质囊泡包覆的磁性微珠及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脂质囊泡包覆的磁性微珠及其制作和使用方法。

Description

脂质囊泡包覆的磁性微珠及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月3日提交的申请号为16/054,091美国专利申请的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及分子生物学和靶细胞纯化领域。
背景技术
在所有与癌症相关的死亡中，90％以上都是由转移引起，所述转移是一种多步过程，癌症细胞通过这一过程从一个部位迁移到另一个通常较远的部位。在转移过程中，癌症细胞的运动性增强并进入淋巴系统和血流。最近的研究表明，可以在血液样品中检测到循环肿瘤细胞。虽然对甚至更少数量的循环肿瘤细胞的检测努力已增加，但是捕获和分离活的循环肿瘤细胞仍然具有挑战性。
发明内容
不希望受任何理论的束缚，本发明基于以下发现：本文提供的脂质包覆的磁性微珠可以例如在维持靶细胞(例如，癌细胞或本文描述的其他类型靶细胞中的任一种)的活力的同时，提供对所需靶细胞的高效捕获。
本文提供了组合物，所述组合物包含：(i)磁性微珠，具有附着在其外表面的多个第一结合配偶体；(ii)多个脂质囊泡，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体；(iii)多个第二结合配偶体；和(iv)多个药剂，其特异性结合至靶细胞，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体；其中：所述多个第二结合配偶体中的每一个能够特异性结合至一个或多个第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体。
在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡是抗污脂质囊泡。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述抗污脂质囊泡包含两性离子脂质分子。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述抗污脂质囊泡包括聚电解质多层膜(PEM)或聚合物刷。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述PEM包含多聚左旋赖氨酸、多聚左旋谷胺酸和多聚左旋天冬氨酸中的一种或多种。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述聚合物刷包含[2-丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)和2-羧乙基-丙烯酸酯(CAA)。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述囊泡包含1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)，并且生物素为所述第一结合配偶体。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡包含比例为85:15的POPC和b-PE。图5示出了1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)的化学结构。
在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述磁性微珠具有共价附着于其外表面的所述多个第一结合配偶体。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述磁性微珠具有非共价附着于其外表面的所述多个第一结合配偶体。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含共价附着的第一结合配偶体。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含非共价附着的第一结合配偶体。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述第一结合配偶体包含生物素或其衍生物。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述第二结合配偶体包含亲和素(avidin)或其衍生物。
在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是抗体或其抗原结合片段。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述靶细胞是癌细胞，并且特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是特异性结合至癌抗原的抗体或其抗原结合片段。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述癌抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述第一结合配偶体以小于等于10-7M的解离常数(KD)结合至所述第二结合配偶体。在本文提供的任一种组合物的一些实施例中，所述第一结合配偶体以小于等于10-9M的解离常数(KD)结合至所述第二结合配偶体。
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含本文提供的任一种组合物。
本文还提供了从生物样品中分离靶细胞的方法，所述方法包括：(a)使包含靶细胞和非靶细胞的生物样品与本文提供的任一种组合物接触；(b)在(a)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合以形成复合物、以及(ii)特异性结合至所述靶细胞的所述药剂和所述复合物之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在(b)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合、以及(ii)所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的所述药剂之间缔合的条件下，向所述磁性微珠施加磁力，从而分离所述靶细胞。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述分离的靶细胞是活的。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述靶细胞是循环肿瘤细胞或循环肿瘤干细胞。本文提供的任一种方法的一些实施例进一步包括：(d)在允许所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的药剂之间解缔合的条件下，使所述磁性微珠与洗脱缓冲液接触，从而从所述磁性微珠中释放所述靶细胞。
在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述生物样品包含血液。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述生物样品从已被诊断为患有癌症的受试者中获得。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述生物样品从被怀疑患有癌症的受试者中获得。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水和牛血清白蛋白。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述洗涤缓冲液包含1％w/v牛血清白蛋白。
本文提供的任一种方法的一些实施例进一步包括：(d)从步骤(c)中的所述富集的靶细胞中提取核酸。本文提供的任一种方法的一些实施例进一步包括：(e)对步骤(d)中从所述富集的靶细胞中提取的所述核酸进行基因分型处理。本文提供的任一种方法的一些实施例进一步包括：(f)基于步骤(e)中从所述富集的靶细胞中提取的所述核酸的所述基因分型，选择用于受试者的药物治疗或向受试者给予药物治疗。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述富集的分离的靶细胞是活的。
本文还提供了生成具有多个囊泡附着其外表面的磁性微珠的方法，所述方法包括：(a)向组合物施加磁场，所述组合物包含：(i)磁性微珠，具有多个第一结合配偶体附着至其外表面；(ii)多个脂质囊泡，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体；(iii)多个第二结合配偶体；和(iv)多个药剂，其特异性结合至靶细胞，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体，其中：所述多个第二结合配偶体的每一个能够特异性结合至一个或多个第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体，其中，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下施加所述磁场；(b)在步骤(a)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在步骤(b)之后，在允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用包含1％和10％之间的牛血清白蛋白的水溶液再悬浮所述洗涤后的磁性微珠，从而生成具有多个脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠。
本文还提供了生成具有附着于其外表面的多个脂质囊泡的磁性微珠的方法，所述方法包括：(a)孵育：(i)具有多个第一结合配偶体附着至其外表面上的磁性微珠、(ii)在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体的多个脂质囊泡、和(iii)多个第二结合配偶体，其中：所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的一子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，所述孵育在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下进行；(b)在(a)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在(b)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，使所述磁性微珠与特异性结合至靶细胞的多个药剂接触，从而生成具有多个脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体。
在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述脂质囊泡是抗污脂质囊泡。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述脂质囊泡包含两性离子脂质分子。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述脂质囊泡包括聚电解质多层膜(PEM)或聚合物刷。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述PEM包含多聚左旋赖氨酸、多聚左旋谷胺酸和多聚左旋天冬氨酸中的一种或多种。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述聚合物刷包含[2-丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)和2-羧乙基-丙烯酸酯(CAA)。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述脂质囊泡包含1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)，并且生物素为所述第一结合配偶体。
在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述脂质囊泡包含摩尔比为85:15的POPC和b-PE。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述磁性微珠具有所述多个第一结合配偶体附着至其外表面。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述磁性微珠具有所述多个第一结合配偶体非共价附着至其外表面。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含共价附着的第一结合配偶体。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含非共价附着的第一结合配偶体。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述第一结合配偶体包含生物素或其衍生物。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述第二结合配偶体包含亲和素或其衍生物。
在本文提供的任一种方法的一些实施例中，特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是抗体或其抗原结合片段。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述靶细胞是癌细胞，并且特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是特异性结合至癌抗原的抗体或其抗原结合片段。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述癌抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述第一结合配偶体以小于等于10-7M的解离常数(KD)结合至所述第二结合配偶体。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述第一结合配偶体以小于等于10-9M的解离常数(KD)结合至所述第二结合配偶体。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水和牛血清白蛋白。在本文提供的任一种方法的一些实施例中，所述洗涤缓冲液包含1％w/v牛血清白蛋白。
本文还提供了通过本文提供的任一种方法产生的具有多个脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠。
如本文所用，术语“抗污脂质囊泡”意指包含抗污脂质的脂质囊泡。在一些实施例中，抗污脂质囊泡可以包含1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)脂质。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用其他合适的已知方法和材料。这些材料、方法和示例仅为说明性的，而非限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及其他参考文献均通过引用以其整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
通过以下具体实施方式和附图并通过权利要求，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1是本文描述的组合物和方法的示例性实施例的示意性图示。
图2是本文提供的方法的示例性实施例的示意性图示。
图3是示出了从包含白血球(WBC)的样品中回收示例性靶细胞的总体回收率(％)的图。
图4是使用(1)常规2D芯片靶细胞分离法或(2)本文提供的方法的示例性实施例(例如，高通量3D平台)得到的靶细胞回收率和靶细胞纯度的对照表。
图5是1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)的化学结构。
具体实施方式
本文描述的组合物、试剂盒、以及方法可以用于从生物样品(例如，包含血液、血清、或血浆的生物样品)中捕获、分离、或富集特异性和/或稀有靶细胞(例如，本文描述的示例性靶细胞)群，之后可选择对其进行培养和/或用于进一步的分析(例如，基因分型或DNA测序)。
本文提供了组合物，所述组合物包含：(i)磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性磁性微珠)，具有多个第一结合配偶体(例如，本文描述的任一种示例性第一结合配偶体)附着至其外表面；(ii)多个抗污脂质囊泡(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性脂质囊泡)，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体；(iii)多个第二结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第二结合配偶体)；和(iv)多个药剂(例如，本文描述的特异性结合至靶细胞的任一种示例性药剂)，其特异性结合至靶细胞，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体；其中：所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至至少两种不同的第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述抗污脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；并且所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述抗污脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)共价附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体。
本文还提供了从生物样品中分离靶细胞的方法，所述方法包括：(a)使包含靶细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性靶细胞)和非靶细胞的生物样品(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性生物样品)与本文提供的任一种组合物接触；(b)在(a)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合以及(ii)所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的所述药剂之间缔合、以及足以基本上不允许所述非靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的所述药剂之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在(b)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合、以及(ii)所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的所述药剂之间缔合的条件下，施加磁力以分离所述磁性微珠，从而分离所述靶细胞。
所述方法提供了细胞群的分离，所述细胞群比90％、92％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％的靶细胞(例如，活的靶细胞)大。
所述方法提供了来自生物样品的靶细胞群的分离，其中靶细胞至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％是活的。
本文还提供了生成具有多个抗污脂质囊泡(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性抗污脂质囊泡)附着至其外表面的磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性磁性微珠)的方法，所述方法包括：(a)向组合物施加磁场，所述组合物包含：(i)磁性微珠，具有多个第一结合配偶体(例如，本文描述的的任一种示例性第一结合配偶体)附着至其外表面；(ii)多个抗污脂质囊泡，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体；(iii)多个第二结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第二结合配偶体)；和(iv)多个药剂(例如，本文描述的任一种示例性药剂)，其特异性结合至靶细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性靶细胞)，其中每种药剂包含附着的第一结合配偶体，其中：所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个(例如，两个或更多个)不同的第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)共价或非共价附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述抗污脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述抗污脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体，其中，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下施加所述磁场；(b)在步骤(a)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在步骤(b)之后，在允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用水溶液(例如，包含1％和10％之间的牛血清白蛋白的水溶液)再悬浮所述洗涤后的磁性微珠，从而生成具有多个抗污脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠。
本文还提供了生成具有多个抗污脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠的方法，所述方法包括：(a)孵育：(i)具有多个第一结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第一结合配偶体)附着至其外表面上的磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性磁性微珠)、(ii)在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体的多个抗污脂质囊泡(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性抗污脂质囊泡)、和(iii)多个第二结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第二结合配偶体)，其中：所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个(例如，两个或更多个)不同的第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的子集特异性结合至(i)共价或非共价附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述抗污脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，所述孵育在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下进行；(b)在步骤(a)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；(c)在(b)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，使所述磁性微珠与特异性结合至靶细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性靶细胞)的多个药剂(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性药剂)接触，从而生成使多个抗污脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠，其中每种药剂包含附着的第一结合配偶体。
以下描述的这些方法的非限制性方面，这些方面可以不受限制地以任何组合的形式使用。这些方法的其他方面在本领域中是已知的。
组合物
本文提供了组合物，所述组合物包含：(i)磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性磁性微珠)，具有多个第一结合配偶体(例如，本文描述的任一种示例性第一结合配偶体)附着至其外表面；(ii)多个脂质囊泡(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性脂质囊泡)，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体；(iii)多个第二结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第二结合配偶体)；和(iv)多个药剂(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性药剂)，其特异性结合至靶细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性靶细胞)，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体；其中：每个所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个(例如，两个或更多个)(例如，一、二、三、四、或五个)不同的第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)共价或非共价附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；并且所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述抗污脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)共价附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体。
在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡是抗污脂质囊泡。在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡包含两性离子脂质分子。在这些组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡包括聚电解质多层膜(PEM)或聚合物刷。在这些组合物的一些实施例中，所述PEM包含多聚左旋赖氨酸、多聚左旋谷胺酸和多聚左旋天冬氨酸中的一种或多种。在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述聚合物刷包含[2-丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)和2-羧乙基-丙烯酸酯(CAA)。本文描述了脂质囊泡的其他方面和示例。本文还描述了磁性微珠的非限制性的示例性方面。
本文还描述了第一和第二结合配偶体以及特异性结合至靶细胞的药剂的非限制性的示例性方面。
在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述组合物可以置于多孔板(例如，96孔板)中。在一些实施例中，本文提供的组合物可以附着至固体表面(例如，薄膜、芯片、或微流通道)。
在这些组合物的一些实施例中，所述磁性微珠具有所述多个第一结合配偶体共价附着至其外表面。在这些组合物的一些实施例中，所述磁性微珠具有所述多个第一结合配偶体非共价附着至其外表面。在这些组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含共价附着的第一结合配偶体。在这些组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含非共价附着的第一结合配偶体。
在这些组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡包含1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)，并且生物素为所述第一结合配偶体且亲和素为所述第二结合配偶体。在这些组合物的一些实施例中，第一结合配偶体是亲和素并且第二结合配偶体是生物素。
磁性微珠
在本文描述的任一种组合物或方法的一些实施例中，磁性微珠具有铁磁内芯或超顺磁芯。在一些示例中，磁性微珠的芯含有金属(例如，Co、Fe、或Ni)或其氧化物。在一些示例中，磁性微珠可以包含过渡金属掺杂的氧化物和金属合金，诸如CoPt3、FeCo、和FePt。在一些示例中，磁性微珠可以包含氧化铁，诸如磁铁矿(Fe3O4)或磁赤铁矿(γ-Fe2O3)。可以使用美国专利号5,834,121、5,395,688、5,356,713、5,318,797、5,283,079,5,232,7892、5,091,206、4,965,007、4,774,265、4,770,183、4,654,267、4,554,088、4,490,436、4,336,173、和4,421,660中描述的任一种方法形成磁性微珠的芯。
在一些示例中，磁性微珠可以具有涂覆芯的表面。在一些示例中，磁性微珠可以具有涂层，所述涂层包含链烷磺酸、链烷膦酸、油酸、乳糖酸、月桂酸、藻朊酸盐、壳聚糖、葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、普鲁兰多糖和聚乙烯亚胺中的一种或多种。可用于涂覆磁性微珠芯的其他材料在本领域中是已知的。如本文所用，“涂层”可以是覆盖芯的外表面的至少90％的材料。
在一些实施例中，磁性微珠包含涂覆磁性微珠芯的聚合物。可用于涂覆磁性微珠芯的聚合物的非限制示例包括：聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚醚氨基甲酸酯、聚砜、氟化或氯化聚合物(诸如聚氯乙烯)、聚乙烯和聚丙烯、聚碳酸酯和聚酯。其他聚合物包括聚烯烃，诸如聚丁二烯、聚二氯丁二烯、聚异戊二烯、聚氯丁二烯、聚偏二氟乙烯、聚二乙烯碳酸酯和多氟乙烯。在一些示例中，可以使用共聚物涂覆磁性微珠的芯。共聚物的非限制性示例包括苯乙烯/丁二烯、α二甲基苯乙烯/二甲基硅氧烷、以及其他聚硅氧烷(例如，聚二甲基硅氧烷、聚苯甲基硅氧烷和聚三氟丙基甲基硅氧烷)。在一些示例中，磁性微珠的芯涂覆有聚丙烯腈或含有丙烯腈的聚合物(例如，聚α甲丙烯腈共聚物、醇酸或萜类树脂和聚烯烃基多磺酸盐)。
在本文描述的任一种组合物或方法的一些实施例中，磁性微珠的平均直径为约1μm至约140μm(例如，约1μm至约120μm、约1μm至约100μm、约1μm至约80μm、约1μm至约60μm、约1μm至约40μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1μm至约5μm、约5μm至约140μm、约5μm至约120μm、约5μm至约100μm、约5μm至约50μm、约5μm至约25μm、约5μm至约15μm、约5μm至约10μm、约10μm至约140μm、约10μm至约120μm、约10μm至约100μm、约10μm至约50μm、约10μm至约25μm、约10μm至约20μm、约20μm至约140μm、约20μm至约120μm、约20μm至约100μm、约20μm至约50μm、约20μm至约40μm、约20μm至约30μm、约50μm至约140μm、约50μm至约120μm、约50μm至约100μm、约50μm至约75μm、约60μm至约140μm、约60μm至约120μm、约60μm至约100μm、约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约30μm、约40μm、约60μm、约80μm、约100μm、约120μm、或约140μm)。
在一些示例中，磁性微珠可以具有球形形状或椭圆形形状。在一些示例中，磁性微珠可以具有二十面体形状、十二面体形状、八面体形状、半球形形状、长方体形状、六角棱镜形状、或圆环形状。在一些示例中，磁性微珠的外表面可以是光滑的。在一些示例中，磁性微珠的外表面具有一个或多个凹槽。在一些实施例中，磁性微珠的外表面是点状(stipled)表面。
在一些实施例中，本文描述的任一种组合物或方法中的磁性微珠群可以是具有不同特性(例如，不同直径、不同形状、和/或不同组成)的磁性微珠的混合物。在一些实施例中，本文描述的任一种组合物或方法中的磁性微珠群可以是具有基本上相同的特性(例如，大约相同的直径、大约相同的形状、和/或大约相同的组成)的均质磁性微珠群。
各种磁性微珠可在市场上购买并且在本领域中是已知的，而且可以在本文描述的任一种组合物和/或方法中使用。磁性微珠具有多个第一结合配偶体(例如，本文描述的任一种第一结合配偶体)附着到其外表面上(例如，通过共价或非共价附着)。在一些实施例中，在第一结合配偶体共价附着到磁性微珠的外表面的情况下，第一结合配偶体和磁性微珠的表面经由二硫键、酰胺键、酯键、醚键、硫酯键、磷酸酯键、磷酸二酯键、半缩醛键、和糖苷键连接。在一些实施例中，第一结合配偶体经由非共价键(例如，离子键或氢键)附着到磁性微珠的外表面。
脂质囊泡
术语“脂质囊泡”应被理解为意指包括一个或多个包围一定体积的流体的脂质层的结构。例如，脂质囊泡可以包括包围一定体积的流体的单一脂质层(单层)。在其他示例中，脂质囊泡可以包括一个或多个脂质双层，其中每个双层包括两个单层，每个单层含有取向相反的两亲性脂质分子。两亲性脂质包含共价连接至一个或两个非极性(疏水性)酰基链的极性(亲水性)头基区。疏水性酰基链和周围水性介质之间的在能量上不利的接触会引起两亲性脂质分子自行排列，使得两亲性脂质分子的极性头基朝向双层表明取向，而酰基链朝向双层内部重新取向。因此，形成了在能量上稳定的结构，其中有效地防止了酰基链与水性环境的接触。
在一些示例中，脂质囊泡具有单一双层膜(例如，单层小囊泡(SUV)或单层大囊泡(LUV))。在一些示例中，脂质囊泡具有多个双层膜(例如，多层大囊泡(MLV))。
如本文所用，术语“多个脂质囊泡”是指至少1x101、至少1x102、至少1x103、至少1x104、至少1x105、至少1x106、至少1x107、至少1x108、或至少1x109个脂质囊泡。例如，本文描述的任一种组合物可以包含多个，例如，约1x101至约1x109个脂质囊泡、约1x101至约1x108个脂质囊泡、约1x101至约1x107个脂质囊泡、约1x101至约1x106个脂质囊泡、约1x101至约1x105个脂质囊泡、约1x101至约1x104个脂质囊泡、约1x101至约1x103个脂质囊泡、约1x102至约1x109个脂质囊泡、约1x102至约1x106个脂质囊泡、或约1x103至约1x106个脂质囊泡。
在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述脂质囊泡是抗污脂质囊泡。
在本文描述的任一个实施例中，脂质囊泡的平均直径可以为约10nm至约15μm、约10nm至约10μm、约10nm至约5μm、约10nm至约1μm、约10nm至约900nm、约10nm至约800nm、约10nm至约700nm、约10nm至约600nm、约10nm至约500nm、约10nm至约450nm、约10nm至约400nm、约10nm至约350nm、约10nm至约300nm、约10nm至约250nm、约10nm至约200nm、约10nm至约150nm、约10nm至约100nm、约10nm至约50nm、约10nm至约25nm、约25nm至约15μm、约25nm至约10μm、约25nm至约5μm、约25nm至约1μm、约25nm至约900nm、约25nm至约800nm、约25nm至约700nm、约25nm至约600nm、约25nm至约500nm、约25nm至约450nm、约25nm至约400nm、约25nm至约350nm、约25nm至约300nm、约25nm至约250nm、约25nm至约200nm、约25nm至约150nm、约25nm至约100nm、约25nm至约50nm、约50nm至约15μm、约50nm至约10μm、约50nm至约5μm、约50nm至约1μm、约50nm至约900nm、约50nm至约800nm、约50nm至约700nm、约50nm至约600nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约150nm、约50nm至约100nm、约100nm至约15μm、约100nm至约10μm、约100nm至约5μm、约100nm至约1μm、约100nm至约900nm、约100nm至约800nm、约100nm至约700nm、约100nm至约600nm、约100nm至约500nm、约100nm至约450nm、约100nm至约400nm、约100nm至约350nm、约100nm至约300nm、约100nm至约250nm、约100nm至约200nm、约100nm至约150nm、约150nm至约15μm、约150nm至约10μm、约150nm至约5μm、约150nm至约1μm、约150nm至约900nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约150nm至约500nm、约150nm至约450nm、约150nm至约400nm、约150nm至约350nm、约150nm至约300nm、约150nm至约250nm、约150nm至约200nm、约200nm至约15μm、约200nm至约10μm、约200nm至约5μm、约200nm至约1μm、约200nm至约900nm、约200nm至约800nm、约200nm至约700nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、约200nm至约450nm、约200nm至约400nm、约200nm至约350nm、约200nm至约300nm、约200nm至约250nm、约250nm至约15μm、约250nm至约10μm、约250nm至约5μm、约250nm至约1μm、约250nm至约900nm、约250nm至约800nm、约250nm至约700nm、约250nm至约600nm、约250nm至约500nm、约250nm至约450nm、约250nm至约400nm、约250nm至约350nm、约250nm至约300nm、约300nm至约15μm、约300nm至约10μm、约300nm至约5μm、约300nm至约1μm、约300nm至约900nm、约300nm至约800nm、约300nm至约700nm、约300nm至约600nm、约300nm至约500nm、约300nm至约450nm、约300nm至约400nm、约300nm至约350nm、约350nm至约15μm、约350nm至约10μm、约350nm至约5μm、约350nm至约1μm、约350nm至约900nm、约350nm至约800nm、约350nm至约700nm、约350nm至约600nm、约350nm至约500nm、约350nm至约450nm、约350nm至约400nm、约400nm至约15μm、约400nm至约10μm、约400nm至约5μm、约400nm至约1μm、约400nm至约900nm、约400nm至约800nm、约400nm至约700nm、约400nm至约600nm、约400nm至约500nm、约400nm至约450nm、约450nm至约15μm、约450nm至约10μm、约450nm至约5μm、约450nm至约1μm、约450nm至约900nm、约450nm至约800nm、约450nm至约700nm、约450nm至约600nm、约450nm至约500nm、约500nm至约15μm、约500nm至约10μm、约500nm至约5μm、约500nm至约1μm、约500nm至约900nm、约500nm至约800nm、约500nm至约700nm、约500nm至约600nm、约600nm至约15μm、约600nm至约10μm、约600nm至约5μm、约600nm至约1μm、约600nm至约900nm、约600nm至约800nm、约600nm至约700nm、约700nm至约15μm、约700nm至约10μm、约700nm至约5μm、约700nm至约1μm、约700nm至约900nm、约700nm至约800nm、约800nm至约15μm、约800nm至约10μm、约800nm至约5μm、约800nm至约1μm、约800nm至约900nm、约900nm至约15μm、约900nm至约10μm、约900nm至约5μm、约900nm至约1μm、约1μm至约15μm、约1μm至约10μm、约1μm至约5um.约5μm至约15μm、约5μm至约10μm、或约10μm至约15μm。
在一些实施例中，脂质囊泡包含磷脂，诸如像1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、和磷脂酸(PA)。在一些实施例中，脂质囊泡包含，例如，POPC和b-PE。在一些实施例中，脂质囊泡包含，例如，胆固醇和胆固醇-PEG。在一些实施例中，脂质囊泡可以包含，例如，蛋白质、碳水化合物、或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，脂质囊泡包含一种或多种脂质。可以改变脂质的类型、数量和比率，只要其能够形成脂质囊泡。可以从天然来源中分离出脂质，或者除天然来源外，可以合成脂质。
在一些实施例中，至少一种(或一些)脂质是两亲性脂质，所述两亲性脂质被定义为具有亲水性部分和疏水性部分(通常为亲水性头基和疏水性尾基)。亲水性部分可以包含极性或带电荷的基团，诸如碳水化合物、磷酸盐、羧基、硫酸盐、氨基、巯氢基、硝基、羟基、以及其他类似基团。疏水性部分可以包含非极性基团，所述非极性基团包含但不限于长链饱和与不非饱和脂肪族烃基团以及被一个或多个芳族、脂环族、或杂环基团取代的基团。两亲性脂质的示例包括，但不限于，磷脂质、氨脂质、和鞘脂质。
在一些示例中，脂质囊泡包含磷脂质。磷脂质包含但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等。应当理解，脂质囊泡中可以包含其他脂质膜组分，诸如胆固醇、鞘磷脂、心磷脂等。
脂质囊泡中存在的脂质可以是阴离子型和中性(包括两性离子型和极性)脂质，包括阴离子型和中性磷脂质。中性脂质以不带电荷的或中性的两性离子的形式存在，以形成选定的pH。在生理pH的条件下，此类脂质包括，例如，二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂、和二酰基甘油。两性离子型脂质的示例包括但不限于二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、和二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)。阴离子脂质是在生理pH条件下带负电荷的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、以及结合到中性脂质的其他阴离子改性基团。
在一些示例中，脂质囊泡包含阴离子和中性脂质(又称为非阳离子脂质)。此类脂质可以含有磷，但并不限于此。非阳离子脂质的示例包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反PE、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、和胆固醇。
可以存在于脂质囊泡中的其他非含磷脂质包括十八烷基胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻酸酯、十六烷基硬脂酸脂、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂烷硫酸酯、烷芳基硫酸盐聚乙氧基化脂肪酸脂肪酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵等、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、和脑苷脂。本文描述的脂质囊泡中可以存在诸如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺之类的脂质。
非阳离子脂质还包括聚乙二醇基聚合物，诸如PEG 2000、PEG 5000、和与磷脂质或神经酰胺缀合的聚乙二醇(被称为PEG-Cer)。
在一些情况下，可以使用脂质的改性形式，包括使用诸如荧光团之类的可检出标记物改性的形式。在一些情况下，脂质是发射信号(例如，荧光信号)的脂质类似物。示例包括但不限于碘化三甲基吲哚三碳菁(DiR)和1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-三甲基吲哚二碳菁(DiD)。
在脂质囊泡的一些示例中，脂质双层的至少一种组分可以被官能化(或发生反应)，以允许第一结合配偶体进行共价附着。反应性基团的示例是马来酰亚胺基团。在存在二硫酚交联剂(诸如但不限于二硫苏糖醇(DTT))的情况下，马来酰亚胺基团可以彼此交联。官能化脂质的另一个示例是l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺，本文称之为MPB。官能化脂质的另一个示例是l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)2000](又被称为马来酰亚胺-PEG 2k-PE)。官能化脂质的另一个示例是二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)。
应当理解，本发明考虑了其他官能化脂质、其他官能化脂质双层组分、其他反应性基团、和其他交联剂的使用。除了马来酰亚胺基团，反应性基团的其他示例包括但不限于其他硫醇反应性基团、氨基基团(诸如伯胺和仲胺)、羧基基团、羟基基团、醛基基团、炔基基团、叠氮化物基团、羰基、卤代乙酰基(例如，碘乙酰基)基团、亚氨基酯基团、N-羟基丁二酰亚胺酯、巯基基团、吡啶二硫基团等。
官能化和非官能化脂质可从大量商业源获得，包括Avanti极性脂质(阿拉巴马州阿拉巴斯特)。
在一些实施例中，脂质囊泡包含两性离子脂质分子(例如，聚(羧基甜莱碱)(pCB)、聚(磺基甜菜碱)(pSB)、或pDMAEMA)。
在一些实施例中，所述脂质囊泡包括聚电解质多层膜(PEM)或聚合物刷。PEM的非限制性示例包括多聚左旋赖氨酸/多聚左旋谷胺酸(PLL/PLGA)、多聚左旋赖氨酸/多聚左旋谷胺酸。在一些实施例中，所述聚合物刷包含[2-丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)和2-羧乙基-丙烯酸酯(CAA)。在一些实施例中，所述PEM包含多聚左旋赖氨酸、多聚左旋谷胺酸和多聚左旋天冬氨酸中的一种或多种。在一些实施例中，所述脂质囊泡包括聚合物刷，所述聚合物刷包含[2-丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)和2-羧乙基-丙烯酸酯(CAA)。
在本文描述的任一种脂质囊泡(例如，抗污脂质囊泡)的一些方面，所述脂质囊泡包含l-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。在本文描述的任一种脂质囊泡(例如，抗污脂质囊泡)的一些方面，所述脂质囊泡包含1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基(b-PE)。在本文描述的任一种脂质囊泡(例如，抗污脂质囊泡)的一些方面，所述脂质囊泡包含POPC和b-PE的组合。例如，在本文描述的任一种脂质囊泡中，所述脂质囊泡可以含有比例为200:1、150:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、200:5、150:5、100:5、95:5、90:5、85:5、80:5、75:5、70:5、60:5、50:5、40:5、30:5、20:5、10:5、200:10、150:10、100:10、90:10、85:10、80:10、75:10、70:10、60:10、50:10、40:10、30:10、20:10、200:15、150:15、100:15、90:15、85:15、80:15、75:15、70:15、60:15、50:15、40:15、30:15、20:15、200:20、150:20、100:20、95:20、90:20、85:20、80:20、70:20、60:20、50:20、40:20、或30:20的POPC/b-PE。
在一些实施例中，所述脂质囊泡包含聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，PEG具有抗污特性。
在本文描述的任一种脂质囊泡(例如，抗污脂质囊泡)的一些方面，所述脂质囊泡与DynabeadTM生物素结合剂缀合。
第一和第二结合配偶体
在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述组合物可以包含多个第一组合配偶体和多个第二组合配偶体。在本文描述的任一种组合物的一些实施例中，所述多个第二结合配偶体的每一个能够特异性结合至一个或多个(例如两个或更多个)(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、或十个)第一结合配偶体(例如，能够特异性结合至相同的第一结合配偶体的一个或多个(例如，两个或更多个)分子)，其中，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)附着(共价或非共价附着)到磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性磁性微珠)的外表面上，和(ii)脂质囊泡的外表面上的第一结合配偶体；所述第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)脂质囊泡的外表面上的第一结合配偶体(例如，第一结合配偶体共价或非共价附着到脂质囊泡的外表面上)，和(ii)附着到特异性结合至靶细胞的药剂(例如，本文描述的特异性结合至靶细胞的任一种药剂)上的第一结合配偶体。
在一些实施例中，所述第一结合配偶体包含生物素或其变体。在一些实施例中，所述第一结合配偶体是链霉亲和素或其变体。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体可以互换。例如，第一结合配偶体可以是生物素或其衍生物，并且第二结合配偶体是亲和素或其衍生物。在其他示例中，第一结合配偶体可以是亲和素或其衍生物，并且第二结合配偶体是生物素。
在一些实施例中，第一结合配偶体可以包含抗原性物质(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、或核酸、或其组合)，并且第二结合配偶体可以包含特异性结合至抗原性物质的抗原结合域(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性抗原结合域)。在一些实施例中，第一结合配偶体可以包含特异性结合至抗原性物质(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、或核酸、或其组合)的抗原结合域(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性抗原结合域)，并且第二结合配偶体包含抗原性物质。
在一些实施例中，第一结合配偶体可以包含结合至特异性靶部分(specifictarget moiety)(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、或核酸、或其组合)的适配体，并且第二结合配偶体包含特异性靶部分。在一些实施例中，第一结合配偶体可以包含特异性靶部分(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、或核酸、或其组合)，并且第二结合配偶体包含结合至特异性靶部分的适配体。
第一结合配偶体和第二结合配偶体的其他示例在本领域中是已知的。
本文提供的第一结合配偶体和第二结合配偶体可以以小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M、小于10-12M、小于10-13M、小于10-14M、小于10-15M、或小于10-16M(例如，如在磷酸盐缓冲盐水中使用表面等离子体共振所确定的)的解离常数(KD)进行结合。
在一些实施例中，本文提供的第一结合配偶体和第二结合配偶体可以以约1x10-4M至约1x10-6M、约1x10-5M至约1x10-7M、约1x10-6M至约1x10-8M、约1x10-7M至约1x10-9M、约1x10-8M至约1x10-10M、约1x10-9M至约1x10-11M、约1x10-9M至约1x10-12M、约1x10-9M至约1x10-13M、约1x10-9M至约1x10-14M、约1x10-9M至约1x10-15M、约1x10-10M至约1x10-15M、约1x10-10M至约1x10-13M、约1x10-13M至约1x10-15M、或约1x10-14M至约1x10-15M(例如，如在磷酸盐缓冲盐水中使用表面等离子体共振所确定的)的KD进行结合。在一些实施例中，本文提供的第一结合配偶体和第二结合配偶体可以以约1.1nM至约500nM、或约2.0nM至约6.7nM的KD进行结合。
在这些组合物的一些实施例中，所述磁性微珠具有所述多个第一结合配偶体共价附着至其外表面(例如，使用本文描述的任一种示例性类型的共价键)。在这些组合物的一些实施例中，所述磁性微珠具有所述多个第一结合配偶体非共价附着至其外表面。
在这些组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含共价附着的第一结合配偶体(例如，使用本文描述的任一种示例性类型的共价键)。在一些实施例中，特异性结合至靶细胞的药剂包含结合至靶细胞(例如，靶细胞表面上存在的抗原)的抗原结合域。在这些组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞的所述多个种药剂各自包含非共价附着的第一结合配偶体。
特异性结合至靶细胞的药剂
本文提供了特异性结合至靶细胞的多个药剂，其中每种药剂包含附着的第一结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第一结合配偶体)。特异性结合至靶细胞的药剂的非限制性示例包括：抗体、抗原结合抗体片段、和适配体。在这些组合物的一些实施例中，特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗原结合片段”意指能够特异性结合至抗原(例如，本文描述的任一种示例性抗原)的域。例如，抗原结合域可以是例如VL域、VH域、VNAR域、或VHH域。
抗原结合域还可以是例如非抗体、支架蛋白。这些蛋白一般是通过对先前存在的抗原结合蛋白进行基于组合化学的适配获得的。例如，可以使用本文描述的系统对人转铁蛋白的用于人转铁蛋白受体的结合位点进行多样化，以创建转铁蛋白变体的多样化文库，其中一些转铁蛋白变体已获得对不同抗原的亲和力。请参见例如Ali等人,J.Biol.Chem.274:24066_24073,1999。人转铁蛋白中不参与结合受体的部分仍然不变并用作支架(如抗体的框架区)，以呈现变体结合位点。然后，按照抗体文库原样并根据本文描述的方法，针对感兴趣的靶抗原对文库进行筛选，从而鉴定出用于靶抗原的具有最佳选择性和亲和力的那些变体。请参见例如Hey等人,TRENDSBiotechnol.23(10):514-522,2005。
本领域技术人员将理解，非抗体支架蛋白的的支架部分可以包括，例如，以下全部或部分：金黄色葡萄球菌蛋白A的Z域、人转铁蛋白、人第十纤连蛋白III型域、人胰蛋白酶抑制剂kunitz域、人CTLA-4、锚重复蛋白、人脂质运载蛋白(例如，anticalins，诸如像WO2015/104406中描述的那些)、人晶状体蛋白、人泛激素、或来自大肠杆菌(E.elaterium.)的胰蛋白酶抑制剂。
在一些实施例中，抗原结合域可以是scFv、scFv-Fc、VHH域、VNAR域、(scFv)2、或BiTE。
“单链Fv”或“scFv”片段在单个多肽链中包含VH域和VL域。VH和VL一般通过肽接头连接。请参见Pluckthun,Antibodies from E.coli.,Rosenberg M.&Moore G.P(编辑),ThePharmacology of'Monoclonal Antibodies,第113卷,第269-315页,施普林格出版社,纽约,1994。在一些示例中，接头可以是单个氨基酸。在一些示例中，接头可以是化学键。“sc-Fv-Fc”片段包含附着到Fc域的scFv。例如，Fc域可以附着到scFv的末端C。Fc域可以跟随VH或VL，取决于scFv中的可变域(即，VH-VL或VL-VH)的取向。Fc域可以是本领域已知的或本文描述的使任何合适的域。在一些示例中，Fc域是IgGl Fc域。
BiTE是抗原结合域，其在单个多肽中包含两个VL和两个VH，BiTE进行组装以形成识别两个不同抗原或单一抗原上两个不同表位的两个scFv。在以下文献中描述了BiTE的非限制性方面：Baeuerle等人,Curr.Opin.Mol.Ther.11:22-30,2009；Wolf等人,DrugDiscovery Today 10:1237-1244,2005；和Huehls等人,Immunol.Cell Biol.93:290-296,2015。
VHH域是在骆驼科中发现的单个单体可变抗体域。VNAR是在软骨鱼中发现的单个单体可变抗体域。例如，在以下文献中描述了VHH域和VNAR域的非限制性方面：Van Audenhove等人,EBioMedicine,8:40-48,2016；Krah等人,Immunopharmacol.Immunotoxicol.38:21-28,2016；Cromie等人,Curr.Top.Med.Chem.15:2543-2557,2016；Kijanka等人,Nanomedicine 10:161-174,2015；Kovaleva等人,Expert.Opin.Biol.Ther.14:1527-1539,2014；De Meyer等人,Trends Biotechnol.32:263-270,2014；Mujic-Delic等人,TrendsPharmacol.Sci.35:247-255,2014；Muyldermans,Ann.Rev.Biochem.82:775-797,2013；Vincke等人,Methods Mol.Biol.911:15-26,2012；Rahbarizadeh等人,Immunol.Invest.40:299-338,2011；Van Bockstaele等人,Curr.Opin.Investig.Drugs10:1212-1224,2009；Wesolowski等人,Med.Microbiol.Immunol.198:157-174,2009；DeGenst等人,Dev.Comp.Immunol.30:187-198,2006；Muyldermans,J.Biotechnol.74:277302,2001；和Muyldermans等人,Trends Biochem.Sci.26:230-235，2001。
在一些实施例中，抗原结合域可以是抗体的抗原结合片段(例如，本文描述的抗体的任一种抗原结合片段)、DVD-Ig、和双亲和重靶向抗体(DART)、三功能抗体、具有共同LC的kih IgG、交叉单抗、正交Fab IgG、二合一IgG、IgG-ScFv、scFv2-Fc、双纳米抗体、串联抗体、DART-Fc、scFv-HAS-scFv、DNL-Fab3、DAF(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵-臼结构通用LC、杵-臼结构组装体、电荷对抗体、Fab臂交换抗体、SEED抗体、Triomab、LUZ-Y、Fcab、kλ抗体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)-IgG、IgG(L,H)-Fc、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、纳米抗体、纳米抗体HSA、双特异性抗体、TandAb、单链双特异性抗体、单链双特异性抗体-CH3、双特异性抗体-CH3、三重抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2-scFV2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、单链双特异性抗体-Fc、双特异性抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体、对接锁定双特异性抗体、ImmTAC、HSA抗体、单链双特异性抗体-HAS、串联scFv、IgG-IgG、Cov-X-抗体、和scFvl-PEG-scFv2。抗体的抗原结合片段的非限制性示例包括Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、和Fab’片段。抗体的抗原结合片段的其他示例为IgG的抗原结合片段(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的抗原结合片段)(例如，人或人源化IgG(例如，人或人源化IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4)的抗原结合片段)；IgA的抗原结合片段(例如，IgAl或IgA2的抗原结合片段)(例如，人或人源化IgA(例如，人或人源化IgAl或IgA2)的抗原结合片段)；IgD的抗原结合片段(例如，人或人源化IgD的抗原结合片段)；IgE的抗原结合片段(例如，人或人源化IgE的抗原结合片段)；或IgM的抗原结合片段(例如，人或人源化IgM的抗原结合片段)。
“Fv”片段包括一个重链可变域和一个轻链可变域的非共价连接的二聚体。
除了Fv片段的重链和轻链可变域，“Fab”片段还包括轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。
“F(ab')2”片段是指两个Fab片段通过双硫键在铰接区附近接合。
“双可变域免疫球蛋白”或“DVD-Ig”是指多价或多特异性结合蛋白，如DiGiammarino等人,Methods Mol.Biol.899:145-156,2012；Jakob等人,MABs 5:358-363,2013；和美国专利号7,612,181、8,258,268、8,586,714、8,716,450、8,722,855、8,735,546、和8,822,645中所描述的，以上每个文献均通过引用整体并入本文。
例如在Garber,Nature Reviews Drug Discovery 13:799-801,2014中描述了DART。例如在Kontermann等人,Drug Discovery Today 20:838-847,2015中描述了三功能抗体、具有共同LC的kih IgG、交叉单抗、正交Fab IgG、二合一IgG、IgG-ScFv、scFv2-Fc、双纳米抗体、串联抗体、DART-Fc、scFv-HAS-scFv、二和一DNL-Fab3。例如在Spiess等人,Mol.Immunol.67:95-106,2015中描述了DAF(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵-臼结构通用LC、杵-臼结构组装体、电荷对抗体、Fab臂交换抗体、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、kλ抗体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)-IgG、IgG(L,H)-Fc、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy抗体、DVI-IgG、纳米抗体、纳米抗体HSA、双特异性抗体、TandAb、单链双特异性抗体、单链双特异性抗体-CH3s、双特异性抗体-CH3s、三重抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFV2S、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、单链双特异性抗体-Fc、双特异性抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体、对接锁定双特异性抗体、ImmTAC、HSA抗体、scDiabody-HAS、串联scFv、IgG-IgG、Cov-X-抗体、和scFvl-PEG-scFv2。
在本文描述的组合物的一些实施例中，特异性结合至靶细胞(例如，本文描述的任一种示例性靶细胞)的多个药剂是特异性结合至癌抗原(例如，本文描述的任一种示例性癌抗原)的抗体或其抗原结合片段。在这些组合物的一些实施例中，所述癌抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。癌抗原的其他示例包括HER2、A33抗原、9-0-乙酰基-GD3、CA19-9标记物、BhCG、CA-125标记物、碳酸酐酶IX(MN/CAIX)、钙网蛋白、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD5、CD16、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40L、CD44、CD44V6、CD63、CD70、CD84、CD96、CD100、CC123、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152(CTLA-4)、CD160、CRTAM、CS1(CD319)、DNAM-1(CD226)、CD229、CD244、CD272(BTLA)、CD274(PDL-1、B7H1)、CD279(PD-1)、CD319、CD352、CRTAM(CD355)、CD358、DR3、GITR(TNFRSF 18)、HVEM、ICOS、LIGHT、LTBR、OX40、激活形式的KIR、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NTB-A、PEN-5、癌胚抗原(CEA；CD66e)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘着蛋白新表位、内皮唾酸蛋白、肝配蛋白A2(EphA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GM3、糖抗原、糖蛋白100、HER2/neu、HER3、HER4、胰岛素样生长因子受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑色素瘤特异性硫酸软骨素蛋白多糖(MCSCP)、间皮素、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、缪勒抑制物质(MIS)受体II型、血浆细胞抗原、聚SA、PSCA、PSMA、音猬因子(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF-P前体、2B4(CD244)、ββ4整联蛋白、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KLRGI、LAIR-1、NKG2A、NKR-PIA、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、TCRa、TCRB、TCR5y、TIM1、LAG3、LAIR1、PD-1H、TIGIT、TIM2、和TIM3。
靶细胞
本文描述的组合物和方法可以用于捕获和分离靶细胞。靶细胞的非限制性示例包括：癌细胞(例如，循环癌细胞)、免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、或树图细胞)、细菌细胞、病毒感染细胞、干细胞(例如，骨髓干细胞)、胎细胞、和上皮细胞。
在一些实施例中，靶细胞是真核细胞(例如，哺乳动物细胞)、或原核细胞。
癌症的非限制性示例包括：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、原发来源未知的癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性瘤、子宫内膜癌、室管膜细胞瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维性组织细胞瘤、尤文肉瘤、眼癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、嘴唇和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞癌、涉及NUT基因的中线呼吸道癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤样增生、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤。例如，癌细胞可以源自被鉴定或诊断为患有本文描述的任一种癌症的受试者。例如，所述癌细胞可以源自被怀疑患有本文描述的任一种癌症的受试者。
例如，所述靶细胞可以选自黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、膀胱癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、和子宫癌细胞。
试剂盒
本文还提供了含有一种或多种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、或20种)本文描述的任一种组合物的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括执行本文描述的任一种方法的说明。在一些实施例中，所述试剂盒可以包含一定体积的用于培养靶细胞的培养基，例如，可以进一步包含选定的药剂(例如，抗生素)的培养基。
生成磁性微珠的方法
本文还提供了生成具有多个脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠的方法，所述方法包括：(a)向组合物施加磁场，所述组合物包含：(i)磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种磁性微珠)，具有多个第一结合配偶体(例如，本文描述的的任一种第一结合配偶体)附着至其外表面(例如，共价或非共价附着至其外表面)；(ii)多个脂质囊泡(例如，本文描述的或本领域已知的任一种脂质囊泡)，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体(例如，第一结合配偶体共价或非共价附着至其外表面上)；(iii)多个第二结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第二结合配偶体)；和(iv)多个药剂(例如，特异性结合至本文描述的或本领域已知的靶细胞的任一种示例性药剂)，其特异性结合至靶细胞，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体，其中：所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个(例如，两个或更多个)(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、或十个)第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体，其中，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下施加所述磁场；(b)在步骤(a)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在步骤(b)之后，在允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用水溶液(例如，包含1％和10％之间的牛血清白蛋白的水溶液)再悬浮所述洗涤后的磁性微珠，从而生成具有多个抗污脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，该方法包括施加磁力的步骤。在一些实施例中，使用磁铁或包括磁铁、磁棒、磁力架(例如，
Figure BDA0002979843100000311
单管磁力架)、或磁分离架(例如，New England
Figure BDA0002979843100000312
12管磁分离架)的设备施加磁力。其他用于施加磁力的示例性方法在本领域中是已知的。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，在接触步骤之后，该方法可以进一步包括至少一个(例如，2、3、4、5、6、7或8个)洗涤步骤。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，在接触步骤之后，所述方法可以进一步包括至少四个(例如，5、6、7、8、9、10、11或12个)洗涤步骤。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，至少一个洗涤步骤包括使用洗涤缓冲液(例如，本文描述的洗涤缓冲液种的任一种)。在一些实施例中，洗涤步骤包括在约10℃至约37℃(例如，约10℃至约35℃、约10℃至约30℃、约10℃至约28℃、约10℃至约26℃、约10℃至约24℃、约10℃至约22℃、约10℃至约20℃、约10℃至约18℃、约10℃至约16℃、约10℃至约14℃、约10℃至约12℃、约12℃至约37℃、约12℃至约35℃、约12℃至约30℃、约12℃至约28℃、约12℃至约26℃、约12℃至约24℃、约12℃至约22℃、约12℃至约20℃、约12℃至约18℃、约12℃至约16℃、约12℃至约14℃、约14℃至约37℃、约14℃至约35℃、约14℃至约30℃、约14℃至约28℃、约14℃至约26℃、约14℃至约24℃、约14℃至约22℃、约14℃至约20℃、约14℃至约18℃、约14℃至约16℃、约16℃至约37℃、约16℃至约35℃、约16℃至约30℃、约16℃至约28℃、约16℃至约26℃、约16℃至约24℃、约16℃至约22℃、约16℃至约20℃、约16℃至约18℃、约18℃至约37℃、约18℃至约35℃、约18℃至约30℃、约18℃至约28℃、约18℃至约26℃、约18℃至约24℃、约18℃至约22℃、约18℃至约20℃、约20℃至约37℃、约20℃至约35℃、约20℃至约30℃、约20℃至约28℃、约20℃至约26℃、约20℃至约24℃、约20℃至约22℃、约22℃至约37℃、约22℃至约35℃、约22℃至约30℃、约22℃至约28℃、约22℃至约26℃、约22℃至约24℃、约24℃至约37℃、约24℃至约35℃、约24℃至约28℃、约24℃至约26℃、约26℃至约37℃、约26℃至约35℃、约26℃至约30℃、约26℃至约28℃、约28℃至约37℃、约28℃至约35℃、约28℃至约30℃、约30℃至约37℃、约30℃至约35℃、或约35℃至约37℃)的温度下，使用洗涤缓冲液(本文描述的任一种示例性洗涤缓冲液)约10秒至约6小时(例如，约10秒至约5小时、约10秒至约4小时、约10秒至约3小时、约10秒至约2小时、约10秒至约1小时、约10秒至约50分钟、约10秒至约40分钟、约10秒至约30分钟、约10秒至约20分钟、约10秒至约15分钟、约10秒至约10分钟、约10秒至约5分钟、约10秒至约1分钟、约10秒至约30秒、约30秒至约6小时、约30秒至约5小时、约30秒至约4小时、约30秒至约3小时、约30秒至约2小时、约30秒至约1小时、约30秒至约50分钟、约30秒至约40分钟、约30秒至约30分钟、约30秒至约20分钟、约30秒至约15分钟、约30秒至约10分钟、约30秒至约5分钟、约30秒至约1分钟、约1分钟至约6小时、约1分钟至约5小时、约1分钟至约4小时、约1分钟至约3小时、约1分钟至约2小时、约1分钟至约1小时、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟、约5分钟至约6小时、约5分钟至约5小时、约5分钟至约4小时、约5分钟至约3小时、约5分钟至约2小时、约5分钟至约1小时、约5分钟至约50分钟、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约20分钟、约5分钟至约15分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约6小时、约10分钟至约5小时、约10分钟至约4小时、约10分钟至约3小时、约10分钟至约2小时、约10分钟至约1小时、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约40分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约20分钟、约10分钟至约15分钟、约15分钟至约6小时、约15分钟至约5小时、约15分钟至约4小时、约15分钟至约3小时、约15分钟至约2小时、约15分钟至约1小时、约15分钟至约50分钟、约15分钟至约40分钟、约15分钟至约30分钟、约15分钟至约20分钟、约20分钟至约6小时、约20分钟至约5小时、约20分钟至约4小时、约20分钟至约3小时、约20分钟至约2小时、约20分钟至约1小时、约20分钟至约50分钟、约20分钟至约40分钟、约20分钟至约30分钟、约30分钟至约6小时、约30分钟至约5小时、约30分钟至约4小时、约30分钟至约3小时、约30分钟至约2小时、约30分钟至约1小时、约30分钟至约50分钟、约30分钟至约40分钟、约40分钟至约6小时、约40分钟至约5小时、约40分钟至约4小时、约40分钟至约3小时、约40分钟至约2小时、约40分钟至约1小时、约40分钟至约50分钟、约50分钟至约6小时、约50分钟至约5小时、约50分钟至约4小时、约50分钟至约3小时、约50分钟至约2小时、约50分钟至约1小时、约1小时至约6小时、约1小时至约5小时、约1小时至约4小时、约1小时至约3小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约2小时至约5小时、约2小时至约4小时、约2小时至约3小时、约3小时至约6小时、约3小时至约5小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约4小时至约5小时,或约5小时至约6小时)。
在一些实施例中，所述洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)，和牛血清白蛋白(BSA)或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清(GS))。在本文描述的任一种洗涤缓冲液的一些实施例中，洗涤缓冲液包含约0.1％w/v至约10％w/v(例如，约0.1％w/v至约5％w/v、约0.1％w/v至约1％w/v、约0.1w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约10％w/v、约0.5％w/v至约5％w/v、约0.5％w/v至约1％w/v、约1％w/v至约10％w/v、约1％w/v至约5％w/v、约1％w/v至约2％w/v、约2％w/v至约10％w/v、约2％w/v至约5％w/v；约0.1％w/v、约0.5％w/v、约1％w/v、约2％w/v、约5％w/v、或约10％w/v)的BSA或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清)。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述方法可以进一步包括使用水性溶液(例如，本文描述的任一种水性溶液，例如，包含约1％w/v至约10％w/v、约1％w/v至约5％w/v、约1％w/v至约2％w/v、约2％w/v至约10％w/v、约2％w/v至约5％w/v之间的，约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v、或约10％w/v BSA或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清))再悬浮洗涤后的微珠。在一些实施例中，使用水性溶液再悬浮洗涤后的微珠导致洗涤后的微珠均匀分散，几乎没有可见的聚集。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述方法可以进一步包括在约1μL至约500mL(例如，约1μL至约200mL、约1μL至约100mL、约1μL至约50mL、约1μL至约10mL、约1μL至约5mL、约1μL至约1mL、约1μL至约500μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL、约1μL至约20μL、约100μL至约500mL、约100μL至约200mL、约100μL至约100mL、约100μL至约50mL、约100μL至约10mL、约100μL至约5mL、约100μL至约1mL、约100μL至约500μL、约1mL至约500mL、约1mL至约200mL、约1mL至约100mL、约1mL至约50mL、约1mL至约20mL、约1mL至约10mL、约1mL至约5mL、约5mL至约500mL、约5mL至约100mL、约5mL至约50mL、约5mL至约20mL,约10mL至约500mL、约10mL至约200mL、约10mL至约100mL、约10mL至约50mL、约10mL至约20mL、约50mL至约500mL、约50mL至约200mL、约50mL至约100mL、约100mL至约500mL、约100mL至约200mL、或约200mL至约500mL)的水性溶液(例如，本文描述的任一种水性溶液)中，再悬浮洗涤后的微珠。
本文还提供了生成具有多个脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠的方法，所述方法包括：(a)孵育：(i)使多个第一结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第一结合配偶体)附着(例如，共价或非共价附着)至其外表面上的磁性微珠(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性磁性微珠)、(ii)在其外表面上(例如，共价或非共价附着至其外表面上)包含多个所述第一结合配偶体的多个脂质囊泡(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性脂质囊泡)、和(iii)多个第二结合配偶体(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性第二结合配偶体)，其中：所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个(例如，两个或更多个)第一结合配偶体，所述多个第二结合配偶体的子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，所述孵育在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下进行；(b)在步骤(a)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；(c)在(b)之后，在足以允许所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合的条件下，使所述磁性微珠与特异性结合至靶细胞的多个药剂接触，从而生成具有多个脂质囊泡附着至其外表面的磁性微珠，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述孵育步骤是在约10℃至约37℃(或本文描述的该范围的任一个子范围)的温度下进行的。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述孵育步骤执行了约10秒至约6小时(或本文描述的该范围的任一子范围)。在一些实施例中，所述洗涤步骤可以使用本文描述的任一种示例性水性缓冲液执行。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，在接触步骤之后，所述方法可以进一步包括至少一个(例如，2、3、4、5、6、7或8个)孵育步骤。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，至少一个洗涤步骤包括使用洗涤缓冲液(例如，本文描述的洗涤缓冲液中的任一种)。在一些实施例中，所述洗涤步骤包括在约10℃至约37℃(或本文描述的该范围中的任一子范围)的温度下，使用洗涤缓冲液(例如，本文描述的任一种示例性洗涤缓冲液)1分钟至约6小时(或本文描述的该范围中的任一子范围)。
在一些实施例中，所述洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且可选地包含牛血清白蛋白(BSA)或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清)。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，洗涤缓冲液包含约0.1％w/v至10％w/v(或本文描述的该范围的任一子范围)的BSA或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清)。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述使磁性微珠与特异性结合至靶细胞的多个药剂接触在生物样品是在约10℃至约37℃(或本文描述的该范围的任一子范围)的温度下进行的。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述接触步骤执行了约10秒至约6小时(或本文描述的该范围的任一子范围)。所述接触步骤可以使用这里描述的任一种水性缓冲液进行的。
靶细胞分离方法
本文还提供了从生物样品(例如，包含血液、血清、或血浆的生物样品)中分离靶细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任一种示例性靶细胞)的方法，所述方法包括：(a)使包含靶细胞和非靶细胞的生物样品与本文描述的任一种组合物接触；(b)在(a)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合以形成复合物、以及(ii)特异性结合至所述靶细胞的所述药剂和所述复合物之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及(c)在(b)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合、以及(ii)所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的所述药剂之间缔合的条件下，向所述磁性微珠施加磁力，从而分离所述靶细胞。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，接触生物样品是在约10℃至约37℃(或本文描述的该范围的任一个子范围)的温度下进行的。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，所述接触步骤执行了约10秒至约6小时(或本文描述的该范围的任一子范围)。接触步骤可以使用本文描述的任一种示例性水性缓冲液进行。
洗涤
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，在接触步骤之后，该方法可以进一步包括至少一个(例如，2、3、4、5、6、7或8个)洗涤步骤。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，至少一个洗涤步骤包括使用洗涤缓冲液(例如，本文描述的示例性洗涤缓冲液种的任一种)。在一些实施例中，所述洗涤步骤包括在约10℃至约37℃(或本文描述的该范围中的任一子范围)的温度下，使用洗涤缓冲液(例如，本文描述的任一种示例性洗涤缓冲液)10秒至约6小时(或本文描述的该范围中的任一子范围)。
在一些实施例中，洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及可选地，牛血清白蛋白(BSA)或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清)。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，洗涤缓冲液包含约0.1％w/v至10％w/v(或本文描述的该范围的任一子范围)的BSA或血清(例如，胎牛血清或正常山羊血清)。
施加磁力
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，该方法包括施加磁力的步骤。在一些实施例中，使用磁铁或包括磁铁、磁棒、磁力架(例如，
Figure BDA0002979843100000381
单管磁力架)、或磁分离架(例如，New England
Figure BDA0002979843100000382
12管磁分离架)的设备施加磁力。其他用于施加磁力的示例性方法在本领域中是已知的。
一个或多个附加步骤
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，可以在施加磁力的步骤之前和/或之后执行一个或多个附加步骤。
在一些实施例中，在施加磁力的步骤之前执行的一个或多个(例如，二、三、四或五个)附加步骤可以包括：裂解样品中的红血球。裂解红血球可以通过使用红血球裂解缓冲液(例如，155mM NH4C1、10mM KHCO3、0.1mM EDTA，pH 7.3)孵育样品来执行。在一些实施例中，红血球裂解缓冲液包含氯化铵或碳酸氢钾，以及可选地乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施例中，在施加磁力的步骤之后执行的一个或多个(例如，二、三、四或五个)附加步骤包括：培养靶细胞，量化靶细胞，确定靶细胞的细胞活力，靶细胞染色(例如，靶细胞免疫染色)，对靶细胞进行转基因，将靶细胞注射到受试者中，使用靶细胞进行体内测定，冷冻靶细胞，提取核酸并可选地对从靶细胞中获得的核酸进行测序，以及具体地基于从靶细胞中提取的核酸的检测出的基因分型，选择用于受试者的药物治疗和/或向受试者给予药物治疗。
在一些实施例中，在施加磁力之前执行的一个或多个附加步骤包括裂解红血球；并且在施加磁力之后执行的一个或多个附加步骤选自：培养靶细胞，对靶细胞进行量化，确定靶细胞的细胞活力，从靶细胞中提取核酸，并且对从靶细胞中提取的核酸进行基因分型。
在一些实施例中，在施加磁力之前执行的一个或多个附加步骤包括：裂解红血球；并且在施加磁力之后执行的一个或多个附加步骤选自下组：培养靶细胞，量化靶细胞，确定靶细胞的细胞活力，从靶细胞提取核酸，对从靶细胞中提取的核酸进行基因分型，以及具体地基于从靶细胞中提取的核酸的基因分型，选择用于受试者的药物治疗和/或向受试者给予药物治疗。
在一些实施例中，在施加磁力之前执行的一个或多个附加步骤包括裂解红血球；并且在施加磁力之后执行的一个或多个附加步骤选自：培养靶细胞，对靶细胞进行量化，确定靶细胞的细胞活力，并且冷冻靶细胞。
在一些实施例中，在施加磁力之前执行的一个或多个附加步骤包括裂解红血球；并且在施加磁力之后执行的一个或多个附加步骤选自：培养靶细胞，对靶细胞进行量化，确定靶细胞的细胞活力，并且对靶细胞进行转基因以及可选地，冷冻经转基因的靶细胞。
在一些实施例中，在施加磁力之前执行的一个或多个附加步骤包括裂解红血球；并且在施加磁力之后执行的一个或多个附加步骤选自：培养靶细胞，对靶细胞进行量化，确定靶细胞的细胞活力，并且对靶细胞进行转基因以及可选地，将经转基因的靶细胞注射到受试者中。
在一些实施例中，在施加磁力之前执行的一个或多个附加步骤包括裂解红血球；并且在施加磁力之后执行的一个或多个附加步骤选自：培养靶细胞，对靶细胞进行量化，确定靶细胞的细胞活力，并且对靶细胞进行转基因以及可选地，冷冻经转基因的靶细胞。
本领域已知各种不同的方法可用于对靶细胞进行转基因。可用于对靶细胞进行转基因的方法的非限制性示例包括转化、脂质转染、转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙转染、基于树形分子的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、光学转染、流体动力学输送、病毒转导(例如，腺病毒和慢病毒转导)、和纳米颗粒转染。对靶细胞进行转基因的这些和其他方法在本领域中是众所周知的。
本领域中已知各种用于鉴定和检测靶细胞的方法，此类方法包括但不限于：流式细胞术(例如，荧光辅助细胞分选(FACS))、ELISA、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、蛋白质微阵列、免疫荧光法、桑格测序法、马克萨姆-吉利别尔特测序法、毛细管电泳法、焦磷酸测序法、单分子实时测序法、以及本领域中已知的许多其他方法。
本领域中已知各种用于培养、量化和确定细胞(例如，靶细胞)的细胞活力的方法，并且这些方法可以用于本文描述的任一种方法中。
实施例
在以下示例中进一步描述本发明，这些示例并非对权利要求中描述的本发明的范围进行限制。
实施例1.示例性循环肿瘤细胞捕获方案
使用本文描述的脂质囊泡涂覆的磁性微珠从生物样品中分离循环肿瘤细胞(CTC)。简而言之，将1.25mL血液置于1.5mL微量离心管。然后在350相对离心速度(基准)下，对微量离心管离心处理15分钟。接着，丢弃上清液(例如，350μL血浆和350μL红血球)并保留细胞团块。然后将细胞团块再悬浮于800μL红血球裂解缓冲液(155mM NH4 Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，pH 7.3)中，并在室温下孵育15分钟。然后在350rcf下对样品离心5分钟，并丢弃上清液。接着，将团块再悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)的500μL溶液中，并加入5μLCMx微珠(1.0x105个微珠/mL)。然后将微量离心管放在旋转装置上并在室温下孵育1小时。孵育之后，旋转微量离心管大约3-5秒，以防液体吸附在盖子上。然后将微量离心管放在磁铁上1分钟，之后丢弃上清液。之后用含有lx磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.0)和1％BSA的200μL溶液洗涤微量离心管6次，持续5分钟。管中所含样品即准备好进行下游分析，或将其保存在-80℃。图1示出了一种组合物的示例性实施例的示意图示。图2中示出了方案的流程图。
实施例2.全血中靶细胞的回收率和纯度
将循环肿瘤细胞捕获方案应用于介质EpCAM-表达细胞(H1975)。图3示出了该实验的数据。数据表明，在使用本文提供的脂质囊泡涂覆的磁性微珠时，全血中靶细胞(Hl975)的回收率非常好。在脂质囊泡涂覆的磁性微珠暴露于三种不同浓度的细胞(即，含有不同细胞总浓度的三种不同的细胞样品)的实验中，回收率可以高于70％。使用本文提供的脂质囊泡涂覆的磁性微珠还减少了白血球的残留量(洗涤六次后，白血球残留量等于或小于300)。
图4中的表格示出了使用2D芯片或本文提供的脂质囊泡涂覆的磁性微珠获得的结构的并排对比。在第一次富集中，2D芯片仅达到45-60％的靶细胞回收率和小于3000个残留白血球。因此，对于2D芯片，在可以执行下游分子分析之前，需要进行第二次富集。然而，增加富集会导致靶细胞回收率下降。本文提供的脂质囊泡涂覆的磁性微珠提高了细胞捕获率(>70％)并降低了白血球残留数(白血球等于或小于300个)。这些数据证明，在使用本文提供的脂质囊泡涂覆的磁性微珠时，没有必要在下游分子分析之前进行进一步的富集。
其他实施例
应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式对本发明进行了描述，但前述描述用于说明而非限制本发明的范围，本发明的范围是由所附权利要求的范围限定的。其他方面、其他优点以及其他修改均处于所附权利要求的范围内。

Claims (33)

1.一种组合物，其特征在于，包含：
(i)磁性微珠，具有多个第一结合配偶体附着至其外表面；
(ii)多个脂质囊泡，其在其外表面上包含多个所述第一结合配偶体；
(iii)多个第二结合配偶体；和
(iv)多个药剂，其特异性结合至靶细胞，其中每个药剂包含附着的第一结合配偶体；
其中：
所述多个第二结合配偶体的每个能够特异性结合至一个或多个第一结合配偶体，
所述多个第二结合配偶体的第一子集特异性结合至(i)附着到所述磁性微珠的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体；
所述多个第二结合配偶体的第二子集特异性结合至(i)所述脂质囊泡的所述外表面上的第一结合配偶体，和(ii)附着到特异性结合至靶细胞的药剂上的第一结合配偶体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂质囊泡是抗污脂质囊泡。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗污脂质囊泡包含两性离子脂质分子。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗污脂质囊泡包含聚电解质多层膜(PEM)或聚合物刷。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述聚电解质多层膜包含多聚左旋赖氨酸、多聚左旋谷胺酸和多聚左旋天冬氨酸中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述聚合物刷包含[2-丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)和2-羧乙基-丙烯酸酯(CAA)。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述囊泡包含1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱POPC和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-醋酸纤维素酞酸酯-生物素基b-PE，并且生物素为所述第一结合配偶体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述脂质囊泡包含比例为85:15的POPC和b-PE。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述磁性微珠使所述多个第一结合配偶体共价附着至其外表面。
10.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述磁性微珠使所述多个第一结合配偶体非共价附着至其外表面。
11.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含共价附着的第一结合配偶体。
12.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，特异性结合至靶细胞的所述多个药剂各自包含非共价附着的第一结合配偶体。
13.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合配偶体包含生物素或其衍生物。
14.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合配偶体包含亲和素或其衍生物。
15.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶细胞是癌细胞，并且特异性结合至所述靶细胞的所述多个药剂是特异性结合至癌抗原的抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述癌抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
18.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合配偶体以小于等于10-7M的解离常数(KD)结合至所述第二结合配偶体。
19.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合配偶体以小于等于10-9M的解离常数(KD)结合至所述第二结合配偶体。
20.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-18中任一项所述的组合物。
21.一种从生物样品中分离靶细胞的方法，其特征在于，包括：
(a)使包含靶细胞和非靶细胞的生物样品与权利要求1-19中任一项所述的组合物接触；
(b)在(a)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合以形成复合物、以及(ii)特异性结合至所述靶细胞的所述药剂和所述复合物之间缔合的条件下，用洗涤缓冲液洗涤所述磁性微珠；以及
(c)在(b)之后，在足以允许(i)所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体之间缔合、以及(ii)所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的所述药剂之间缔合的条件下，向所述磁性微珠施加磁力，从而分离所述靶细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述分离的靶细胞是活的。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是循环肿瘤细胞或循环肿瘤干细胞。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(d)在允许所述靶细胞和特异性结合至所述靶细胞的药剂之间解缔合的条件下，使所述磁性微珠与洗脱缓冲液接触，从而从所述磁性微珠中释放所述靶细胞。
25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品包含血液。
26.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品从已被诊断为患有癌症的受试者中获得。
27.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品从被怀疑患有癌症的受试者中获得。
28.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水和牛血清白蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液包含1％w/v牛血清白蛋白。
30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(d)从步骤(c)中的所述富集的靶细胞中提取核酸。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(e)对步骤(d)中从所述富集的靶细胞中提取的所述核酸进行基因分型处理。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(f)基于步骤(e)中从所述富集的靶细胞中提取的所述核酸的所述基因分型，选择用于受试者的药物治疗或向受试者给予药物治疗。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述富集的分离的靶细胞是活的。
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