CN112730857A - 一种快速检测ms-222的磁性免疫层析试纸条及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于渔用麻醉剂检测技术领域，具体涉及一种快速可视化定量MS‑222的试纸条和检测方法。本发明结合超顺磁性磁珠及免疫层析试纸条技术，采用竞争检测模式进行水产品中MS‑222的快速定量检测。本发明中的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，以及硝酸纤维素膜上的检测线和质控线，其中检测线上包被3‑氨基苯甲酸‑BSA完全抗原，质控线上包被羊抗鼠IgG。本发明实现了水产品中MS‑222的快速检测，滴加样品15‑20min后即可肉眼定性判定结果，利用磁性免疫层析分析仪还可进一步定量分析MS‑222的含量。本发明还提供了上述试纸条的制备方法和检测方法，无需复杂前处理即可对大批量样品进行现场快速检测，易于推广应用。

Description

一种快速检测MS-222的磁性免疫层析试纸条及方法

技术领域

本发明属于生物技术和检测领域，具体涉及一种适用于低成本快速检测水产品或者水样中MS-222的磁性免疫层析试纸条的制备及其应用方法。

背景技术

麻醉是鲜活水产品运输的常见方法，适当使用麻醉剂能够使鲜活水产品保持安静，降低新陈代谢，提高成活率和运输密度，延长运输时间，减少运输损失、降低运输成本，且操作方便、管理简便。MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐)，又名三卡因、鱼安定，是常见渔用麻醉剂之一。美国、加拿大、欧盟等国家和地区均允许将MS-222应用在鲜活水产品中，但对其休药期和最大残留量的要求有所不同，其中，美国要求经MS-222处理的水产品休药期为21d，最大残留量为1μg/mL；加拿大要求休药期为5d。过多摄入的MS-222可蓄积在脾脏和肝脏中损害人体生理机能，造成过敏、造血紊乱等不良反应，甚至产生致癌作用，近年来，经监管部门和媒体曝光，某些商家受利益驱使，在水产品中加入过量MS-222，且未经休药期就将水产品进行出售，麻醉剂残留已成为鲜活水产品食品质量安全的一大重要隐患。渔用麻醉剂在我国的使用历史不长，目前我国尚未正式建立针对渔用麻醉剂的法律法规，缺乏相关检测标准及基准方法，对麻醉剂的监察管理还处于模糊地带，针对麻醉剂的快速检测技术也是亟待开发的领域。

当前MS-222残留的检测方法有液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、高效液相色谱法(HPLC)等。LC-MS/MS法对水产品中残留MS-222的定量检出限为2μg/kg，回收率在80％～110％，可行性较强；HPLC法检测鱼脑中的MS-222，也有较好的重现性。这些方法虽然灵敏度高、准确性好，但样本前处理复杂、耗时长、费用高、对操作人员要求高，难以满足现场大批量快速检测的要求。

现有专利CN110747173A开发了一株分泌三卡因单克隆抗体的杂交瘤细胞株HOT及其应用，但包被抗原合成中所用的三正丁胺属于管制类剧毒物品，存在安全隐患问题。CN108760947A提出了一种GC-MS/MS检测水产品中七种麻醉剂的检测方法，但是样品前处理需要经过两次有机溶剂提取，固相萃取净化(样品加入硅胶柱、正己烷淋洗、抽干、乙酸乙酯洗脱、氮吹、乙腈定容、过滤膜)，操作繁琐，样品处理时间大于80min，无法实现现场快速检测。CN107192767A提出了一种同位素稀释气相色谱质谱测定水产品中丁香酚的方法，其样品前处理包含有机溶剂提取、正己烷脱脂、旋蒸、C18固相萃取柱净化、氮吹、过滤膜等过程，也存在操作复杂、耗时长、需专业设备的问题，不适用于现场快速检测。CN110987922B公开了一种检测水产品中丁香酚类麻醉剂的方法，需要经过有机溶剂提取、调节pH、测烯烃双键结构、测氨基甲酸酯结构等步骤，涉及分光光度计、离心机以及氮吹仪等仪器设备处理，检测时间大于1.25h，不能达到现场快速检测的目的，且该方法缺少检测性能分析。CN110746286A公开了一种丁香酚半抗原、完全抗原制备方法以及在试剂盒和试纸条中的应用，该检测方法需要使用酶标仪、涡旋振荡器、离心机、摇床、氮吹仪等专业设备，前处理时间大于70min，检测时间大于85min，同样无法实现现场快速检测的目的。CN107189988B公开了一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株CS12及其应用，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测检测鱼肉中添加的丁香酚，前处理包含有机溶剂提取、漩涡振荡、离心、氮吹等步骤，也存在处理繁琐的问题。CN110938011A公开了一种苯佐卡因半抗原、完全抗原、抗体的制备与应用方法，但是酶联免疫吸附试验需要酶标仪等仪器设备，同样无法在现场进行快速检测。综上所述，目前渔用麻醉剂的检测存在以下问题：合成3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原需剧毒试剂；样品前处理要经过固相萃取、氮吹以及离心，甚至需要旋蒸，操作繁琐、耗时长；ELISA和化学检测实验也存在类似问题。

发明内容

本发明旨在提供一种快速检测渔用麻醉剂MS-222的方法、磁性免疫层析试纸条及试剂盒。

技术方案为：一种快速检测MS-222的磁性免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板及底板上依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；检测线上包被3-氨基苯甲酸-载体蛋白完全抗原，质控线上包被羊抗鼠IgG。

3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原是指以3-氨基苯甲酸为半抗原、BSA或OVA为载体蛋白合成的偶联物，偶联物制备过程包括以下步骤：

1)活化：3-氨基苯甲酸用N,N-二甲基苯胺或N,N-二甲基甲酰胺溶解至浓度10-60mg/mL，加入2％-5％体积比的三乙胺，2-8℃反应10-20min，随后加入0.5％-1％体积比氯甲酸异丁酯，2-8℃反应1-3h；或者，

3-氨基苯甲酸用N,N-二甲基苯胺或N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入质量比为2：1-2的1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，3-氨基苯甲酸与1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐用量比为1：1-2；反应体系中3-氨基苯甲酸浓度为10-60mg/mL；

2)偶联：加入BSA或OVA于上述溶液，反应8-12h，BSA或OVA与3-氨基苯甲酸质量比为1：1.5-2；优选为BSA；

3)纯化：将上述偶联物置于20-40kD透析袋中，用pH＝7.0-7.4的磷酸盐缓冲液透析；透析时间为36-96h，优选为48-72h；优选的，磷酸盐缓冲液pH＝7.4。

在本发明的一个优选方式中，步骤(1)中，3-氨基苯甲酸溶液浓度为30mg/mL，三乙胺用量为3％体积比，氯甲酸异丁酯用量为1％体积比；或者步骤(1)中，1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为2：1。步骤(3)中，用pH＝7.4、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液透析72h。

试纸条的制备方法包括以下步骤：

(a)硝酸纤维素膜包被：使用划膜仪将3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原及羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜相应区域上，作为检测线(T线)和质控线(C线)，检测线与质控线的距离为1-10mm，置于烘箱中37℃干燥1-6h。

(b)试纸条的组装：将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及PVC底板依次组装，为了保证样品顺利流动，在组装试纸条各部分时要有一定的重叠，重叠1.0-3.0mm即可。随后裁切成2-8mm宽的测试条密封干燥保存。

一种快速检测MS-222的方法，步骤包括：

(1)将待测样品与磁纳米探针混合后反应1-30min；所述的磁纳米探针为偶联了MS-222单抗的超顺磁性纳米颗粒；优选的，用1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将超顺磁性纳米颗粒与MS-222单抗共价连接；

(2)加入层析液充分混匀5-60s，滴加到磁性免疫层析试纸条的样品垫上；优选的，所述的层析液是含5％-20％质量比BSA和1％-5％体积比吐温-20的PBS缓冲液，pH＝7.0-8.0；

优选的，所述的超顺磁性纳米颗粒的粒径为100-300nm。优选的，所述的超顺磁性纳米颗粒为超顺磁性纳米Fe₃O₄颗粒；

(3)定性或定量判断结果。

步骤(3)包含肉眼定性观察和仪器定量测定两种方式，

所述步骤(3)中结果判断，包括以下两种方法：

1)定性判断：肉眼观察T线、C线显色情况进行定性判断。比较样品与阴性对照检测线的颜色深度判定阴阳性结果，若样品检测线的颜色接近或深于阴性对照则为阴性结果，检测线颜色浅于阴性对照或者没有显色则为阳性结果。

2)定量判断：使用磁性免疫层析分析仪测定T、C线上信号值，进行定量检测。根据样品与阴性对照间T/C的比值B/B₀建立标准曲线，由此计算出样品中MS-222的含量。

步骤(2)中磁纳米探针的制备方法包括以下步骤：

A)取超顺磁性磁纳米颗粒用活化缓冲液(MEST，含0.01～0.05％吐温-20的10mM吗啉乙磺酸缓冲液，pH＝5.0)清洗；

B)加入质量比为1：1-2的EDC和NHS加入含有磁珠的离心管中，垂直旋转混匀10-60min；EDC与超顺磁性磁纳米颗粒的用量比为0.01-0.1：1；

C)加入MS-222单抗，充分振荡，垂直旋转混匀1-5h；MS-222单抗与超顺磁性磁纳米颗粒用量比为0.005-0.1：1。

D)用BSA将上述磁纳米探针表面未反应的基团封闭，优选的，采用0.5％-5％BSA为封闭剂，将上述磁纳米探针表面未反应的基团封闭1～8h。

之后将上述磁纳米探针储存于保存液(含0.1～1％叠氮化钠、0.1～1％BSA的BST缓冲溶液)中保存备用。

步骤(2)所述的层析液是含5％-20％质量比BSA和1％-5％体积比吐温-20的PBS缓冲液，pH＝7.0-8.0。优选的，PBS缓冲液pH为7.0-7.4。

用于检测水产品中MS-222时，样品前处理的方法为：将待测水产品与去离子水混匀后，加入乙腈进行提取，取上清液用盐去除水分，静置后使将乙腈吹干，再加入磷酸盐(PBS)缓冲液将其复溶。

所述的盐是指硫酸镁、氯化钠。优选的，PBS缓冲液pH为7.0-7.4。

本发明结合超顺磁性磁珠及免疫层析试纸条技术，采用竞争检测模式进行水产品中MS-222的快速定量检测。试纸条的检测原理如下：

将待测样品与磁纳米探针混合孵育后，滴加于样品垫上进行检测，若待测样品不含MS-222，磁纳米探针直接与T线上的3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原结合而聚集，T线呈清晰显色；若待测样品含MS-222，磁纳米探针与T线抗原竞争结合磁纳米探针，T线显色减弱，且MS-222含量越高，T线颜色越浅。阳性结果仅有C线出现条带，弱阳性结果的T线条带有微弱显色，阴性结果的C、T线均有明显条带。

本发明结合超顺磁性磁珠及免疫层析试纸条技术，采用竞争检测模式进行水产品中MS-222的快速定量检测。

本发明解决了上述问题并提供一种水产品中MS-222快速定量检测方法，本发明结合磁纳米探针与免疫层析试纸条技术，通过将3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原及羊抗鼠IgG喷涂在NC膜的检测线(T线)和质控线(C线)上制备免疫层析试纸条，并利用磁信号分析仪检测，实现了更高的灵敏度检测，建立了一种渔用麻醉剂MS-222的试纸条快速定量检测方法。该试纸条方法特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低，很好地弥补现有大型仪器分析手段的不足，满足现场快速检测的需求。

本发明相对于现有技术取得的有益效果是：

(1)本发明的试纸条产品体积小、质量轻，方便携带及储存，操作简单，普通人员即可完成测定，结果判读仅需15～20min，可实现大批量样品的现场快速定性及定量检测，易于推广使用；

(2)灵敏度高，特异性强，操作简便、成本低，很好地弥补现有大型仪器分析手段的不足，满足现场快速检测的需求；

(3)本发明采用三乙胺代替专利CN110747173A中剧毒管制化学品三正丁胺用于合成完全抗原，原料更易获得，从而减少安全风险，也减少了对实验人员的毒害作用；并且通过改良3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原合成中所使用的溶剂以及半抗原与载体蛋白偶联的方法，筛选出提高试纸条检测性能的完全抗原。

附图说明

图1为本发明MS-222快速检测试纸条测试原理图

图2为本发明试纸条的灵敏度检测结果。

图3为本发明试纸条的灵敏度结果定量曲线。

图4为本发明试纸条的特异性检测结果。

图5为本发明试纸条的特异性定量图。

具体实施方式

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1 3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原合成

本实施例提供一种3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原合成方法，包括以下步骤：

3-氨基苯甲酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺，浓度30mg/mL；溶液中加入3％体积三乙胺，反应10min后加入1％体积氯甲酸异丁酯，反应1h后取0.3mL加入BSA溶液(BSA 5.0mg)补足体积至2mL，过夜反应。所得偶联物用pH＝7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液透析72h，–20℃保存备用。

实施例2制备试纸条

(1)硝酸纤维素膜包被：使用划膜仪将3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原及羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜相应区域上，作为检测线(T线)和质控线(C线)，检测线与质控线的距离为1-10mm，置于烘箱中37℃干燥1-6h。

(2)试纸条的组装：将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及PVC底板依次组装，为了保证样品顺利流动，在组装试纸条各部分时要有一定的重叠，重叠1.0-3.0mm即可。随后裁切成2-8mm宽的测试条密封干燥保存。

实施例3磁纳米探针的构建

磁纳米探针的构建包括以下步骤：

用含0.01％吐温-20的10mM吗啉乙磺酸缓冲液清洗1mg超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒(粒径约200nm)2次，然后加入10mg EDC和20mg NHS，25℃反应20min后加入适量MS-222单抗反应2h，最后加入2％BSA过夜反应进行封闭。制备的磁纳米探针保存在1％BSA的BST缓冲溶液，浓度80μg/mL。

实施例4 MS-222试纸条检测

取实施例3的磁纳米探针5μL与100μL样本混合，25℃反应5min后加入20μL层析液(含3％吐温-20、30％BSA、pH＝7.4的PBS溶液)，混合均匀后滴加至试纸条样品垫上。通过肉眼对C线、T线显色情况进行定性观察。使用磁性免疫层析分析仪对试纸条T、C线信号值进行定量检测。原理如图1A和图1B。

实施例5 MS-222免疫层析试纸条的灵敏度

将本发明制备得到的MS-222快速检测试纸条进行灵敏度实验：

采用0-10μg/mL系列浓度MS-222溶液进行试纸条检测，以T线消失时的MS-222浓度作为试纸条定性检出限，定性检测结果见图2。由图可见，T线颜色随着MS-222浓度的增加而逐渐变浅，5.0μg/mL MS-222的T线颜色肉眼不可见，故试纸条的定性灵敏度为5.0μg/mL。

以试纸条的T、C线的磁信号值计算B/B₀值，绘制MS-222标准曲线。经计算，该试纸条对PBS稀释MS-222的定量灵敏度为0.13μg/mL，远低于美国对水产品中MS-222最大残留量的要求(1μg/mL)。

实施例6水样中MS-222检测

将本发明制备得到的MS-222快速检测试纸条进行水样中MS-222的检测：

使用养殖用水将MS-222标准品分别稀释至1.0、2.5、5.0μg/mL制备MS-222人工污染水样，经0.22μm膜过滤后分别用HPLC和MS-222试纸条对其进行检测。其结果见表1。HPLC和试纸条法在检测范围内的CV值均小于7.0％，且两者检测结果具有良好的一致性。

表1：水样中MS-222的检测结果

实施例7鱼肉中MS-222的检测

将本发明制备得到的MS-222快速检测试纸条进行鱼肉样品中MS-222的检测。

适用于MS-222试纸条检测的样品前处理方法包括以下步骤：

0.5mL去离子水中分别加入0.5、1.25、2.5μg MS-222，再与1g搅碎的鱼肉混匀，用QuEChERS试剂盒提取：加入1mL乙腈混合5min，再加入0.5g无水硫酸镁和0.3g氯化钠反应2min，离心5min后取上清。将乙腈吹干后用0.5mL pH＝7.4、浓度10mmol/L的PBS缓冲液复溶，加标浓度分别为1.0、2.5、5.0μg/mL，并使用实施例2的MS-222试纸条和HPLC方法对其进行检测。

检测结果如表2所示，试纸条检测结果与HPLC结果一致性良好。

表2：鱼肉中MS-222的检测结果

实施例8 MS-222免疫层析试纸条的特异性

将本发明制备得到的MS-222快速检测试纸条进行特异性试验：

将MS-222及盐酸布比卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁香酚等不同渔用麻醉剂用PBS缓冲液稀释至10μg/mL，用试纸条进行检测，根据显色情况分析试纸条的特异性，结果见图4，除了MS-222的检测结果为阳性外，其余均为阴性。定量结果见图5，MS-222B/B₀比值小于0.2，表示强阳性结果；其余麻醉剂B/B₀比值接近1.0，均为阴性结果，表明该试纸条能保证在检测MS-222时不受其他麻醉剂的干扰。MS-222与苯佐卡因互为同分异构体，而本试纸条对苯佐卡因无交叉反应，进一步说明该试纸条特异性良好。

Claims (10)

1.一种快速检测MS-222的磁性免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板及底板上依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；检测线上包被3-氨基苯甲酸-载体蛋白完全抗原，质控线上包被羊抗鼠IgG。

2.权利要求1所述的快速检测MS-222的磁性免疫层析试纸条，其特征在于，3-氨基苯甲酸-载体蛋白完全抗原是指以为半抗原、BSA或OVA为载体蛋白合成的偶联物；3-氨基苯甲酸与载体蛋白用1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺偶联，或者3-氨基苯甲酸与载体蛋白用三乙胺和氯甲酸异丁酯偶联。

3.权利要求2所述的快速检测MS-222的磁性免疫层析试纸条，其特征在于，3-氨基苯甲酸-载体蛋白完全抗原的制备方法包括以下步骤：

1)活化：3-氨基苯甲酸用N,N-二甲基苯胺或N,N-二甲基甲酰胺溶解至浓度10-60mg/mL，加入2％-5％体积比的三乙胺，2-8℃反应10-20min，随后加入0.5％-1％体积比氯甲酸异丁酯低温反应1-3h；或者，

3-氨基苯甲酸用N,N-二甲基苯胺或N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入质量比为1：1-2的1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，3-氨基苯甲酸与1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐用量比为1：1-2；反应体系中3-氨基苯甲酸浓度为10-60mg/mL；

2)偶联：加入BSA或OVA于上述溶液，过夜反应8-12h，BSA或OVA与3-氨基苯甲酸质量比为1：1.5-2；

3)纯化：将上述偶联物置于20-40kD透析袋中，用pH＝7.0-7.4的磷酸盐缓冲液透析。

4.一种快速检测MS-222的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将待测样品与磁纳米探针混合后反应1-30min；所述的磁纳米探针为偶联了MS-222单抗的超顺磁性纳米颗粒；

(2)加入层析液充分混匀5-60s，滴加到权利要求1-3任一项所述至磁性免疫层析试纸条的样品垫上；

(3)定性或定量判断结果。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的磁纳米探针制备方法为，用1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺将超顺磁性纳米颗粒与MS-222单抗共价连接。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的超顺磁性纳米颗粒的粒径为100-300nm。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的层析液是含5％-20％质量比BSA和1％-5％体积比吐温-20的PBS缓冲液，pH＝7.0-8.0。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)的定性判断结果方法为：比较样品与阴性对照检测线的颜色深度判定阴阳性结果，若样品检测线的颜色接近或深于阴性对照则为阴性结果，检测线颜色浅于阴性对照或者没有显色则为阳性结果；

步骤(3)的定量判断结果方法为仪器定量测定，使用磁信号分析仪测定检测线和质控线上结合的磁珠含量，并计算两者比值T/C，根据样品与阴性对照间T/C的比值B/B₀建立标准曲线，由此计算出样品中MS-222的含量。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中磁纳米探针的制备方法包括以下步骤：

A)取超顺磁性磁纳米颗粒用活化缓冲液清洗；

B)加入质量比为1：1-2的EDC和NHS加入含有磁珠的离心管中，垂直旋转混匀10～60min；EDC与超顺磁性磁纳米颗粒的用量比为0.01-0.1：1；

C)加入MS-222单抗，充分振荡，垂直旋转混匀1-5h；MS-222单抗与超顺磁性磁纳米颗粒用量比为0.005-0.1：1。

D)用BSA将上述磁纳米探针表面未反应的基团封闭。

10.一种快速检测MS-222的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的磁性免疫层析试纸条和磁纳米探针；所述的磁纳米探针为偶联了MS-222单抗的超顺磁性纳米颗粒。

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