CN112725365A - Bnam79 epsps抗草甘膦基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了BNAM79EPSPS抗草甘膦基因及其应用。本发明根据AM79EPSPS不同区域的活性分析及双子叶植物(油菜)基因组特点，对AM79EPSPS的密码子进行了改造，改造，经过密码子优化的AM79EPSPS基因命名为BNAM79EPSPS。通过对转AM79EPSPS基因及BNAM79EPSPS基因的作物不同转化试验的分析，本发明发现转BNAM79EPSPS基因更容易获得高表达量的转基因作物以及显著提高获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物的几率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因及其应用。
背景技术
大豆是世界上重要的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源。近年，在大豆产业迅速发展，供需矛盾日益严重的形势下，转基因技术己成为大豆新品种培育的重要手段。根据2016年国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)发布的报告(James,2016)，自1996年美国孟山都公司研制的抗草甘膦(glyphosate_resistant，GR)转基因大豆被批准商业化以来，全球转基因大豆种植面积逐年上升，至2016年达到9140万hm2，占全球大豆总面积的78％，占全球转基因作物总种植面积的一半。抗除草剂作物的创制是近代农业生物技术中最活跃、最具成效的领域，抗草甘膦作物则是抗除草剂作物中的核心，其中抗草甘膦转基因大豆居于首位(沈彬等，2018)。
草甘膦作为一种芳香族氨基酸合成过程中的抑制剂，其主要作用靶标是EPSPS，植物中的内源EPSPS基因编码的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸转移酶(EPSPS)是植物体内芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)生物合成途径中的一个关键酶，而这些芳香族氨基酸都是构建细胞蛋白最基本的氨基酸。在这一生物合成途径中，EPSPS酶催化莽草酸-3-磷酸转变为3-烯醇式丙酮酸莽草酸-5-磷酸。除草剂草甘膦可以抑制植物内源EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致细胞死亡(Zabalza et al.,2016)。EPSPS基因广泛存在于细菌、真菌和高等植物中，而在哺乳动物中不存在(崔云云等，2016)。通常来自细菌和高等植物EPSPS基因对草甘膦敏感，目前已从假单胞菌PG2982、根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA和金黄色葡萄球菌(Staphycoccus aureus)等中克隆到具有天然的草甘膦抗性EPSPS基因(Heet al.,2001)。由于CP4-EPSPS基因有高抗草甘膦的特性，目前是使用最广泛的抗性基因。AM79-EPSPS蛋白与应用广泛的CP4 EPSPS蛋白同属于EPSPS家族类蛋白(林敏等，2007)。来自土壤微生物的AM79-EPSPS基因编码的蛋白属于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，氨基酸序列与报道的Agrobacterium sp EPSPS酶的氨基酸序列同源性仅为22％，两者差异性显著。该基因专利“高耐受草甘膦的EPSPS合酶及其编码序列”(专利号：CN200710177090.1)。AM79-EPSPS基因编码产生的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(AM79-EPSPS)蛋白与植物内源性EPSPS蛋白相比，对草甘膦的亲合力大大降低，在草甘膦存在的条件下保证了植物对芳香氨基酸的合成。
转基因技术可以打破生物之间的不亲和性，把外源具有优良性状的基因整合到大豆基因组，培育出抗除草剂、优质等大豆品种，最终达到增加大豆产量的目的。然而现有的AM79 EPSPS基因直接导入大豆，能够筛选出其在大豆中表达量高转化体的概率低，转化体能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率低，如何提高外源基因在转基因植物中表达的稳定性、高效性是转基因研究中的一个亟待解决的重要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因，使其能够获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物的几率显著提高并降低草甘膦药害；
本发明的另外一个目的在于提供BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因，使其能够显著提高在转基因作物中的蛋白表达量；
本发明的另外一个目的在于提供上述抗草甘膦基因在获得抗草甘膦的转基因作物以及重组载体中的相关应用；
本发明的另外一个目的在于提供检测上述抗草甘膦基因的扩增引物。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因，其在AM79 EPSPS抗草甘膦基因(SEQ ID NO:1所示)基础上按照油菜密码子的偏好性进行优化。
本发明按照油菜密码子的偏好性进行优化，改造后的核苷酸序列(SEQ ID NO：2所示或其互补序列)与原始的AM79 EPSPS同源性为79％，而G的含量由原来的25.47％变为24.59％；C的含量也由原来的20.22％变为23.54％；T的含量由原来的27.64％变为25.78％；A的含量由原来的26.67％变为26.08％。
自林敏等发现AM79 EPSPS耐草甘膦基因(专利号：CN200710177090.1)，尚未有其能够使转基因大豆耐受高倍(4倍以上)草甘膦的案例，本发明针对双子叶植物(大豆，油菜)密码子偏好性分别对AM79 EPSPS基因进行了改造。证实了根据大豆密码子改造后的MIAM79EPSPS基因能够获取高耐草甘膦的有效转基因大豆的概率大大提高(专利申请号：CN201910983192.5)。且发现根据油菜密码子的偏好性对该基因进行了改造后的BNAM79EPSPS基因亦能使获取高耐草甘膦的有效转基因大豆的概率大大提高，甚至有优于大豆密码子改造后的MIAM79 EPSPS基因的趋势。通过对转AM79 EPSPS基因及BNAM79 EPSPS基因的大豆不同转化试验的分析，本发明发现转BNAM79 EPSPS基因更容易获得高表达量。
基于上述优异的技术效果，本发明提出了所述抗草甘膦基因在获得抗草甘膦转基因作物中的应用，以及所述抗草甘膦基因在构建抗草甘膦重组载体中的应用。在本发明具体实施方式中，所述作物以大豆作为实验对象。
根据上述应用，本发明提供了一种抗草甘膦重组载体，其含有本发明所述抗草甘膦基因。进一步优选地，含有所述抗草甘膦基因的表达盒。更优选地，所述表达盒包括启动子、信号肽序列和所述抗草甘膦基因。在本发明具体实施方式中，所述启动子为CaMV 35S启动子，所述信号肽为豌豆转运信号肽SP。
此外，本发明还提供了一种获得抗草甘膦转基因作物的方法，将所述抗草甘膦基因按照转基因方法转入作物中。所述转基因方法包括但不限于农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、花粉管通道法和超声波辅助农杆菌转化方法。在本发明具体实施方式中，本发明以大豆为转基因试验对象，通过农杆菌介导法进行转化。
同时，本发明还提供了能够检测BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因的扩增引物，其根据本发明提供序列按照引物设计原则进行设计，本发明具体实施方式中提供了SEQ ID NO:3-4所示序列的扩增引物。
由以上技术方案可知，本发明根据AM79 EPSPS不同区域的活性分析及双子叶植物(油菜)基因组特点，对AM79 EPSPS的密码子进行了改造，改造，经过密码子优化的AM79EPSPS基因命名为BNAM79 EPSPS。通过对转AM79 EPSPS基因及BNAM79 EPSPS基因的作物不同转化试验的分析，本发明发现转BNAM79 EPSPS基因更容易获得高表达量的转基因作物以及显著提高获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物的几率。
附图说明
图1所示为AM79 EPSPS基因植物表达载体图谱；
图2所示为BNAM79 EPSPS基因植物表达载体图谱；
图3所示为转BNAM79 EPSPS基因的大豆检测结果；
图4所示为转AM79 EPSPS基因的大豆检测结果；
图5所示为转AM79 EPSPS基因大豆田间抗性测试结果；
图6所示为转BNAM79 EPSPS基因大豆田间抗性测试结果。
具体实施方式
本发明公开了BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述抗草甘膦基因及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述抗草甘膦基因及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所提供的对比试验各处理组所采用的试剂、材料均相同，且各组除去应有的区别外其他试验条件保持一致。本发明所涉及材料，如无特殊说明均可通过市售途径获得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：AM79 EPSPS密码子的优化
根据AM79 EPSPS不同区域的活性分析及大豆基因组特点，对AM79EPSPS(SEQ IDNO：1)的密码子进行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)与原始的AM79 EPSPS同源性为79％，而G的含量由原来的25.47％变为24.59％；C的含量也由原来的20.22％变为23.54％；T的含量由原来的27.64％变为25.78％；A的含量由原来的26.67％变为26.08％；具体见下表1；
表1
实施例2：优化后BNAM79 EPSPS植物表达载体的构建
按照实施例1的方案分别合成了AM79 EPSPS及密码子优化后的BNAM79EPSPS，同时合成基因的5’端添加了BamHI的酶切位点，3’端添加了SacI的酶切位点。利用BamHI、SacI消化合成的DNA，回收目标基因片段，并在序列两端分别引入BamHI和SacI酶切位点；克隆豌豆转运信号肽SP序列(SEQ ID NO:5所示)，并在序列两端分别引入PstI和BamHI酶切位点。克隆CaMV 35S启动子序列(SEQ ID NO:6所示)，并在序列两端分别引入HindIII和PstI酶切位点。
BamHI+SacI处理AM79 EPSPS及密码子优化后的BNAM79 EPSPS序列和PUC19载体并连接，获得BNAM79 EPSPS-PUC19载体和AM79EPSPS-PUC19载体。PstI+BamHI处理SP序列和BNAM79 EPSPS-PUC19载体及AM79 EPSPS-PUC19载体并连接，获得SP-BNAM79 EPSPS-PUC19载体和SP-AM79 EPSPS-PUC19。
HindIII+PstI酶切处理CaMV 35S启动子序列并将其连入用HindIII+PstI处理的SP-BNAM79 EPSPS-PUC19载体及SP-AM79 EPSPS-PUC19，获得P35S-BNAM79 EPSPS-PUC19载体和P35S-AM79 EPSPS-PUC19载体。
AseI+BstEII处理pCAMBIA3301载体和左端为AseI+HindIII、右端为SacI+BstEII的DNA片段，连接后获得改造后的pCAMBIA3301载体。
HindIII+SacI酶切P35S-MIAM79 EPSPS-PUC19载体及P35S-AM79EPSPS-PUC19载体和改造后的pCAMBIA3301载体，接入pCAMBIA3301载体，获得命名为bnam79-pC3301(图2)和am79-pC3301(图1)的载体。
实施例3：抗草甘膦基因BNAM79 EPSPS在转基因大豆中的表达
1、转BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因大豆的获得
转基因大豆的获得方法为农杆菌介导的遗传转化方法，主要参考美国Iowa StateUniversity，Plant Transformation Facility使用的转化方法(Paz et a1.,2004)，并对其进行了优化。以大豆子叶节为外植体借助植物组织培养技术，获得大豆再生植株，再通过PCR检测的方法筛选出转基因大豆植株。具体方法为：
(1)大豆消毒
挑选种皮无裂痕饱满的干豆平铺在无菌培养皿中，将放置干豆的培养皿放在密封状态良好的干燥器中(开盖放置，同时培养皿的盖子一并竖放在干燥器内)，将75毫升次氯酸钠溶液放在100ml的小烧杯中，并将小烧杯放在干燥器内，移液枪取3ml浓盐酸加入放有次氯酸钠溶液的烧杯中，并迅速盖好干燥器的盖子，密闭消毒6-8h。
(2)预赔养
消毒结束后，将大豆接种在预培养基上，见光预培养18-24h。挑取无菌，活性好的萌发豆置于无菌瓶中，浸泡2-4h，倒掉无菌水，用无菌滤纸吸取多余水分，并用解剖刀从种脐处对半切开去掉种皮，切掉一半下胚轴，留取带胚的一半子叶，置于无菌瓶中备用。
(3)菌液的准备
转化前一天在YEP液体培养基(含双抗生素)中添加菌液，进行活化和扩增，28℃、180r摇床暗培养15-17h，摇好的菌液用5000r，10min离心收集菌体，倒掉上层清液，用BG液体培养基将菌体重悬。
(4)浸染及共培养
将准备好的豆瓣用重悬液浸没，常温下放置30min，每隔十分钟摇一下，倒掉菌液，将豆瓣放在垫有无菌滤纸的培养皿上，吸去多余的菌液，然后将豆瓣接种在共培养基上，23℃暗培养3d。
(5)筛选培养
共培养结束后，将子叶节接种到含有100μmol/L草甘膦的筛选培养基上。每个培养皿接种7个，光下培养14-15d作为一轮筛选，一轮筛选结束，将子叶节取出切除长势明显的胚芽，移入新鲜的筛选培养基作为二轮筛选培养，每个培养皿接种7个，二轮筛选14-15d。
(6)芽伸长培养
二轮筛选结束，挑选萌发出丛生芽的子叶节，并将子叶切除，下胚轴切出新的伤口，接入伸长培养基中，伸长培养在8周左右，每15d更换一次新鲜培养基。在伸长培养基上待丛生芽长至2-3厘米左右，将芽体切下移至生根培养基中进行生根培养。
(7)生根培养
切下的大豆幼苗根部蘸过1mg/mL浓度的IBA溶液后插入生根培养基中进行生根培养，每15d继代一次培养基。
(8)移栽
待幼苗长出3条以上根系后进行移栽至营养土中。
(9)PCR检测
移栽成活后的幼苗大约在1周左右长出新叶，取一片新叶做检测材料，进行PCR鉴定。根据基因序列，利用Primer 5.0软件分别设计上游引物bnAM-F和下游引物bnAM-R，引物序列为bnAM-F:5'-TCTAAGGCAACAGAATACCAC-3'(SEQ ID NO：3所示)，bnAM-R:5'-GTAATCCTCGTTATGCTCCA-3'(SEQ ID NO：4所示)。PCR反应体系为20μL反应体系：基因组DNA1.0因组；2×TSINGKE master mix(杭州擎科生物科技有限公司)10.0μL；bnAM-F 0.5μL；bnAM-R 0.5μL；ddH2O 8.0μL。程序为：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，30循环后72℃延伸10min。图3表示18个不同BNAM79 EPSPS基因转化植株(表2)均有目标基因的整合。泳道M为DNA分子量标记DL5000，泳道N为野生型大豆阴性对照，P为质粒DNA阳性对照，W为水，泳道1-18为不同的转化事件，可以扩增出678bp左右大小特异片段的即为含有目标基因的转基因阳性植株。
转AM79 EPSPS大豆的检测上游引物为：AM-F:5’-CCGAAGAGACGGTCACCATT-3’，下游引物为AM-R:5’-TACCCGAATCGGTGCATCTG-3’，图4表示18个AM79 EPSPS基因不同转化植株(表2)均有目标基因的整合。泳道M为DNA分子量标记DL5000，泳道N为野生型大豆阴性对照，P为质粒DNA阳性对照，W为水，泳道1-18为不同的转化事件，可以扩增出794bp左右大小特异片段的即为含有目标基因的转基因阳性植株。
表2
2、转基因大豆田间草甘膦抗性测试
于田间控制环境下对获得的18个转AM79 EPSPS基因转化事件和18个转BNAM79EPSPS基因转化事件进行4倍浓度草甘膦(商品化的41％草甘膦异丙胺盐溶剂)，根据中国农业部2031号公告－1－2013(转基因植物及其产品环境安全检测耐除草剂大豆)判定其药害情况，具体药害情况见表3。
表3
由表3结果可以看出，转化BNAM79 EPSPS基因的植株可以获得多个没有药害的拥有足够的草甘膦抗性的转基因植株，而转化AM79 EPSPS基因的植株全部存在高受害率；同时，有药害的转化BNAM79 EPSPS基因的植株，在受害率上也是显著低于转化AM79 EPSPS基因的植株。以上结果充分说明，经过优化改造的BNAM79 EPSPS基因可以显著提高获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物(完全没有药害的植株)的几率，同时降低有药害的植株的草甘膦受害率。
本发明对AM79 EPSPS及BNAM79 EPSPS基因分别构建了植物转化载体并转化了大豆，各获得了18个转化事件(表2)，命名方式为自主命名。通过对这些转化事件田间抗性鉴定结果表明：转化AM79 EPSPS基因的18个转化事件在喷施4倍浓度草甘膦后，均有不同的药害产生。见图5转AM79 EPSPS基因的大豆田间抗性鉴定结果，CK为未喷施草甘膦的植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN018G、WYN043G)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。而转化BNAM79EPSPS基因的18个转化事件在喷施4倍浓度草甘膦后，有10个转化事件(WYN011GBA、WYN012GBA、WYN069GBA、WYN088GBA、WYN089GBA、WYN131GBA、WYN175GBA、WYN220GBA、WYN268GBA、WYN283GBA)生长没有受到任何程度的影响，见图6转BNAM79 EPSPS基因的大豆田间抗性鉴定结果，CK为未喷施草甘膦的植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN011GBA、WYN012GBA)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。这说明优化后的BNAM79 EPSPS基因更容易获得有效的转化事件。
同时，本发明将CN201910983192.5获得的19个转MIAM79 EPSPS基因大豆植株的受害率结果(见表4)与本发明对比，发现改造后的BNAM79 EPSPS基因更适合在大豆中表达，甚至有优于大豆密码子改造后的MIAM79 EPSPS基因的趋势。
表4
由表4可以看出，随着时间的推移，19个转MIAM79 EPSPS基因大豆植株中完全没有药害的植株由11个降至6个，而表3中18个转BNAM79 EPSPS基因的植株中完全没有药害的植株一直保持在初始的10个；而且，19个转MIAM79 EPSPS基因大豆植株的草甘膦受害率逐渐上升，而表3中18个转BNAM79 EPSPS基因的植株的草甘膦受害率逐渐下降；上述两方面结果可以说明，改造后的BNAM79 EPSPS基因更适合在大豆中表达，甚至有优于大豆密码子改造后的MIAM79 EPSPS基因的趋势。
3、目的基因蛋白表达量检测
通过ELISA检测的方法对喷施草甘膦后的18个转AM79 EPSPS基因转化事件和18个转BNAM79 EPSPS基因转化事件进行蛋白表达量检测，分别取每个事件从上到下第二片叶及从上到下第二节茎作为样品，每个事件设置3个重复。采用t检验的方法对两个基因不同事件相同组织的蛋白表达量进行差异性分析(P<0.05)，结果如表5密码子优化前后蛋白表达量(ng/g.fwt)分析所示，优化前后蛋白表达量差异显著，密码子优化后其在大豆的叶和茎组织的蛋白表达量分别明显高于优化前，在叶片中的表达量约为优化前的44倍，在茎组织的表达量约为优化前的65倍，甚至高于根据大豆密码子偏好性改造EPSPS基因密码子(专利申请号：201910983192.5)，这说明本发明优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在大豆中表达，而优化后的BNAM79 EPSPS基因更容易获得有效的转化事件，主要取决于优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在大豆中表达。
表5密码子优化前后18个事件的平均蛋白表达量(ng/g.fwt)分析
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江新安化工集团股份有限公司
<120> BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因及其应用
<130> MP2007846
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcacatt ctacctctag gtccccatgg tccaaggcta ctgagtacca tgaggcactt 60
gtaacaccaa cctcgaacaa gattaacggt gaaatatttg tacctggctc aaagagctat 120
accaatcgag ctctaatcat tgctgcttta gcagagggga cttctacact taagggaata 180
ttaaagagtg atgattccta ctggtgtatt gatgccttaa ggaggcttgg cattaagatc 240
gaggttgccg aagagacggt caccattcat ggctgtggag gaaaatggcc agttcaatct 300
gcagagcttt ttattggggc tgcaggtacc attgcccgct tccttccagg agccttagct 360
gttgcccagc aaggggagtg gatcgtagat ggggttccac aactgcgaga aagaccatta 420
aaacctttag tggatgcctt aactcagctt ggtggtagaa tagagtatct gactgagcat 480
ccgggtctgc ctttacgagt aaagggggca ggtctaagtg gacagcatgt aagggtgcca 540
ggaaatgtct ctagccaatt tttaagtggt ttattaatcg ccagtcctta tgcctcagaa 600
gctgtcagca ttgaggtaat caatggactc gttcaaccgt cttacattgc cattacgatt 660
cagttaatga gagaatttgg tgccaaagtg gagcataatg aggattacag tctctttaag 720
gtttacccta ctggatacca aggtcgtgat accatacttg aggcagatgc ttcaacagcc 780
tgctattttc tatccttagc agcgttaact ggaggtacca tccaggtgaa gaatgttggc 840
tatcattcgt atcagccaga tgctcgtttc attgatgtgt tagagcaaat gggctgtgaa 900
gtgattaaga atgagtcatt cctagaggtt acaggcccaa cccgattaaa gggtggcttc 960
gaggtggata tgaagcctat gtctgaccaa gcgttgacca taggcgcatt agctcctttt 1020
gcagatgcac cgattcgggt aaccaatgtc gctcacatta gggctcatga gtcagaccgg 1080
atagctgtta tttgttcctc gttacagcag atgggagttc aggtagagga gagagaggat 1140
ggctttacta tctatccagg tcagccagtg ggtacaacgc ttaatcctca tgatgatcat 1200
cgtaatgcaa tggtattcgg tttacttgga gtaaaagtac cacatattag aatagtcgat 1260
ccgggttgtg tatctaagac ctgcccagcc tattttgaag agctgcagaa gtttggaata 1320
catgtggagt ataattga 1338
<210> 2
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtcccact ctacatcccg tagtccatgg tctaaggcaa cagaatacca cgaggcattg 60
gttactccta catccaacaa gatcaacggt gagatcttcg tccctggtag taagtcatat 120
accaacaggg cactgatcat cgcagcactg gcagaaggaa catcaacact gaagggaatc 180
ctgaagtccg atgattctta ctggtgcatc gacgctttga gaagattagg catcaagatt 240
gaggtggctg aggagacagt gactattcac ggttgcggag ggaaatggcc agttcaaagt 300
gctgagttgt ttatcggtgc tgctggaact atcgctagat tcttgcctgg tgcacttgct 360
gttgcacaac aaggtgaatg gatagttgat ggtgttcctc agttaaggga aaggccactc 420
aagccattgg tggatgcatt gacacagctt ggtggaagaa tcgaatacct cacagaacac 480
cctggacttc ctttgagagt gaaaggtgca ggtttatcag gacagcacgt aagagttcct 540
ggtaacgttt cctcacagtt cctgtccgga ttactcatcg catctcctta cgctagtgaa 600
gctgtaagca tcgaagttat caacggactc gttcagcctt cttacatcgc tataaccatt 660
cagctcatgc gtgagttcgg ggctaaagtg gagcataacg aggattacag cctcttcaaa 720
gtctacccaa ccggatacca ggggagagat actattctcg aggctgatgc ttctaccgct 780
tgttactttc tcagccttgc tgcccttact ggaggtacta tacaggttaa gaacgtgggt 840
tatcatagct atcagccaga cgctcgtttc attgacgtct tagagcaaat ggggtgcgag 900
gtcataaaga atgagagctt cctcgaggtg actggaccaa ctagacttaa aggcggattc 960
gaggttgata tgaaaccaat gtctgaccaa gccctcacca taggcgcttt ggcccccttt 1020
gccgatgccc ctattagggt aaccaacgtt gcccatattc gtgcccatga atctgatagg 1080
attgccgtta tatgttcaag tcttcaacaa atgggagtac aagtggagga gcgtgaagac 1140
gggtttacca tatatcctgg acaaccagtg ggcactaccc ttaatcccca tgacgaccat 1200
aggaatgcca tggtgtttgg gcttcttggc gtcaaagtcc cccacattcg tattgtcgac 1260
cccggctgtg tctcaaagac ctgtcccgcc tatttcgaag aattgcaaaa atttggcatt 1320
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctaaggcaa cagaatacca c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa 60
tccgccgcag tggctccatt cggaggcctg aaatccatga ctggattccc agtgaagaag 120
gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg c 171
<210> 6
<211> 539
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcatggagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact cgccgtaaag actggcgaac 60
agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg 120
agcacgacac acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg 180
caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag 240
ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc 300
attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg 360
gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 420
aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 480
cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagagaaca cgggggact 539
Claims (10)
1.BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因，其特征在于，在AM79 EPSPS抗草甘膦基因基础上按照油菜密码子的偏好性进行优化。
2.根据权利要求1所述抗草甘膦基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO:2所示或其互补序列。
3.权利要求1或2所述抗草甘膦基因在获得抗草甘膦转基因作物中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述作物为大豆。
5.权利要求1或2所述抗草甘膦基因在构建抗草甘膦重组载体中的应用。
6.一种抗草甘膦重组载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述抗草甘膦基因。
7.根据权利要求6所述重组载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述抗草甘膦基因的表达盒。
8.根据权利要求7所述重组载体，其特征在于，所述表达盒包括启动子、信号肽序列和权利要求1或2所述抗草甘膦基因。
9.一种获得抗草甘膦转基因作物的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述抗草甘膦基因按照转基因方法转入作物中。
10.检测BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因的扩增引物。
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| CN101429499A (zh) * | 2007-11-09 | 2009-05-13 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列 |
| CN102776161A (zh) * | 2012-08-14 | 2012-11-14 | 浙江新安化工集团股份有限公司 | 分离自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其编码序列的制备和用途 |
| CN110564741A (zh) * | 2019-10-16 | 2019-12-13 | 浙江新安化工集团股份有限公司 | 基因及其抗草甘膦除草剂的应用 |
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2021
- 2021-01-13 CN CN202110045552.4A patent/CN112725365B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN114606249A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-06-10 | 浙江新安化工集团股份有限公司 | 编码am79 epsps蛋白的核酸分子及其应用 |
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