CN110564741A

CN110564741A - 基因及其抗草甘膦除草剂的应用

Info

Publication number: CN110564741A
Application number: CN201910983192.5A
Authority: CN
Inventors: 何军光; 翁嘉慧; 楼亿圆; 徐京; 赵振宁; 周骏; 苗昱婷; 蒋红叶; 费月新; 王云铃; 张呈祥
Original assignee: Zhejiang Xinan Chemical Industrial Group Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Xinan Chemical Industrial Group Co Ltd
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-10-16
Also published as: CN110564741B

Abstract

本发明涉及农业技术领域，特别涉及基因及其抗草甘膦除草剂的应用。本发明通过根据大豆密码子的偏好性对该基因进行了适当的改造，发现改造后的MIAM79 EPSPS基因更适合在大豆中表达，显著提高了蛋白的表达量，并且获取高耐草甘膦的有效转基因大豆事件的概率大大提高。

Description

基因及其抗草甘膦除草剂的应用

技术领域

本发明涉及农业技术领域，特别涉及基因及其抗草甘膦除草剂的应用。

背景技术

1996年，美国孟山都公司成功的研究出耐除草剂转基因大豆，耐除草剂转基因大豆在美国、阿根廷、巴西等国迅速普及，种植面积迅速扩大。而在所有转基因大豆的性状中，耐除草剂性状一直占主导地位。截至2017年5月，全球共有36个转基因大豆转化事件，其中抗除草剂转基因大豆转化事件28个，占转基因大豆转化事件的77.8％。

草甘膦具有有良好的内吸收性和低毒性，能够与土壤结合紧密，并且其结构简单，是杀草谱最广的芽后除草剂。其作用于莽草酸途径，抑制叶绿体酶5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)。EPSPS广泛存在于真菌、细菌、藻类、高等植物的叶绿体内，参与芳香族氨基酸的生物合成。在草甘膦的作用下，莽草酸途径的反馈抑制受阻，导致莽草酸的大量积累，芳香族氨基酸的合成极大的减弱，随之使得植物死亡。但是，草甘膦是一种非选择性除草剂，这个特性极大限制了它的使用时间和范围。所以，人们一直在致力于抗草甘膦作物的研究和培育工作，从20世纪80年代开始，人们开始借助于重组DNA技术来开发抗草甘膦作物。抗草甘膦基因的原理和机制主要有以下三方面：一是促使EPSPS基因超量表达，如Shah等从牵牛花中克隆出EPSPS基因cDNA序列，构建表达载体，转入牵牛花中，使其具有草甘膦抗性。但这种抗性比较弱，并不能满足商业化要求；二是转入一个与草甘膦亲和性低的EPSPS基因，如Bayer公司通过在玉米中表达突变的EPSPS基因从而获得抗草甘膦转基因玉米GA21。这类基因是用于商业化应用的主要基因。三是导入一个降解草甘膦的基因。1995年Penaloza等克隆到草甘膦降解基因glpA和glpB，导入对草甘膦敏感的大肠杆菌中使之具有草甘膦降解的能力

最早的EPSPS基因专利是美国的Calgene公司1983年1月1日在美国申请的。目前，已经产业化的抗草甘膦转基因作物几乎全部为转农杆菌基因，CP4 EPSPS基因是孟山都公司克隆的并在1994年申请了相关专利(专利号：US5633435)，2014年过期。AM79-EPSPS基因编码的蛋白属于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，氨基酸序列与报道的Agrobacterium sp EPSPS酶的氨基酸序列同源性仅为22％，两者差异性显著。该基因专利“高耐受草甘膦的EPSPS合酶及其编码序列”。AM79-EPSPS蛋白与应用广泛的CP4 EPSPS蛋白同属于EPSPS家族类蛋白。

植物中的内源EPSPS基因编码的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸转移酶(EPSPS)是植物体内芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)生物合成途径中的一个关键酶，而这些芳香族氨基酸都是构建细胞蛋白最基本的氨基酸。在这一生物合成途径中，EPSPS酶催化莽草酸-3-磷酸转变为3-烯醇式丙酮酸莽草酸-5-磷酸。除草剂草甘膦可以抑制植物内源EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致细胞死亡。来自于土壤的AM79-EPSPS基因编码产生的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(AM79-EPSPS)蛋白与植物内源性EPSPS蛋白相比，对草甘膦的亲合力大大降低，在草甘膦存在的条件下保证了植物对芳香氨基酸的合成。

将现有的AM79 EPSPS基因直接导入大豆，能够筛选出其在大豆中表达量高转化体的概率低，转化体能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率低。因此，提供一种改造后的基因，使得筛选出高表达量转化体的概率和转化体能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率大大提高，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了基因及其抗草甘膦除草剂的应用。本发明根据大豆密码子的偏好性对AM79 EPSPS基因的部分密码子进行了修改，能够筛选出高表达量转化体的概率和转化体能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率大大提高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基因(MIAM79 EPSPS)，具有：

(Ⅰ)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补序列；或

(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或

(Ⅳ)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个核苷酸序列为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个。

在上述研究的基础上，本发明还提供了一种含有所述基因的重组DNA。

本发明还提供了一种表达载体，插入所述的重组DNA，并以微生物、动物细胞或植物细胞作为宿主细胞。

本发明还提供了一种由所述的表达载体转化的转化子。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述基因抗草甘膦除草剂的应用。

本发明还提供了所述基因增强大豆对草甘膦除草剂抗性的应用。

本发明还提供了所述基因在提高蛋白表达量中的应用。

本发明还提供了获得抗草甘膦除草剂的大豆的方法，将所述基因转入大豆植株，筛选。

本发明还提供了一种检测转入所述基因的大豆的引物组或试剂盒，包括能够扩增所述基因的引物，所述引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

核酸是生物遗传信息的载体，蛋白质是发挥生物功能的主要分子，其使用情况具有重要的生物学意义，所以密码子偏好性现象在许多生物学领域中受到关注。不同物种或同一物种的不同基因对密码子的偏好有所不同。要实现目的基因在外源表达系统下的成功表达和提高其表达量，可通过增加目的基因剂量，目的基因密码子优化，改善培养条件等方法实现，其中目的基因密码子优化起到关键作用。本发明中通过研究分析大豆基因组的密码子偏好性，为AM79-EPSPS基因在大豆作物中的提升表达量提供途径。

本发明通过根据大豆密码子的偏好性对该基因进行了适当的改造，发现改造后的MIAM79 EPSPS基因更适合在大豆中表达，能够获取高耐草甘膦的有效转基因大豆事件的概率大大提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示AM79-pC3301的载体；

图2示MIAM79-pC3301的载体；

图3示19个不同MIAM79 EPSPS基因转化事件均有目标基因的整合；其中，泳道M为NAN分子量标记DL5000，泳道N为野生型大豆阴性对照，P为质粒DNA阳性对照，W为水，泳道1-19为不同的转化事件——泳道1为WYN001GMA；泳道2为WYN009GMA；泳道3为WYN011GMA；泳道4为WYN016GMA；泳道5为WYN029GMA；泳道6为WYN044GMA；泳道7为WYN050GMA；泳道8为WYN066GMA；泳道9为WYN076GMA；泳道10为WYN078GMA；泳道11为WYN112GMA；泳道12为WYN179GMA；泳道13为WYN180GMA；泳道14为WYN237GMA；泳道15为WYN251GMA；泳道16为WYN258GMA；泳道17为WYN282GMA；泳道18为WYN303GMA；泳道19为WYN336GMA；

图4示18个AM79 EPSPS基因不同转化事件均有目标基因的整合；其中，泳道M为NAN分子量标记DL5000，泳道N为野生型大豆阴性对照，P为质粒DNA阳性对照，W为水，泳道1-18为不同的转化事件——泳道1为WYN002G；泳道2为WYN013G；泳道3为WYN018G；泳道4为WYN043G；泳道5为WYN075G；泳道6为WYN080G；泳道7为WYN143G；泳道8为WYN166G；泳道9为WYN189G；泳道10为WYN191G；泳道11为WYN201G；泳道12为WYN235G；泳道13为WYN256G；泳道14为WYN288G；泳道15为WYN328G；泳道16为WYN347G；泳道17为WYN354G；泳道18为WYN389G；

图5示转AM79 EPSPS基因的大豆田间抗性鉴定结果，CK为未喷施草甘膦的植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN002G、WYN013G)喷施4倍浓度草甘膦后的植株；

图6示转MIAM79 EPSPS基因的大豆田间抗性鉴定结果，CK为未喷施草甘膦的植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN001GMA、WYN009GMA)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。

具体实施方式

本发明公开了一种基因及其抗草甘膦除草剂的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的基因及其抗草甘膦除草剂的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1AM79 EPSPS密码子的优化

根据AM79 EPSPS不同区域的活性分析及大豆基因组特点，我们对AM79 EPSPS(如SEQ ID No.1所示)的密码子进行了改造，改造后的核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)与原始的EPSPS同源性仅为81％，而G的含量由原来的25.47％变为31.77％；C的含量也由原来的20.22％变为33.93％；T的含量由原来的27.64％变为16.33％；A的含量由原来的26.67％变为17.79％。

表1

实施例2优化后MIAM79 EPSPS植物表达载体的构建

按照实施例1的方案分别合成了AM79 EPSPS及密码子优化后的MIAM79EPSPS，同时合成基因的5’端添加了BamHI的酶切位点，3’端添加了SacI的酶切位点。利用BamHI、SacI消化合成的DNA，回收目标基因片段，并在序列两端分别引入BamHI和SacI酶切位点；克隆豌豆转运信号肽SP序列，并在序列两端分别引入PstI和BamHI酶切位点。克隆CaMV 35S启动子序列，并在序列两端分别引入HindIII和PstI酶切位点。

BamHI+SacI处理AM79 EPSPS及密码子优化后的MIAM79 EPSPS序列和PUC19载体并连接，获得MIAM79 EPSPS-PUC19载体和AM79 EPSPS-PUC19载体。PstI+BamHI处理SP序列和MIAM79 EPSPS-PUC19载体及AM79 EPSPS-PUC19载体并连接，获得SP-MIAM79 EPSPS-PUC19载体和SP-AM79 EPSPS-PUC19。

HindIII+PstI酶切处理CaMV 35S启动子序列并将其连入用HindIII+PstI处理的SP-MIAM79 EPSPS-PUC19载体及SP-AM79 EPSPS-PUC19，获得P35S-MIAM79 EPSPS-PUC19载体和P35S-AM79 EPSPS-PUC19载体。

AseI+BstEII处理pCAMBIA3301载体和左端为AseI+HindIII、右端为SacI+BstEII的DNA片段，连接后获得改造后的pCAMBIA3301载体。

HindIII+SacI酶切P35S-MIAM79 EPSPS-PUC19载体及P35S-AM79 EPSPS-PUC19载体和改造后的pCAMBIA3301载体，接入pCAMBIA3301载体，获得命名为MIAM79-pC3301(图2)和AM79-pC3301(图1)的载体。

实施例3抗草甘膦基因MIAM79 EPSPS在转基因大豆中的表达

1、转MIAM79 EPSPS抗草甘膦基因大豆的获得

转基因大豆的获得方法为农杆菌介导的遗传转化方法，主要参考美国Iowa StateUniversity,Plant Transformation Facility使用的转化方法(Paz et a1.,2004)，并对其进行了优化。以大豆子叶节为外植体借助植物组织培养技术，获得大豆再生植株，再通过PCR检测的方法筛选出转基因大豆植株。具体方法为：

(1)大豆消毒

挑选种皮无裂痕饱满的干豆平铺在无菌培养皿中，将放置干豆的培养皿放在密封状态良好的干燥器中(开盖放置，同时培养皿的盖子一并竖放在干燥器内)，将75ml次氯酸钠溶液放在100ml的小烧杯中，并将小烧杯放在干燥器内，移液枪取3ml浓盐酸加入放有次氯酸钠溶液的烧杯中，并迅速盖好干燥器的盖子，密闭消毒6-8h。

(2)预赔养

消毒结束后，将大豆接种在预培养基上，见光预培养18-24h。挑取无菌，活性好的萌发豆置于无菌瓶中，浸泡2-4h，倒掉无菌水，用无菌滤纸吸取多余水分，并用解剖刀从种脐处对半切开去掉种皮，切掉一半下胚轴，留取带胚的一半子叶，置于无菌瓶中备用。

(3)菌液的准备

转化前一天在YEP液体培养基(含双抗生素)中添加菌液，进行活化和扩增，28℃180r摇床暗培养15-17h，摇好的菌液用5000r，10min离心收集菌体，倒掉上层清液，用BG液体培养基将菌体重悬。

(4)浸染及共培养

将准备好的豆瓣用重悬液浸没，常温下放置30min，每隔十分钟摇一下，倒掉菌液，将豆瓣放在垫有无菌滤纸的培养皿上，吸去多余的菌液，然后将豆瓣接种在共培养基上，23℃暗培养3d。

(5)筛选培养

共培养结束后，将子叶节接种到含有100μmol/L草甘膦的筛选培养基上。每个培养皿接种7个，光下培养14-15d作为一轮筛选，一轮筛选结束，将子叶节取出切除长势明显的胚芽，移入新鲜的筛选培养基作为二轮筛选培养，每个培养皿接种7个，二轮筛选14-15d。

(6)芽伸长培养

二轮筛选结束，挑选萌发出丛生芽的子叶节，并将子叶切除，下胚轴切出新的伤口，接入伸长培养基中，伸长培养在8周左右，每15d更换一次新鲜培养基。在伸长培养基上待丛生芽长至2-3厘米左右，将芽体切下移至生根培养基中进行生根培养。

(7)生根培养

切下的大豆幼苗根部蘸过1mg/mL浓度的IBA溶液后插入生根培养基中进行生根培养，每15d继代一次培养基。

(8)移栽

待幼苗长出3条以上根系后进行移栽至营养土中。

(9)PCR检测

移栽成活后的幼苗大约在1周左右长出新叶，取一片新叶做检测材料，进行PCR鉴定。根据基因序列，利用Primer 5.0软件分别设计上游引物miAM-F和下游引物miAM-R，引物序列为miAM-F:5'-CTGTGACAACAGTCAGCCGT-3'，(如SEQ ID No.3所示)miAM-R:5'-GGTGTTCCGTCAGGTACTCG-3'(如SEQ ID No.4所示)。PCR反应体系为20μL反应体系：基因组DNA1.0因组；2×TSINGKE master mix(杭州擎科生物科技有限公司)10.0μL；mAM-F 0.5μL；mAM-R 0.5μL；ddH2O 8.0μL。程序为：94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，30循环后72℃延伸10min。图3表示19个不同MIAM79 EPSPS基因转化事件均有目标基因的整合。

转AM79 EPSPS大豆的检测上游引物为：5’CCTTACCGTCGAGACGGATGC 3’(如SEQ IDNo.5所示)，下游引物为5’CGGCCATCAGGTCCATGAACT 3’(如SEQ ID No.6所示)，图4表示18个AM79 EPSPS基因不同转化事件均有目标基因的整合。

泳道M为NAN分子量标记DL5000，泳道N为野生型大豆阴性对照，P为质粒DNA阳性对照，W为水，泳道1-19为不同的转化事件，可以扩增出645bp左右大小特异片段的即为含有目标基因的转基因阳性植株。

2、转基因大豆田间草甘膦抗性测试

于田间控制环境下对获得的18个AM79 EPSPS基因转化事件和19个MIAM79 EPSPS基因转化事件进行4倍浓度草甘膦(商品化的41％草甘膦异丙胺盐溶剂)，根据中国农业部2031号公告－1－2013(转基因植物及其产品环境安全检测耐除草剂大豆)判定其药害情况，植株没有药害的条件下表明该转基因植株拥有足够的草甘膦抗性。我们对AM79 EPSPS及MIAM79 EPSPS基因分别构建了植物转化载体并转化了大豆，各获得了18个和19个转化事件(表2)，通过对这些转化事件田间抗性鉴定结果表明：转化AM79 EPSPS基因的18个转化事件在喷施4倍浓度草甘膦后，均有不同的药害产生。图5.转AM79 EPSPS基因的大豆田间抗性鉴定结果，CK为未喷施草甘膦的植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN002G、WYN013G)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。而转化MIAM79 EPSPS基因的19个转化事件在喷施4倍浓度草甘膦后，有11个转化事件(WYN001GMA、WYN009GMA、WYN016GMA、WYN029GMA、WYN076GMA、WYN078GMA、WYN112GMA、WYN180GMA、WYN251GMA、WYN258GMA、WYN303GMA)生长没有受到任何程度的影响，图6.转MIAM79 EPSPS基因的大豆田间抗性鉴定结果，CK为未喷施草甘膦的植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN001GMA、WYN009GMA)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。这说明优化后的MIAM79 EPSPS基因更容易获得有效的转化事件。

表2获得的转化事件

3、目的基因蛋白表达量检测

通过ELISA检测的方法对喷施草甘膦后的18个AM79 EPSPS基因转化事件(WYN002G、WYN013G、WYN018G、WYN043G、WYN075G、WYN080G、WYN143G、WYN166G、WYN189G、WYN191G、WYN201G、WYN235G、WYN256G、WYN288G、WYN328G、WYN347G、WYN354G、WYN389G)和19个MIAM79 EPSPS基因转化事件进行蛋白表达量检测，分别取每个事件从上到下第二片叶及从上到下第二节茎作为样品，每个事件设置3个重复。采用t检验的方法对两个基因不同事件相同组织的蛋白表达量进行差异性分析(P<0.05)，结果如表3密码子优化前后蛋白表达量(ng/g.fwt)分析所示，优化前后蛋白表达量差异显著,密码子优化后其在大豆的叶和茎组织的蛋白表达量分别明显高于优化前，在叶片中的表达量约为优化前的42倍，在茎组织的表达量约为优化前的54倍，这说明优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在大豆中表达，而优化后的MIAM79 EPSPS基因更容易获得有效的转化事件，主要取决于优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在大豆中表达。

表3密码子优化前后蛋白表达量(ng/g.fwt)分析

注：同行不同字母表示具有极显著差异(P＜0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江新安化工集团股份有限公司

<120> 基因及其抗草甘膦除草剂的应用

<130> MP1914734

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> AM79 EPSPS

<400> 1

atgtcacatt ctacctctag gtccccatgg tccaaggcta ctgagtacca tgaggcactt 60

gtaacaccaa cctcgaacaa gattaacggt gaaatatttg tacctggctc aaagagctat 120

accaatcgag ctctaatcat tgctgcttta gcagagggga cttctacact taagggaata 180

ttaaagagtg atgattccta ctggtgtatt gatgccttaa ggaggcttgg cattaagatc 240

gaggttgccg aagagacggt caccattcat ggctgtggag gaaaatggcc agttcaatct 300

gcagagcttt ttattggggc tgcaggtacc attgcccgct tccttccagg agccttagct 360

gttgcccagc aaggggagtg gatcgtagat ggggttccac aactgcgaga aagaccatta 420

aaacctttag tggatgcctt aactcagctt ggtggtagaa tagagtatct gactgagcat 480

ccgggtctgc ctttacgagt aaagggggca ggtctaagtg gacagcatgt aagggtgcca 540

ggaaatgtct ctagccaatt tttaagtggt ttattaatcg ccagtcctta tgcctcagaa 600

gctgtcagca ttgaggtaat caatggactc gttcaaccgt cttacattgc cattacgatt 660

cagttaatga gagaatttgg tgccaaagtg gagcataatg aggattacag tctctttaag 720

gtttacccta ctggatacca aggtcgtgat accatacttg aggcagatgc ttcaacagcc 780

tgctattttc tatccttagc agcgttaact ggaggtacca tccaggtgaa gaatgttggc 840

tatcattcgt atcagccaga tgctcgtttc attgatgtgt tagagcaaat gggctgtgaa 900

gtgattaaga atgagtcatt cctagaggtt acaggcccaa cccgattaaa gggtggcttc 960

gaggtggata tgaagcctat gtctgaccaa gcgttgacca taggcgcatt agctcctttt 1020

gcagatgcac cgattcgggt aaccaatgtc gctcacatta gggctcatga gtcagaccgg 1080

atagctgtta tttgttcctc gttacagcag atgggagttc aggtagagga gagagaggat 1140

ggctttacta tctatccagg tcagccagtg ggtacaacgc ttaatcctca tgatgatcat 1200

cgtaatgcaa tggtattcgg tttacttgga gtaaaagtac cacatattag aatagtcgat 1260

ccgggttgtg tatctaagac ctgcccagcc tattttgaag agctgcagaa gtttggaata 1320

catgtggagt ataat 1335

<210> 2

<211> 1341

<212> DNA

<213> MIAM79 EPSPS

<400> 2

atgagccaca gcacgtccag gtcgccgtgg tccaaggcga cggagtacca cgaggccctg 60

gtcacgccca cctcgaataa gatcaacggt gagatcttcg tgcctggctc caagtcctac 120

acgaatcgcg ccctcatcat cgcggccctg gccgaaggga ccagcacgct gaagggcatc 180

ctcaagagcg acgattcgta ctggtgcatc gacgcgctgc gcaggctcgg catcaagatc 240

gaggtcgccg aagagaccgt cacgatccac ggctgcggtg gcaagtggcc ggtgcagtcg 300

gccgagctgt tcatcggcgc cgcaggcacg atcgccaggt tcctgccggg cgccttggcc 360

gtggcgcagc agggcgagtg gatcgtggac ggcgtgccgc agctgcggga acggccgctc 420

aagccgctcg tggacgccct gacccagctg ggcggccgca tcgagtacct gacggaacac 480

ccgggcctcc cgctgcgcgt gaagggcgcg ggcctgtccg ggcaacacgt ccgcgtcccg 540

ggtaacgtgt cctcgcagtt cctgtcgggg ctgctcatcg cctccccgta tgcctcggag 600

gccgtctcca tcgaggtgat caacggcctg gtgcagccct cctacatcgc gatcacgatc 660

cagctcatgc gggagttcgg cgctaaggtg gagcacaacg aggactactc gctgttcaag 720

gtctacccga ccggctacca gggccgcgat acgattctgg aggcggacgc cagcaccgcc 780

tgctacttcc tgtcgctcgc cgcgctgacg ggcggcacca tccaggtgaa gaacgtcggc 840

taccattcct atcagccgga cgcgcgcttt atcgacgtgc tcgagcagat gggctgcgag 900

gtgatcaaga acgagtcgtt cctcgaggtc accggcccga cgcgcctcaa gggcggtttc 960

gaggtggaca tgaagccgat gtccgaccaa gccctcacga tcggggccct cgccccgttc 1020

gccgacgccc cgatccgcgt caccaacgtg gcccacatcc gcgcccacga gagcgatcgc 1080

atcgccgtca tctgctcgag cctccagcag atgggcgtcc aggtggagga acgggaggac 1140

ggcttcacga tctacccggg ccagccggtc ggcaccacgc tcaatccgca cgatgaccat 1200

cgcaacgcga tggtgttcgg gctcctgggc gtcaaggtgc cgcacattcg catcgtggac 1260

cctggctgcg tctccaagac gtgcccggct tacttcgaag agcttcagaa gttcggcatc 1320

cacgtggagt acaactagtg a 1341

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgtgacaac agtcagccgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgttccgt caggtactcg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccttaccgtc gagacggatg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggccatcag gtccatgaac t 21

Claims

1.基因，其特征在于，具有：

(Ⅰ)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补序列；或

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述多个核苷酸序列为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个。

3.一种含有如权利要求1或2所述基因的重组DNA。

4.一种表达载体，其特征在于，插入如权利要求3所述的重组DNA，并以微生物、动物细胞或植物细胞作为宿主细胞。

5.一种由如权利要求4所述的表达载体转化的转化子。

6.如权利要求1或2所述基因抗草甘膦除草剂的应用。

7.如权利要求1或2所述基因增强大豆对草甘膦除草剂抗性的应用。

8.如权利要求1或2所述基因在提高蛋白表达量中的应用。

9.获得抗草甘膦除草剂的大豆的方法，其特征在于，将如权利要求1或2所述基因转入大豆植株，筛选。

10.一种检测转如权利要求1或2所述基因的大豆的引物组或试剂盒，包括能够扩增如权利要求1或2所述基因的引物，所述引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。