CN112725181A - 一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，所述制备工艺流程为黑水虻预处理、肠道微生物原液制备、肠道乳酸菌悬液制备、扩大培养制备液态菌剂、固态菌剂制备5个关键步骤，从高峰期黑水虻幼虫肠道中分离纯化出高效乳酸菌制备出高浓度菌剂。本发明不仅首次提出自黑水虻幼虫肠道中成功分离高效乳酸菌并制备菌剂的方法，而且显著克服了目前常规方法中乳酸菌分离效果不稳定、菌剂制备难度大、菌剂浓度低等缺陷。利用该黑水虻肠道乳酸菌固态和液态菌剂可大大提高黑水虻生物转化餐厨垃圾过程的转化效率和生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于菌剂制备技术领域，特别涉及从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法。
背景技术
昆虫肠道系统中寄居的微生物与昆虫的营养生理活动有着密切的关系，并影响昆虫的生命活动，如含有种类繁多的酶系统能参与寄主能力、物质及遗传信息转运等生理活动。昆虫肠道微生物的研究不但有利于昆虫资源的开发利用,而且有利于从昆虫肠道这一特殊环境中获得特殊功能的细菌资源,目前对昆虫肠道微生物的研究零星见于几种重要经济昆虫如家蚕﹑白蚁、蜜蜂等。
黑水虻作为近年来一种新型重要的资源昆虫，其拥有丰富蛋白质和适当的脂肪和微量元素，是联合国粮农组织推荐的饲用昆虫，被认为是优良的人畜蛋白来源。同时，作为腐生性昆虫，黑水虻被大量用于有机废弃物的处理，近年来利用黑水虻对餐厨垃圾进行高效转化资源的报道也越来越多。但是从黑水虻幼虫肠道微生物中分离纯化有益微生物的研究还较少，对于从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌并制备菌剂的报道还未见。
发明内容
本发明正是针对现有技术中存在的问题，提供一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌并制备菌剂的工艺方法，该技术方案中乳酸菌分离效果稳定、菌剂制备简单，菌剂可大大提高黑水虻生物转化餐厨垃圾过程的转化效率和生物安全性，具有良好的应用前景。本发明是通过以下技术方案实现的：
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下，一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，具体步骤如下：
步骤(1)黑水虻预处理：取高峰期黑水虻幼虫预先饥饿处理8-12小时，用自来水和无菌水依次分别冲洗2-3次，然后无菌条件下用75％的乙醇浸泡幼虫1-2min，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡幼虫1-2min，再次用无菌水清洗幼虫2-3次，无菌条件下风干。对黑水虻虫体表面进行灭菌操作，保证虫体表面为无菌状态。
步骤(2)肠道微生物原液制备：无菌条件下对经过预处理的黑水虻幼虫进行解剖。取出虫体肠道后加入1-2mL无菌水研磨，所得肠道研磨液进行涡旋振荡5-10min，而后静置30-60min，取上清液进行10-1-10-5梯度稀释获得肠道微生物原液。该步骤为菌原液的获取，目的是解剖黑水虻得到肠道，然后从肠道中提取乳酸菌，为提取菌的必须步骤。
步骤(3)肠道乳酸菌悬液制备：将不同梯度的肠道微生物原液涂布于MRS培养基平板，37℃下培养20-30h，挑出形态特征及长势较好的乳酸菌经过3-5次划线分离后得到纯化的黑水虻幼虫肠道乳酸菌，最后对纯化菌落用1-2mL无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到肠道乳酸菌悬液，在4℃下保存,该步骤的目的是从黑水虻肠道中获得乳酸菌。
步骤(4)扩大培养制备液态菌剂：将肠道乳酸菌悬液依次接种至15mL、100mL、1L、10LMRS液体培养基于37℃条件下进行扩大培养，获得最终液态菌剂，每轮扩大培养时间均为30-40h,该步骤能够在保证浓度的同时获的大量的乳酸菌菌液。
步骤(5)固态菌剂制备：将液态菌剂按照比例接种至无菌固态培养基中，混匀后用双层医用纱布密封，经30-37℃无菌条件下进行发酵培养24-48h，再置于35℃条件下恒温干燥72h得到黑水虻幼虫肠道乳酸菌高密度固态菌剂,该步骤为固态菌剂的制备步骤，优点是能够方便简单的获得高密度固态菌剂。
进一步地，所述高峰期黑水虻幼虫为4龄幼虫或5龄幼虫前期。
进一步地，所述无菌固态培养基通过将MRS液态培养基与无菌椰渣按质量比3-5：5的比例充分混合后，高压灭菌后得到，无菌固态培养基pH值为5.5-6，粒径为5mm以下。
进一步地，所述乳酸菌液态菌剂与无菌固态培养基的质量比为1-2：1。
进一步地，所述乳酸菌液态菌剂的活菌含量达到1×1012cfu/mL以上，所述乳酸菌固态菌剂的活菌含量达到1×1010cfu/g以上。
进一步地，以0.05％-1％的比例接种应用于黑水虻生物转化餐厨垃圾过程中可将转化效率提高20％以上。
本发明提供的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌制备菌剂的工艺方法，有以下优点：
1)从高峰期黑水虻幼虫肠道中提取乳酸菌制备的浓缩菌剂再应用于黑水虻生物转化餐厨垃圾过程中，适应性强、活性高，缩短微生物的迟滞期，生物转化效率提高20％，应用前景广阔。
2)通过系统专业的分离纯化方法从黑水虻肠中分离乳酸菌效果稳定、乳酸菌分离浓度高。
3)该乳酸菌固态和液态菌剂制备方法工艺简单，对操作设备的要求不高，生产过程中污染少，对环境友好。并且所获固态和液态菌剂活菌浓度都比较高，产业化生产前景广阔。
4)该菌剂应用于黑水虻生物转化餐厨垃圾，能够有效抑制致病菌的生长，实现转化过程的生物安全性和无害化，处理完餐厨垃圾后获得的黑水虻虫粪，可以制作高品质虫粪有机肥。
具体实施方式
实施例1：一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法,
步骤(1)黑水虻预处理：取黑水虻4龄幼虫预先饥饿处理10小时，用自来水和无菌水分别冲洗3次，然后无菌条件下用75％的乙醇浸泡幼虫2min，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡幼虫2min，再次用无菌水清洗幼虫2次，无菌条件下风干。
步骤(2)肠道微生物原液制备：无菌条件下对经过预处理的黑水虻幼虫进行解剖。取出虫体肠道后加入2mL无菌水研磨，所得肠道研磨液进行涡旋振荡5min，而后静置30min，取上清液进行10-1-10-5梯度稀释获得肠道微生物原液。
步骤(3)肠道乳酸菌悬液制备：将不同梯度的肠道微生物原液涂布于MRS培养基平板，37℃下培养24h，挑出形态特征及长势较好的乳酸菌经过3次划线分离后得到纯化的黑水虻幼虫肠道乳酸菌，最后对纯化菌落斑用2mL无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到肠道乳酸菌悬液，在4℃下保存。
步骤(4)扩大培养制备液态菌剂：将肠道乳酸菌悬液依次接种至15mL、100mL、1L、10LMRS液体培养基于37℃条件下进行扩大培养，获得最终液态菌剂。每轮扩大培养时间均为35h，液态菌剂的活菌含量达到1×1012cfu/mL以上。
步骤(5)固态菌剂制备：将MRS液态培养基与无菌椰渣按质量比4：6的比例充分混合后，高压灭菌后得到无菌固态培养基，无菌固态培养基pH值为5.5，粒径为5mm以下。将液态菌剂按照质量比1:1接种至无菌固态培养基中，混匀后用双层医用纱布密封，经35℃无菌条件下进行发酵培养30h，再置于35℃条件下恒温干燥72h得到黑水虻幼虫肠道乳酸菌高密度固态菌剂。
实施例2：一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法,
步骤(1)黑水虻预处理：取黑水虻5龄幼虫预先饥饿处理8小时，用自来水和无菌水分别冲洗3次，然后无菌条件下用75％的乙醇浸泡幼虫1min，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡幼虫1min，再次用无菌水清洗幼虫3次，无菌条件下风干。
步骤(2)肠道微生物原液制备：无菌条件下对经过预处理的黑水虻幼虫进行解剖。取出虫体肠道后加入2mL无菌水研磨，所得肠道研磨液进行涡旋振荡8min，而后静置30min，取上清液进行10-1-10-5梯度稀释获得肠道微生物原液。
步骤(3)肠道乳酸菌悬液制备：将不同梯度的肠道微生物原液涂布于MRS培养基平板，37℃下培养30h，挑出形态特征及长势较好的乳酸菌经过5次划线分离后得到纯化的黑水虻幼虫肠道乳酸菌，最后对纯化菌落斑用2mL无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到肠道乳酸菌悬液，在4℃下保存。
步骤(4)扩大培养制备液态菌剂：将肠道乳酸菌悬液依次接种至15mL、100mL、1L、10LMRS液体培养基于37℃条件下进行扩大培养，获得最终液态菌剂。每轮扩大培养时间均为35h，液态菌剂的活菌含量达到1×1012cfu/mL以上。
步骤(5)固态菌剂制备：将MRS液态培养基与无菌椰渣按质量比1：1的比例充分混合后，高压灭菌后得到无菌固态培养基，无菌固态培养基pH值为6，粒径为5mm以下。将液态菌剂按照质量比1:1接种至无菌固态培养基中，混匀后用双层医用纱布密封，经33℃无菌条件下进行发酵培养40h，再置于35℃条件下恒温干燥72h得到黑水虻幼虫肠道乳酸菌高密度固态菌剂。
步骤(6)菌剂应用：按照1％的比例将制备的乳酸菌固态菌剂接种应用于黑水虻生物转化餐厨垃圾过程中可将转化效率提高20％以上。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述技术方案的基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，具体步骤如下：
1)黑水虻预处理：取高峰期黑水虻幼虫预先饥饿处理8-12小时，用自来水和无菌水依次分别冲洗2-3次，然后在无菌条件下用75％的乙醇浸泡幼虫1-2min，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡幼虫1-2min，再次用无菌水清洗幼虫2-3次，无菌条件下风干；
2)肠道微生物原液制备：无菌条件下对经过预处理的黑水虻幼虫进行解剖，取出虫体肠道后加入1-2mL无菌水研磨，所得肠道研磨液进行涡旋振荡5-10min，而后静置30-60min，取上清液进行10-1-10-5梯度稀释获得肠道微生物原液；
3)肠道乳酸菌悬液制备：将不同梯度的肠道微生物原液均匀涂布于MRS培养基平板，37℃下培养30-40h，挑出形态特征及长势较好的乳酸菌经过3-5次划线分离后得到纯化的黑水虻幼虫肠道乳酸菌，对纯化菌落用1-2mL无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到肠道乳酸菌悬液，在4℃下保存；
4)扩大培养制备液态菌剂：将肠道乳酸菌悬液依次接种至15mL、100mL、1L、10LMRS液体培养基于37℃条件下进行扩大培养，获得最终液态菌剂，每轮扩大培养时间均为30-40h；
5)固态菌剂制备：将液态菌剂按照比例接种至无菌固态培养基中，混匀后用双层医用纱布密封，经30-37℃无菌条件下进行发酵培养24-48h，再置于35℃条件下恒温干燥72h得到黑水虻幼虫肠道乳酸菌高密度固态菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，高峰期黑水虻幼虫为4龄幼虫或5龄幼虫前期。
3.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，将MRS液态培养基与无菌椰渣按质量比3-5：5的比例充分混合后，高压灭菌后得到无菌固态培养基，无菌固态培养基pH值为5.5-6，粒径为5mm以下。
4.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，乳酸菌发酵液即扩大培养的黑水虻肠道乳酸菌液态菌剂与无菌固态培养基的接种质量比为1-2：1。
5.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，乳酸菌液态菌剂的活菌含量达到1×1012cfu/mL以上，乳酸菌固态菌剂的活菌含量达到1×1010cfu/g以上。
6.根据权利要求5所述的从黑水虻幼虫肠道中分离纯化的乳酸菌固态菌剂和乳酸菌液态菌剂，其特征在于，以0.05％-1％的比例接种应用于黑水虻生物转化餐厨垃圾过程中可将转化效率提高20％以上。
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| CN202110142816.8A Pending CN112725181A (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法 |
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| CN (1) | CN112725181A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113943659A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-01-18 | 南京大学（溧水）生态环境研究院 | 一种从黑水虻肠道中提取的厨余垃圾高效降解微生物菌剂的制备工艺 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102766587A (zh) * | 2012-04-13 | 2012-11-07 | 轻工业环境保护研究所 | 一种餐厨垃圾消减型乳酸菌及其应用 |
| CN105906390A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-08-31 | 湖南楚贤环保科技有限责任公司 | 一种餐厨垃圾处理方法 |
| CN106070073A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-11-09 | 赵河山 | 基于黑水虻的鸡粪处理方法及系统 |
| CN108176702A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-06-19 | 世本（天津）环境技术有限公司 | 一种污水废气零排放的餐厨垃圾处理工艺 |
| CN110692812A (zh) * | 2019-10-24 | 2020-01-17 | 郑州笨农农业科技有限公司 | 黑水虻固体饲料原料 |
-
2021
- 2021-02-02 CN CN202110142816.8A patent/CN112725181A/zh active Pending
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