CN112716950A - N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺的新用途及其药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开涉及N‑(2‑苯基乙基)‑5‑苯基‑吡啶‑2‑甲酰胺的新用途。本发明提供的药物新用途是N‑(2‑苯基乙基)‑5‑苯基‑吡啶‑2‑甲酰胺在制备治疗/预防哺乳动物的肺损伤药物中的应用。本发明研究发现，N‑(2‑苯基乙基)‑5‑苯基‑吡啶‑2‑甲酰胺对LPS所致的大鼠ALI具有一定的防治作用，对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞具有抑制炎症反应的作用，其作用机制不仅与调节IL‑6及IL‑1β表达，也与N‑(2‑苯基乙基)‑5‑苯基‑吡啶‑2‑甲酰胺抑制缺氧诱导因子HIF‑1α以及糖酵解和酸敏感离子通道ASIC1a的激活有关；研究表明，N‑(2‑苯基乙基)‑5‑苯基‑吡啶‑2‑甲酰可以缓解LPS所致的肺组织损伤、可以改善肺损伤大鼠的呼吸代谢功能、可以改善肺损伤大鼠的肺水肿、可以减轻炎症反应、可以抑制与ASIC1a相关的炎性疾病。

Description

N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺的新用途及其药物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺的新用途及其药物。

背景技术

近年，肺炎发病率及致死率有增长的趋势。目前，治疗肺损伤的药物主要为糖皮质激素类、抑制炎症因子类药物、抗炎类药物和抗氧化剂等。尽管治疗药物种类多，但仍未研制出特效药和特效治疗方法，且常用的糖皮质激素类和抗炎类药物等副作用明显。因此，人们迫切需要开发出防治肺损伤毒副作用低的药物以降低肺损伤死亡率、改善预后。

肺损伤属于胸外科疾病，包括胸部严重外伤、吸入对肺有害的物质(有毒气体、胃内容物、海水等)、严重的肺部感染等各种致伤因素所造成的肺组织损伤，导致肺脏结构完整性的破坏或功能障碍。急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，是指心源性以外的各种肺外、肺内(生物、物理、化学)等因素导致的急性、进行性呼吸衰竭，ALI/ARDS属于同种疾病的两个阶段，临床表现为呼吸困难、窘迫以及顽固性低氧血症，是机体启动急性过度炎症反应在肺内的表现。在我国，因肺内生物性因素感染所致重症肺炎也为ARDS的主要原因。ALI/ARDS因发病机制复杂，治疗效果不佳，病死率目前仍然居高不下，平均病死率高达50％以上。ALI不是肺脏本身的病变，而是肺部的全身炎症反应的综合征的表现。其发生与肺泡巨噬细胞释放炎症信号密切相关。

RAW264.7属于巨噬细胞系，是常用炎症模型工具细胞。脂多(Lipopolysaccharides，LPS)是最重要的炎症反应触发剂，并诱导多种炎症细胞因子产生，参与炎症反应。因此，脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症模型，被广泛用于炎症反应的研究中。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，在清除病原体和维持组织的稳态方面有着重要的作用。当组织损伤或内毒素LPS侵入时，巨噬细胞通过其表面的Toll样识别受体4(TLR4)识别病原菌，在T细胞辅助因子(Th1)细胞及局部刺激因子的作用下分化为M1型巨噬细胞，分泌大量的炎症因子如TNF-α等，参与炎症反应。

N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺是通过筛选新型缺氧诱导因子(HIF)1抑制剂而获得的芳基羧酰胺类衍生物，双荧光素酶报告法显示N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对HIF-1的抑制效率达到82％。专利CN110407824A公开了一种芳基甲酰胺类化合物及其制备方法、药物组合物及用途，该技术涉及的化合物在制备预防或治疗缺氧诱导因子上调导致的疾病的药物中的应用，以及制备预防或治疗抗肿瘤或抗视网膜血管性病变的药物上的应用。研究显示，炎症环境中存在着缺氧，缺氧诱导缺氧诱导因子HIF-1的表达增加，HIF-1在急性肺损伤的发生发展中发挥作用。HIF-1促进炎性细胞因子的产生，包括TNF-α，IL-1，IL-4，IL-6和IL-12，诱导急性肺损伤中炎症风暴的产生。HIF-1也可促进肺泡上皮细胞发生凋亡以及诱导肺血管内皮细胞通透性增加引起水肿，加重急性肺损伤。

炎症时组织中存在低氧现象已经在一系列炎症性疾病中得到证实，其中包括牙周炎，骨性关节炎，类风湿性关节炎，炎症性肠病，支气管哮喘气道炎症，急性胰腺炎，系统性红斑狼疮，银屑病等。牙周炎是人类常见的口腔慢性感染性疾病之一，其局部组织也存在低氧现象。目前发现，牙周炎症组织中HIF-1α表达上调，LPS和尼古丁可协同诱导人牙周膜细胞中HIF-1α蛋白表达的上调，并进而诱导MMP-2、MMP-9、COX-2和PGE2表达增高，从而发挥促炎作用和牙周组织破坏作用；类风湿性关节炎是一种常见的慢性、全身性自身免疫性疾病，与进行性残疾、全身并发症以及早期死亡有关。类风湿性关节炎的主要特征是滑膜成纤维细胞增生,炎性细胞因子浸润和组织缺氧。HIF-1诱导滑膜成纤维细胞趋化因子IL-8表达上调，参与类风湿性关节炎和骨关节炎的组织破坏作用；炎症性肠病被认定为慢性复发性肠道炎症，涉及到各种遗传、环境和免疫因素,其中大量炎性细胞浸润和过度免疫反应已被证实是肠黏膜免疫的病理标志。HIF-1α介导了毒素诱导的结肠细胞中VEGF的产生，从而可以进一步刺激人肠微血管内皮细胞，破坏结肠上皮屏障并诱导肠道炎症；支气管哮喘是一种由多种细胞(嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、平滑肌细胞及上皮细胞)和细胞因子参与，以慢性气道炎症为特征的异质性疾病。支气管哮喘气道炎症中，HIF-1α通过作用血管重塑指标VEGF及其受体VEGFR1、VEGFR2加重哮喘，也可通过介导Th17/Treg失衡促进烟雾暴露哮喘条件下的气道炎症；急性胰腺炎是胰腺的炎症性疾病，其特点是发病急，进展快，并发症多，症状复杂。研究表明，HIF-1α在大鼠急性胰腺炎的发生、发展中发挥了重要作用。高压氧下调胰腺组织HIF-1α的表达可有效减轻急性胰腺炎的严重程度及胰腺的组织病理学评分，从而为急性胰腺炎的治疗提供了新靶点；系统性红斑狼疮是一种慢性潜在致死性自身免疫性疾病，临床表现主要为涉及多器官损伤，如肾脏、皮肤和中枢神经的系统性紊乱，其中狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮发病和死亡的主要原因之一。研究表明HIF-1α在狼疮样小鼠CD4⁺T细胞中表达升高。由低氧诱导的HIF-1α可激活肾小管上皮细胞TGF-β/SMAD3通路，提示HIF-1α可能促进肾小管间质纤维化的发展。上述结果均表明，HIF-1α在狼疮性肾炎的发病机制中起重要作用，同时提示抑制HIF-1α可能成为狼疮性肾炎和系统性红斑狼疮的有效治疗策略；银屑病是一种慢性T细胞介导的皮肤慢性炎症性疾病，HIF-1α蛋白已被证实存在于银屑病患者的皮肤中，与血管生成因子VEGF显著相关，其活性表现在与细胞增殖和血管生成有关，表明HIF-1α参与银屑病的血管生成过程，反之调节HIF-1α途径可能为控制银屑病病变的炎症活动提供新的策略。综上，抑制HIF-1α可能成为治疗牙周炎，骨性关节炎，类风湿性关节炎，炎症性肠病，支气管哮喘气道炎症，急性胰腺炎，系统性红斑狼疮，银屑病等炎性疾病的新靶点。

炎症细胞的能量代谢状态是显著影响炎症结局转归的可控性因素。在炎症环境中，细胞的代谢方式转化为糖酵解。糖酵解对于免疫细胞的功能至关重要。增强的糖酵解发生在LPS活化的巨噬细胞，树突状细胞和活化的效应T细胞中，可促进免疫细胞产生足够的ATP和生物合成中间体，以履行其吞噬作用和产生炎性细胞因子的作用。先前的研究表明，糖酵解抑制剂可以抑制巨噬细胞活化以及在急性肺损伤的动物模型中减轻炎症。因此，抑制糖酵解有望成为治疗急性肺损伤的手段之一。

糖酵解会产生乳酸堆积，急性肺损伤的患者中也存在高乳酸血症。乳酸堆积会引起细胞外PH降低，ALI的发生过程中，局部肺组织的PH值下降较明显，相比于正常组织的PH值，这种PH值的下降可能诱发ALI加重。肺泡巨噬细胞会感受炎症区域PH的下降扩大炎症反应。炎症的重要特征是伴随组织酸化，PH值下降，这种下降会激活细胞上的通道蛋白——酸敏感离子通道ASIC1a的开放。研究证实，ASIC1a参与了多种炎症性疾病的发生。在类风湿关节炎中，ASIC1a在大鼠的关节软骨细胞中的表达被显著上调，PcTx-1(ASIC1a特异性阻断剂)明显减少大鼠关节软骨细胞损伤；过敏性紫癜(Henoch schonlein purpura，HSP)是儿童中最常见的系统性血管炎，涉及皮肤、关节、肠道和肾脏的小血管发炎。有30％～60％的HSP患儿在发病后的4～6周内发展为肾炎，常伴有蛋白尿、血尿、管型尿等并发症，称紫癜性肾炎(Henoch schonlein purpura nephritis，HSPN)。在HSP急性发作期的直接或者间接刺激可使在血管内皮细胞中的ASIC1a表达显著上调，进而加重血管内皮细胞损伤。当肾脏损伤时，机体PH值降低，ASIC1a的通道被瞬时激活，肾脏炎症因子浸润增多，使得肾脏发生了炎症改变，加重肾脏的损伤；过敏性肠道综合征，别名肠易激综合征(irritable bowelsyndrome，IBS)，是以腹痛、腹泻、排便习惯改变、大便形态、色泽异常等为特征的一种与特发性结肠过敏(idiopathic colonic hyper sensitivity，CHS)相关的功能性胃肠疾病。研究发现ASIC1a的过表达增强结肠传入纤维的敏感性，可通过调节结肠的伤害性肽能神经元中ASIC1a的表达阻止CHS的发生；神经元损伤时，炎症因子激发伤害感受器引起脊髓背根释放谷氨酸，伤害刺激通过传出神经传入脑干等结构，进一步通过递质激活分布在突出后膜的ASIC1a，又如当脑组织缺血时，会诱发缺血神经损伤，进一步引起脑内PH值的下降，而组织轻度的PH值下降就会激活ASIC1a，进一步促进细胞外的Ca²⁺内流入细胞内，加重脑的缺血性损伤；过敏性哮喘属于慢性炎症，主要特征是气道高反应性、气道重塑、大量嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞粘液分泌增加。ASIC1a参与了气管细胞的凋亡、气道的重塑、气管张力改变等过程。因此，抑制ASIC1a的表达有望成为治疗以上炎症性疾病的新手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于解决HIF-1α促进炎性细胞因子的产生，诱导急性肺损伤中炎症风暴的产生；以及诱导肺血管内皮细胞通透性增加引起水肿，加重急性肺损伤的问题。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺在制备治疗/预防哺乳动物的肺损伤药物中的应用。

优选地，所述肺损伤包括急性肺损伤和慢性肺损伤；所述肺损伤的疾病包括上呼吸道感染、慢性支气管炎、肺水肿、肺炎、肺脓肿以及由心脑缺血和器官移植引起的肺组织损伤、炎症和感染。

优选地，所述肺损伤药物能下调急性肺损伤受试者中炎症指标的水平，能改善急性肺损伤受试者的呼吸功能，能抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和酸敏感离子通道ASIC1a的激活。

优选地，所述肺损伤药物抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)引起的炎症相关疾病。

优选地，所述炎症相关疾病包括牙周炎、骨性关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病、支气管哮喘气道炎症、急性胰腺炎、系统性红斑狼疮和银屑病。

优选地，所述肺损伤药物抑制酸敏感离子通道ASIC1a引起的炎症相关疾病。

优选地，所述炎症相关疾病包括类风湿性关节炎、过敏性紫癜肾炎、过敏性肠道综合症、神经元损伤和过敏性哮喘气道炎症。

一种肺损伤药物，其包括有效量的N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺和药学上可接受的载体；

所述N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺的结构式如下述式所示：

进一步地，所述肺损伤药物的给药剂量不低于25mg/kg/d。

进一步地，所述肺损伤药物被制成药学上允许的剂型。

本发明具有如下的有益效果：

1、经试验证明，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对LPS所致的大鼠ALI具有一定的防治作用，对LPS刺激的活化RAW264.7巨噬细胞具有抑制炎症反应的作用，其作用机制不仅与调节IL-6及IL-1β表达，也与N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺抑制缺氧诱导因子HIF-1α以及糖酵解和酸敏感离子通道ASIC1a的激活有关。

2、本发明建立的ALI大鼠模型中，模型对照组大鼠肺组织出现明显实变，肺泡损坏萎陷挤压明显，边界不清晰，有明显的炎性细胞浸润，而N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰组肺组织损伤明显改善，肺泡萎陷明显改善，实变明显缓解，边界较清晰，挤压和炎性改变明显减轻，表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以缓解LPS所致的肺组织损伤；另外，血气分析的检测的结果提示，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以改善肺损伤大鼠的呼吸代谢功能；肺干湿重比结果显示，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以改善肺损伤大鼠的肺水肿。

3、IL-6和IL-1β的大量分泌，促进炎症细胞的激活，会在体内形成“瀑布效应”，导致炎症介质数量不断增加，从而引起炎症反应；在肺部，肺组织会发生炎性细胞浸润、肺充血现象，导致肺通透性增加，肺功能损伤；本发明的研究结果表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以降低ALI大鼠中炎症细胞的数量以及肺泡灌洗液中的蛋白浓度，以及血清中IL-6和IL-1β的的水平，表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以通过减少免疫细胞的浸润和血清炎症因子的水平以及降低肺通透性来保护肺功能，也可以降低LPS刺激后RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β和IL-6炎症因子水平；本发明的研究结果表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以减轻炎症反应。

4、HIF-1α在急性肺损伤中起到重要作用，缺氧诱导因子-1α可以作为炎症因子IL-1β转录因子促进IL-1β的高表达，IL-1β是引起炎症的中枢性促炎细胞因子，仅IL-1β的瞬时表达就可能诱发急性肺损伤；本发明的研究结果表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以降低ALI大鼠原代肺泡巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞中HIF-1α水平。

5、研究表明，细胞代谢方式已成为调节炎症反应的关键机制，LPS诱导的巨噬细胞葡萄糖转运主要由葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)介导；己糖激酶(HK)是糖酵解的关键酶，而2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)竞争性抑制HK活性，进而降低了糖酵解速率并减少了LPS诱导的促炎性细胞因子释放；本发明的研究结果表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰降低葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和己糖激酶(HK)的表达水平，改变细胞代谢方式进而抑制炎症反应。

6、有大量证据表明，糖酵解会产生乳酸堆积，从而导致细胞外PH下降，下降的PH激活了酸敏感离子通道蛋白ASIC1a；研究显示，ASIC1a跟炎症疾病如类风湿性关节炎，过敏性紫癜肾炎，过敏性肠道综合症，神经元损伤，过敏性哮喘气道炎症等发生发展密切相关；本发明的研究结果表明，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以抑制ALI大鼠体内和RAW264.7巨噬细胞中酸敏感离子通道蛋白ASIC1a的表达，表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰可以抑制与ASIC1a相关的炎性疾病。

附图说明(N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺标记为N5P)

图1为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞安全剂量范围的MTT法试验结果图；

图2为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞炎性因子NO释放量的试验结果图；

图3为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞IL-1β的mRNA水平图；

图4为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞IL-6的mRNA水平图；

图5为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞HIF-1α的mRNA水平图；

图6为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白GLUT1的mRNA水平图；

图7为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白HK2的mRNA水平图；

图8为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白PDK3的mRNA水平图；

图9为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白PGK1的mRNA水平图；

图10为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白ASIC1a的mRNA水平图；

图11为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞IL-1β的蛋白水平图；

图12为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞IL-6的蛋白水平图；

图13为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞HIF-1α的蛋白水平图；

图14为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白GLUT1的蛋白水平图；

图15为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白HK2的蛋白水平图；

图16为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞酸敏感离子通道蛋白ASIC1a的蛋白水平图；

图17为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞HIF-1α表达水平的免疫荧光图；

图18为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞糖酵解蛋白GLUT1表达水平的免疫荧光图；

图19为本发明实施例1中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对RAW264.7细胞酸敏感离子通道蛋白ASIC1a表达水平的免疫荧光图；

图20为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对肺组织损伤的作用；

图21为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠血气功能的作用；

图22为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠肺干湿重比(W/D)的作用；

图23为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数的作用；

图24为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度的作用；

图25为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠组织中乳酸的作用；

图26为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中动脉血中乳酸的作用；

图27为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠血清中IL-1β的作用；

图28为本发明实施例2中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠血清中IL-6的作用；

图29为本发明实施例3中ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞的鉴定图；

图30为本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中IL-1β的mRNA水平图；

图31为本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中IL-6的mRNA水平图；

图32为本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中HIF-1α的mRNA水平图；

图33为本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中ASIC1a的mRNA水平图；

图34是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中GLUT1的mRNA水平图；

图35是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中IL-1β的蛋白水平图；

图36是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中IL-6的蛋白水平图；

图37是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中缺氧诱导因子HIF-1α的蛋白水平图；

图38是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中酸敏感离子通道ASIC1a的蛋白水平图；

图39是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中糖酵解蛋白GLUT1的蛋白水平图；

图40是本发明实施例3中化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对ALI大鼠中灌洗出的原代肺泡巨噬细胞中糖酵解蛋白HK2的蛋白水平图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明附图说明和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

LPS可以激活HIF-1α、ASIC1a，刺激IL-6、IL-1β炎症因子表达，大鼠呼吸急促、血氧含量降低，进而对正常组织细胞产生损伤，其中以肺功能损伤较为明显。本发明采用气管滴注LPS制备大鼠ALI模型，用于N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对抗LPS诱导的ALI的作用研究。

本发明的N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺采用的是专利申请号为201910730990.7的芳基甲酰胺类化合物及其制备方法、药物组合物及用途的制备方法制得。

实施例1

化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的试验：

(1)MTT法：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔。培养24h，分组加入不同浓度的化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺以及溶剂对照DMSO，分别为对照组(Control)、不同浓度药物组(化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺的浓度依次为1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM)，DMSO溶剂对照组。继续培养24h。培养结束后每孔加入5g·L^-1的MTT溶液20μL，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150μL的DMSO，振荡，混匀。用酶标仪在492nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率(Cellviability)对剂量作图。结果计算：细胞存活率＝(试验组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。

(2)NO释放量测量：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中，分别分为正常组(Control)、模型组(LPS 1μg/ml)和不同剂量(LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺5μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺10μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺20μM、LPS1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺40μM)每组重复3次实验。接种密度约为1.0×10⁵个细胞/ml，孵育24小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。收集细胞上清，并根据一氧化氮(NO)试剂盒说明书检测细胞上清中NO含量(购自北京碧云天生物技术公司)。

(3)Western Blot：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中，分别分为正常组(Control)、模型组(LPS 1μg/ml)和不同剂量(LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺5μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺10μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺20μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺40μM)，每组重复3次实验。接种密度约为1.0×10⁵个细胞/ml，孵育24小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blot法检测IL-1β、IL-6、HIF-1α、ASIC1a以及GLUT1、HK2的蛋白表达。

(4)Realtime PCR:将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中，分别分为正常组(Control)、模型组(LPS 1μg/ml)和不同剂量(LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺5μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺10μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺20μM、LPS 1μg/ml+化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺40μM)每组重复3次实验。接种密度约为1.0×10⁵个细胞/ml，孵育24小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提取RNA，通过Realtime PCR法检测IL-1β、IL-6、HIF-1α、ASIC1a以及GLUT1、HK2、PDK3、PGK1的mRNA表达并进行分析。

(5)免疫荧光染色：将爬片后的RAW264.7巨噬细胞用多聚甲醛固定10分钟，再用10％的BSA封闭10分钟，PBS洗两遍后孵育一抗HIF-1α(1:300)和ASIC1a(1:300)、GLUT1(1:300),4℃过夜，PBS洗两遍后敷荧光二抗，然后将所有细胞用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色5min。用载玻片固定细胞爬片，使用荧光倒置显微镜进行显微照相。

(6)统计学分析：采用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析进行组间比较。P<0.05为显著性事件。

实验结果：MTT结果如图1所示，由图1可知：N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺浓度在40μM范围内对RAW264.7细胞没有毒性(**P<0.01，与对照组比较)，可作为安全剂量使用；NO结果如图2所示，可知LPS刺激的RAW264.7细胞经过化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺处理后，炎性分子NO的表达水平明显受到抑制，证明化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺抑制LPS引起的RAW264.7巨噬细胞炎性因子分泌(**P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与模型组比较)；Realtime PCR结果如图3、4、5、6、7、8、9、10所示，可知LPS刺激的RAW264.7细胞经过化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺处理后，炎症因子IL-1β、IL-6mRNA水平显著降低，HIF-1αmRNA，ASIC1a mRNA和糖酵解基因GLUT1、HK2、PDK3、PGK1 mRNA表达下降(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较)；Western Blot结果如图11、12、13、14、15、16所示，可知LPS刺激的RAW264.7细胞经过化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺处理后，炎症因子IL-1β、IL-6蛋白水平显著降低，HIF-1α蛋白水平和ASIC1a蛋白水平以及糖酵解基因GLUT1，HK2蛋白水平下降；免疫荧光染色结果如图17、18、19所示，可知LPS刺激的RAW264.7细胞经过化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺处理后，HIF-1α、GLUT1、ASIC1a表达降低(HIF-1α绿色，GLUT1红色，ASIC1a绿色)。

以上结果表明化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺可显著抑制LPS诱发的HIF-1α、ASIC1a的激活，糖酵解的增强以及扩大的炎症反应。

实施例2

化合物N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺对急性肺损伤动物模型试验：

将体重200g-250g的雄性SD大鼠适应性培养1-2天，分为正常组(Control)、模型组(LPS5mg/kg)、低剂量组(LPS5mg/kg+25mg/kg)、中剂量组(LPS5mg/kg+50mg/kg)、高剂量组(LPS5mg/kg+100mg/kg)，阳性药对照组(LPS5mg/kg+2mg/kgYC-1)每组6-10只。SD大鼠腹腔注射上述剂量药物3天，正常组腹腔注射等体积的溶剂对照。第4天进行气管滴注LPS造模。为建立ALI模型，先腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠，随后经气管内注射LPS(5mg/kg，200ul)，对照组大鼠气管内给予200ul生理盐水。LPS处理后二十四小时处死大鼠。收集动脉血，进行血气分析。收集静脉血，ELISA测定血清中炎症因子IL-1β，IL-6的含量。然后进行正中胸骨切开术以暴露肺部。在每只大鼠中，结扎右肺的肺门后，灌洗左肺以获得肺泡灌洗液(BALF)和总炎症细胞。切下右肺隔叶以计算肺的干湿重比。取右肺副叶部分的肺组织进行HE染色。取右肺尖叶和心叶部分的肺组织用于乳酸含量检测。肺组织在液氮中速冻，并保存在-80℃以便以后分析。收集的肺泡灌洗液在4℃以200xg离心15分钟，得到肺泡灌洗液上清和总炎症细胞，肺泡灌洗液上清进行蛋白含量的测定，得到的总炎症细胞进行计数。统计学分析：采用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析进行组间比较。P<0.05为显著性事件。

上述实验结果如图20、21、22、23、24、25、26、27、28所示：如图20所示，肺组织HE染色结果显示，空白对照组小鼠肺组织气管黏膜平滑，肺泡未见增厚、充血或水肿等改变，肺泡壁薄，分布整齐，边界清晰；LPS模型组小鼠肺组织出现明显实变，肺毛细血管充血，肺间质水肿，大量炎性细胞浸润和肺泡壁增厚，肺泡损坏萎陷挤压明显；阳性药组和N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺(25、50、100mg/kg)组肺组织损伤明显改善，实变明显缓解，边界较清晰，挤压和炎性改变明显减轻；如图21所示，接受LPS的大鼠的动脉血气分析显示与对照组相比有显着变化，其中pH值，动脉血氧分压(PaO2)降低，动脉二氧化碳分压(PaCO2)升高，但是N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺有效地改变了动脉氧合的变化(*P<0.05，**P<0.01与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较)。结果表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺改善LPS诱导的ALI期间的肺功能障碍；如图22、23、24所示，肺W/D比和BALF蛋白浓度是肺血管通透性的两个常用指标，这是ALI/ARDS的重要特征；与对照组相比，LPS攻击的小鼠的肺W/D比和BALF蛋白浓度显着增加，并且这些水平通过N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺处理而降低。还检测了LPS给药后24小时后肺中BALF总炎症细胞数量。与对照组相比，LPS攻击大鼠的BALF总炎症细胞数量显着增加，但被N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺和阳性药YC-1所抑制(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较)。这些结果表明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺减轻了LPS攻击大鼠的肺水肿和炎症。如图25和26所示，模型组大鼠肺组织和动脉血中乳酸堆积增加，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺给药后可降低乳酸的堆积，避免组织酸化激活ASIC1a。(***P<0.001，与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较)。如图27和28所示，血清中促炎细胞因子IL-6和IL-1β的水平在LPS刺激后显着增加，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺处理可显着下调LPS攻击小鼠血清中促炎细胞因子的水平(***P<0.001与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较)。

实施例3

将得到的总炎症细胞团用未完全培养基RPMI1640重悬吹打，分装15ml离心管，并1500rpm×10min离心，弃去上清。计数细胞，按照5×10⁵接种6孔板。10％FBS的RPMI1640培养基悬浮细胞，孵箱内培养2h。吸出细胞悬液，用RPMI1640培养基清洗，除去未贴壁细胞，加入完全培养基RPMI1640。充分混匀后37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内孵育24h，使巨噬细胞贴壁。摇晃培养瓶，悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。PBS冲洗三次，除去未贴壁细胞。用RPMI1640培养液洗涤巨噬细胞三次，用含10％FBS的RPMI1640培养基悬浮细胞，即得纯化后的原代肺泡巨噬细胞。可进行细胞鉴定及后续Realtime PCR和Western Blot实验。统计学分析：采用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析进行组间比较。P<0.05为显著性事件。

上述实验结果如图29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40所示：如图29所示，用瑞氏-姬萨姆染色的方法和CD68免疫荧光染色鉴定原代肺泡巨噬细胞，瑞氏-姬萨姆染色结果显示原代肺泡巨噬细胞呈现圆形或椭圆形形状，边缘清晰、整齐；CD68为肺泡巨噬细胞的标记物，免疫荧光显示成功得到原代肺泡巨噬细胞。如图30、31所示，模型组中肺泡巨噬细胞炎症因子IL-1β和IL-6mRNA水平增加，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺降低了大鼠肺泡巨噬细胞中炎症因子mRNA水平(**P<0.01，***P<0.001与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较)。如图32、33、34所示，模型组大鼠HIF-1α和ASIC1a以及GLUT1 mRNA表达增加，而N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺给药组可降低其mRNA水平(***P<0.001，****P<0.0001与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较)。如图35、36所示，模型组中肺泡巨噬细胞炎症因子IL-1β和IL-6蛋白水平增加，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺降低了大鼠肺泡巨噬细胞中炎症因子蛋白水平。如图37、38、39、40所示，模型组大鼠HIF-1α和ASIC1a以及GLUT1、HK2蛋白表达增加，而N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺给药组可降低其蛋白水平。

上述结果表明，N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺可抑制LPS刺激后大鼠体内肺泡巨噬细胞中HIF-1α，糖酵解基因GLUT1、HK2以及ASIC1a的激活，减少肺泡巨噬细胞炎症因子表达。

实施例4

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或者注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂(纳米剂)、口服液、喷雾剂、栓剂等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺在制备治疗/预防哺乳动物的肺损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺损伤的疾病包括上呼吸道感染、慢性支气管炎、肺水肿、肺炎、肺脓肿以及由心脑缺血和器官移植引起的肺组织损伤、炎症和感染。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺损伤药物能下调急性肺损伤受试者中炎症指标的水平，能改善急性肺损伤受试者的呼吸功能，能抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和酸敏感离子通道ASIC1a的激活。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肺损伤药物抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)引起的炎症相关疾病。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述炎症相关疾病包括牙周炎、骨性关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病、支气管哮喘气道炎症、急性胰腺炎、系统性红斑狼疮和银屑病。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肺损伤药物抑制酸敏感离子通道ASIC1a引起的炎症相关疾病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述炎症相关疾病包括类风湿性关节炎、过敏性紫癜肾炎、过敏性肠道综合症、神经元损伤和过敏性哮喘气道炎症。

8.一种肺损伤药物，其特征在于：其包含有效量的N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺和药学上可接受的载体；

所述N-(2-苯基乙基)-5-苯基-吡啶-2-甲酰胺的结构式如下述式所示：

9.根据权利要求8所述的肺损伤药物，其特征在于：所述肺损伤药物的给药剂量不低于25mg/kg/d。

10.根据权利要求8所述的肺损伤药物，其特征在于：所述肺损伤药物被制成药学上允许的剂型。

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