CN112695064B - 从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽 - Google Patents

从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽，是以成本低廉的海洋腹足类黏液为原料提取总蛋白，并以混合蛋白酶对所提取的总蛋白进行酶解，制备海洋腹足类粘液低聚肽。所制备的低聚肽在一定浓度范围内对人正常肝细胞无毒性（不会引起正常肝细胞损伤），对人肝癌细胞Hep‑G2和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC‑T6的增殖均具有极显著的抑制作用，具有价格低廉、用量少、见效快等优点，可应用于制备抗肝癌和抗肝纤维化药物。

Description

从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，尤其是一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽。
背景技术
海洋腹足类是软体动物门（Mollusca）中种类最多的一个类群，其特点是为身体移动提供牵引力或将牢固地附着在海底的足从身体的腹部伸出。目前，关于海洋腹足类活性物质的开发主要集中于软体部和内脏团两种组织，如在皮氏蛾螺组织中分离出了血管紧张素转化酶（Angiotensin convert enzyme，ACE）抑制肽（孙美玲. 基于亲和色谱的皮氏蛾螺ACE 抑制肽分离及其特性评价[D]. 大连: 大连工业大学, 2017.）和抗氧化肽（ShudongHe, Yi Zhang, Hanju Sun, et al. Antioxidative peptides from proteolytichydrolysates of false abalone (Volutharpa ampullacea perryi):characterization, identification, and molecular docking [J]. Marine Drugs,2019, 17(2): 116.），蔡等人研究发现闽南海螺组织的水提物和醇提物中的2,6-对二叔丁基对甲酚、5-溴吲哚满二酮和4-胆甾-3-酮具有一定的抗乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的活性（蔡平平. 闽南海螺中抗乙型肝炎病毒的有效成分的研究[D]. 华侨大学,2016.）。海洋腹足类黏液是由海洋腹足类腺体分泌的一种透明的浓稠物质，以往在生产和食品加工中往往被视为废物而清洗去除。
肝癌是多种因素引起的肝脏恶性肿瘤，目前的治疗方法仍以手术为主，存在着术后 5 年复发率、转移率高等问题。因此，开发针对肝癌早期预防、治疗及术后干预的有效药物，一直是肝癌研究领域的热点和焦点。目前，吉薇等人报道了扁舵鲣鱼（Auxis thazard）低聚肽（吉薇, 刘扬, 龙慧静. 扁舵鲣鱼低聚肽化学组成及其对人体肝癌细胞的抑制作用[J]. 广东农业科学, 2019, 46(10): 123-131.）对人肝癌细胞的增殖具有一定的抑制作用。
肝纤维化是慢性肝脏疾病发展为肝硬化甚至肝癌的渐进性病理过程，是肝脏在多种损伤因素作用下发生的慢性代偿性修复反应，有较高的发病率和死亡率，是亟待解决的医学难题之一。肝纤维化的本质是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化及其持续激活后分泌的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积。正常情况下，肝星状细胞处于静止状态，当致肝病因子造成肝细胞损伤时，经多种信号转导途径使肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞，即肝星状细胞的活化。国内外的研究均证明肝纤维化是可以逆转的，有效的治疗肝纤维化可以防止向肝硬化甚至肝癌发展，而有效阻止肝星状细胞的增殖和活化是预防和治疗（逆转）肝纤维化的根本。目前，在肝纤维化预防和治疗方面，主要以西药和传统中药为主，未见从海洋腹足类黏液中提取的即可抗肝癌又可抗肝纤维化的低聚肽的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽。
本发明的技术解决方案是：一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽，其特征在于按照如下步骤制备：
步骤1：收集海洋腹足类黏液；
步骤2：分别提取所收集的海洋腹足类黏液的水溶性总蛋白和膜总蛋白，所述水溶性总蛋白的提取方法为：将黏液与纯水按照体积比为1：5 ~ 10于磁力搅拌器下4℃搅拌1 ~1.5 h，10000 rpm离心20 min后取上清，即水溶性总蛋白，所述膜总蛋白的提取方法为将黏液与纯水按照体积比为1：5 ~ 10混匀后于冰浴中进行超声破碎，每超声破碎20 s间隔10s，4个循环， 10000 rpm离心20 min，弃上清提取膜总蛋白；将膜总蛋白溶于含有终浓度为0.02%的TritonX-100水溶液中，得到膜总蛋白溶液；合并所提取的水溶性总蛋白和膜总蛋白溶液，即获得海洋腹足类黏液的总蛋白；
步骤3：向所获得的海洋腹足类黏液总蛋白中加入混合蛋白酶，调节pH=7 ~ 8，30~ 50℃水浴2 ~ 3 h后，置于100℃ 水浴中10 min，获得酶解液；所述混合蛋白酶与海洋腹足类黏液总蛋白的质量体积比为10 ~ 50 g/L，所述混合蛋白酶为胰蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力单位之比为 5：6：10：12；
步骤4：将所获得的酶解液8000 rpm，15 min离心取上清，冷冻干燥上清至粉末状即可。
所述海洋腹足类为鲍鱼（Haliotis discus hannai）、皮氏蛾螺（Volutharpa ampullacea perryi）、脉红螺（Rapana venosa）或香螺（Neptunea cumingi Crosse）。
所述冷冻干燥上清为将上清置于-80℃冷冻2 ~ 3h后，转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
本发明是以成本低廉的海洋腹足类黏液为原料提取总蛋白，并以混合蛋白酶对所提取的总蛋白进行酶解，制备海洋腹足类粘液低聚肽。所制备的低聚肽在一定浓度范围内对人正常肝细胞无毒性（不会引起正常肝细胞损伤），对人肝癌细胞Hep-G2和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖均具有极显著的抑制作用，具有价格低廉、用量少、见效快等优点，可应用于制备抗肝癌和抗肝纤维化药物。
附图说明
图1是实施例1不同浓度低聚肽MGCZZ-0处理细胞实验结果示意图。
图2是实施例2不同浓度低聚肽MGCZZ-0处理细胞实验结果示意图。
图3是实施例3不同浓度低聚肽MGCZZ-0处理细胞实验结果示意图。
图4是实施例4不同浓度低聚肽MGCZZ-0处理细胞实验结果示意图。
具体实施方式
实施例1：
本发明的一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽，按照如下步骤制备：
步骤1：收集海洋腹足类黏液：随机选择30只健康有活力的鲍鱼（Haliotis discus hannai），将其体表冲洗干净后，放置于干净培养皿中静置10 min，待其足部自然产生黏液后，轻轻将黏液刮取至离心管中；
步骤2：提取海洋腹足类黏液的总蛋白：分别提取所收集的海洋腹足类黏液的水溶性总蛋白和膜总蛋白，所述水溶性总蛋白的提取方法为：将黏液与纯水按照体积比为1：5置于烧杯中于磁力搅拌器下4℃搅拌1 h，10000 rpm离心20 min后取上清，即水溶性总蛋白，所述膜总蛋白的提取方法为将黏液与纯水按照体积比为1：5 ~ 10混匀后于冰浴中进行超声破碎，每超声破碎20 s间隔10 s，4个循环，10000 rpm离心20 min，弃上清，利用膜总蛋白提取试剂盒提取膜总蛋白；将膜总蛋白溶于含有终浓度为0.02%的TritonX-100水溶液中，得到膜总蛋白溶液；合并所提取的水溶性总蛋白和膜总蛋白溶液，即获得海洋腹足类黏液的总蛋白；
步骤3：向所获得的海洋腹足类黏液总蛋白中加入混合蛋白酶，调节pH=7，40℃水浴3 h后，置于100℃ 水浴中10 min后终止酶解反应，获得酶解液；所述混合蛋白酶与海洋腹足类黏液总蛋白的质量体积比为20 g/L，所述混合蛋白酶为胰蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力单位之比为 5：6：10：12；
步骤4：将所获得的酶解液8000 rpm，15 min离心取上清，冷冻干燥上清至粉末状，即得到低聚肽，命名MGCZZ-0，置于-80℃冰箱中进行保存。
所用胰蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶均为外购，其活力单位分别为：25000 U/g、30000 U/g、50000 U/g、60000 U/g。
实施例2：
本发明的一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽，按照如下步骤制备：
步骤1：收集海洋腹足类黏液：随机选择35只健康有活力的脉红螺（Rapana venosa），将其体表冲洗干净后，放置于干净培养皿中静置10 min，待其足部自然产生黏液后，轻轻将黏液刮取至离心管中；
步骤2：提取海洋腹足类黏液的总蛋白：分别提取所收集的海洋腹足类黏液的水溶性总蛋白和膜总蛋白，所述水溶性总蛋白的提取方法为：将黏液与纯水按照体积比为1：8置于烧杯中于磁力搅拌器下4℃搅拌1.5 h，10000 rpm离心20 min后取上清，即水溶性总蛋白，所述膜总蛋白的提取方法为将黏液与纯水按照体积比为1：8混匀后于冰浴中进行超声破碎，每超声破碎20 s间隔10 s，4个循环，10000 rpm离心20 min，弃上清，利用膜总蛋白提取试剂盒提取膜总蛋白；将膜总蛋白溶于含有终浓度为0.02%的TritonX-100水溶液中，得到膜总蛋白溶液；合并所提取的水溶性总蛋白和膜总蛋白溶液，即获得海洋腹足类黏液的总蛋白；
步骤3：向所获得的海洋腹足类黏液总蛋白中加入混合蛋白酶，调节pH=7.5，40℃水浴2.5 h后，置于100℃ 水浴中10 min后终止酶解反应，获得酶解液；所述混合蛋白酶与海洋腹足类黏液总蛋白的质量体积比为15 g/L，所述混合蛋白酶为胰蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力单位之比为 5：6：10：12；
步骤4：将所获得的酶解液8000 rpm，15 min离心取上清，将上清置于-80℃冷冻2~ 3h后，转入冷冻干燥机中冷冻干燥至粉末状，即得到低聚肽MGCZZ-0，置于-80℃冰箱中进行保存。
所用胰蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶来源及配比同实施例1。
实施例3：
方法同实施例2，区别是以皮氏蛾螺（Volutharpa ampullacea perryi）替代脉红螺（Rapana venosa）。
实施例4：
方法同实施例2，区别是以香螺（Neptunea cumingi Crosse）替代脉红螺（Rapana venosa）。
实验：
采用常规的细胞培养方法培养人肝细胞7702（购自南京科佰生物科技有限公司）、表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6（购自江苏凯基生物技术股份有限公司）和人肝癌细胞Hep-G2（购自江苏凯基生物技术股份有限公司）。
人肝癌细胞Hep-G2用含10％FBS（Ausbian公司，澳大利亚，货号：FSP500）和含有青霉素（80U/mL）和链霉素（80 µg/mL）的DMEM高糖型培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司，南京，货号：KGM41500-500）中培养。人肝细胞HL7702（南京科佰生物科技有限公司）、表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6（江苏凯基生物技术股份有限公司，南京，货号：KG313）分别培养于含10% FBS和1%双抗（赛文创新（北京）科技有限公司，货号：SC118-01）的RPMI-1640（Biological Industries，以色列，货号：01-100-1ACS）和DMEM高糖型培养基（Biological Industries，以色列，货号：01-052-1ACS）中。所有细胞培养均置于37℃的5％CO2浓度、饱和湿度的孵箱中培养，每天更换一次培养基和传代。取处于对数生长期融合度约70％~80％的细胞，用培养基稀释至4×103个/孔的Hep-G2细胞和6×103个/孔的7702细胞和HSC-T6细胞，铺于96孔板内1×105个/mL的细胞数目，各孔加细胞悬液100 µL。设置空白组、对照组、实验1 ~ 4组，每组4个复孔，放进培养箱中等待细胞完全贴壁，而后对照组添加100 μL培养基，实验1~4组分别对应加入100 μL含实施例1、实施例2、实施例3或实施例4制备的低聚肽MGCZZ-0的培养基溶液，低聚肽MGCZZ-0终浓度为：0～0.5 μg/μL，空白组设置为只含有200 μL培养基。置于孵箱中培养12 h，吸弃培养基，以换液的形式加入100 µL含10%CCK8（江苏凯基生物技术股份有限公司，南京，货号：KGA317s）的正常培基，孵育2 h，置于酶标仪内震荡5 min，检测450 nm下吸光度（OD值）。计算细胞活力（细胞活力 = [(实验组-空白组)／(对照组-空白组)]×100 %）。
所有实验数据用 SPSS 25 软件进行统计分析。采用单因素ANOVA方法比较了两对样本之间的显著差异，**（P<0.01）表示两组间具有极显著差异。结果如图1 ~ 4所示。
图1 ~ 4分别是实施例1 ~ 4不同浓度（0、0.3、0.4和0.5 μg/μL）低聚肽MGCZZ-0处理细胞实验结果示意图。图中A：0小时处理后人肝细胞7702和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6的实验结果；B：12小时处理后人肝细胞7702和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6的实验结果；C：0小时处理后人肝细胞7702和人肝癌细胞Hep-G2的实验结果；D：12小时处理后人肝细胞7702和人肝癌细胞Hep-G2的实验结果。
实施例1~4所得低聚肽MGCZZ-0对人肝细胞7702、表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6和人肝癌细胞Hep-G2处理12 h时的半致死浓度如下表：
Figure 674720DEST_PATH_IMAGE002
结果表明：当低聚肽MGCZZ-0的浓度在0.30～0.5 μg/μL范围内，对人肝细胞7702、人肝癌细胞Hep-G2和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6处理12小时后，人肝细胞7702活力与人肝癌细胞Hep-G2和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6的活力存在极显著差异（P<0.01）。说明本发明所制备的低聚肽MGCZZ_0在一定浓度范围内对人正常肝细胞无毒性，特别是实施例3以皮氏蛾螺（Volutharpa ampullacea perryi）的粘液制备的低聚肽MGCZZ_0在一定的浓度范围内不但对人正常肝细胞无毒性，而且促进人正常肝细胞增殖；同时亦可看出本发明所制备的低聚肽MGCZZ_0在浓度较小的范围内对人肝癌细胞Hep-G2和表型为活化型的大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖均具有极显著的抑制作用。

Claims (2)

1.一种从海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽，其特征在于按照如下步骤制备：
步骤1：收集海洋腹足类黏液；
步骤2：分别提取所收集的海洋腹足类黏液的水溶性总蛋白和膜总蛋白，所述水溶性总蛋白的提取方法为：将黏液与纯水按照体积比为1：5 ~ 10于磁力搅拌器下4℃搅拌1 ~ 1.5h，10000 rpm离心20 min后取上清，即水溶性总蛋白，所述膜总蛋白的提取方法为将黏液与纯水按照体积比为1：5 ~ 10混匀后于冰浴中进行超声破碎，每超声破碎20 s间隔10 s，4个循环， 10000 rpm离心20 min，弃上清后提取膜总蛋白；将膜总蛋白溶于含有终浓度为0.02%的TritonX-100水溶液中，得到膜总蛋白溶液；合并所提取的水溶性总蛋白和膜总蛋白溶液，即获得海洋腹足类黏液的总蛋白；
步骤3：向所获得的海洋腹足类黏液总蛋白中加入混合蛋白酶，调节pH=7 ~ 7.5，40℃水浴2.5 ~ 3 h后，置于100℃水浴中10 min，获得酶解液；所述混合蛋白酶与海洋腹足类黏液总蛋白的质量体积比为15 ~ 20 g/L，所述混合蛋白酶由胰蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，各酶活力单位之比为 5：6：10：12；
步骤4：将所获得的酶解液8000 rpm，15 min离心取上清，冷冻干燥上清至粉末状即可；
所述海洋腹足类为鲍鱼（Haliotis discus hannai）、皮氏蛾螺（Volutharpa ampullacea perryi）、脉红螺（Rapana venosa）或香螺（Neptunea cumingi Crosse）。
2.根据权利要求1所述的海洋腹足类黏液中提取的抗肝癌和抗肝纤维化的低聚肽，其特征在于所述步骤4的冷冻干燥上清至粉末状为将上清置于-80℃冷冻2 ~ 3h后，转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
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