CN112695059B

CN112695059B - 戈氏副拟杆菌用于生产山梨糖醇的用途

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Publication number: CN112695059B
Application number: CN201911004854.6A
Authority: CN
Inventors: 林稚容; 吴柏毅
Original assignee: Xingjufan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xingjufan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN112695059A

Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其是关于一种戈氏副拟杆菌用于生产山梨糖醇的用途。本发明提供一种戈氏副拟杆菌于生产山梨糖醇的用途，以取代工业制造时所产生的劣处，同时因戈氏副拟杆菌本身为具多效性的益生菌，因此亦能够结合其本身所产生的功效，以制造益生菌加上山梨糖醇双项结合的组合物，能使山梨糖醇能更有效地应用于食品、医药品、或保养品等产品中；再者，本发明能透过调节戈氏副拟杆菌，涉及调控山梨糖醇生产的相关基因，而可按照需求量以控制山梨糖醇的产量。

Description

戈氏副拟杆菌用于生产山梨糖醇的用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其是关于一种戈氏副拟杆菌用于生产山梨糖醇的用途。

背景技术

许多细菌的表面都具有多醣体(Glycocalyx)的存在，其主要的功能是帮助细菌在恶劣的环境下生存、抵抗宿主免疫系统的攻击等，而多醣体在细菌表面的结构紧实或松散与否可构成荚膜(Capsule)或黏质层(Slime layer)。而根据先前研究指出，肠胃道菌丛中的细菌能够长期且稳定地存在于肠胃道中，主要与该些细菌表面特定的荚膜多醣(Capsular polysaccharide)相关。

戈氏副拟杆菌为一种多效型的益生菌，为了更加且全面地了解该益生菌于个体肠胃道的适应性，且许多研究已指出细菌表面的多醣体与其附着于宿主表面、或是适应宿主的生理环境相关；再者，因戈氏副拟杆菌为近期才被分离出来并进行研究的益生菌株，并还未有研究探讨戈氏副拟杆菌的全基因组、编码基因、或是其代谢产物；因此，本发明为更加了解戈氏副拟杆菌于个体肠胃道的适应性，将进一步分预测析本发明的戈氏副拟杆菌中，与细菌荚膜的多醣合成相关的基因，并再进一步探讨该基因的功效或是于该细菌中所扮演的角色。

山梨糖醇是一种六元醇，在自然界中广泛存于各种水果内，例如苹果、桃子、枣子、梅子、及梨子等，山梨糖醇是合成维他命C或山梨糖的主要原料；山梨糖醇因为具有清凉的甜味，且甜度约仅有蔗糖的百分之六十，且每公克热量仅有2.6-3.3大卡，低于一般碳水化合物每公克所提供的4大卡热量，因此，常被应用于减肥或低卡的食品中；再者，山梨糖醇在人体代谢中不受胰岛素的调控，因此食用后血糖值上升的很缓慢，其主要是于肝脏中经由酵素作用生成果糖后，再以果糖的形式被人体代谢，因此山梨糖醇亦常被当成蔗糖的替代品，被使用于糖尿病患者的食品中；又，因为山梨糖醇不会被口腔内的有害细菌利用，因此亦常添加于口香糖中用以预防龋齿，且因具有清凉的甜味，亦可用于无糖口香糖中的甜味剂；另外，因为山梨糖醇具有保湿与保存的功效，且其是最早被允许作为食品添加剂的糖醇之一，可用于提高食品的保湿性、或作为稠化剂的用途，因此烘焙食品亦常加以应用以延长食品的保存期限，而牙膏工业用亦常使用山梨糖醇替代甘油，以作为牙膏的保湿剂及赋形剂，另外在化妆品中，山梨糖醇亦可作为保湿剂及赋形剂。

然而，目前市售的山梨糖醇皆为工业制造，并非天然合成的产物；其中，工业生产山梨糖醇的主要方式是将葡萄糖进行还原，另如将葡萄糖溶液在镍的催化下，经加热、加压、催化加氢后可制得山梨糖醇的原始品，之后再经脱色、去除重金属离子等步骤以获得较纯的山梨糖醇。

虽然，工业制造能够获得大量的山梨糖醇，然而在获得山梨糖醇的原始品后，仍需要经过许多的纯化步骤，不仅造成工业废弃物的产生，亦可能因为纯化流程品管差异，而导致山梨糖醇产物的质量不一或较差，使得实际应用于其他产品时产生困扰。

综合上面所述，研发一种使用天然产生山梨糖醇的方法，着实有其必要性；且若能够利用益生菌生产天然的山梨糖醇，以取代工业制造的山梨糖醇，除了能够减少前述的缺点之外，还能够结合益生菌本身所产生的功效外，以使山梨糖醇能更有效地应用于低卡或减肥食品、糖尿病患者的食品、预防龋齿、增加保湿等多面向的功能中；其中，若能了解该益生菌株中调控山梨糖醇生产的基因，则可按照需求量以控制其产生量。

发明内容

缘此，本发明的一目的在提供一种戈氏副拟杆菌(Parabacteroidesgoldsteinii)用于生产山梨糖醇的用途。

本发明的另一目的在提供一种含有山梨糖醇的组合物，是包含一戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)。

在本发明的一实施例中，该山梨糖醇是由该戈氏副拟杆菌所产生；该山梨糖醇是由该戈氏副拟杆菌的荚膜多醣(Capsular polysaccharide)合成基因所产生；其中，该荚膜多醣合成基因是位于该戈氏副拟杆菌的PSA(Polysaccharide A)基因区；且该戈氏副拟杆菌的保藏编号为DSM 32939。

本发明的戈氏副拟杆菌为一种具多效性的新颖益生菌株，为了更加且全面地了解该益生菌株于个体肠胃道的适应性，本发明进一步分析、预测本发明的戈氏副拟杆菌中，与细菌荚膜的多醣合成相关的基因，并再进一步探讨该基因的功能或是于该细菌中所扮演的角色；预测分析后于本发明的戈氏副拟杆菌的全基因组中，发现九段可能为荚膜多醣基因区的序列片段，其中，因为基因区A(CPS region A)带有与脆弱拟杆菌的NCTC9343菌株中wcfR基因及wcfS基因相似的核酸序列片段，且该二基因所编码的蛋白质在脆弱拟杆菌中，是主要负责该菌的荚膜多醣合成的基因。

因此，后续将本发明的戈氏副拟杆菌的此基因区定义为荚膜多醣合成基因区的wcfR基因以进行研究，并利用接合作用制备含有基因区A的质体，并利用同源重组的方式，将该质体嵌入wcfR基因中以破坏该区基因的编码结构；由聚合酶连锁反应，确认已成功嵌入一段质体序列于本发明戈氏副拟杆菌的wcfR基因中，并造成该基因DNA结构的破坏；且反转录反应及聚合酶连锁反应，亦已确认本发明戈氏副拟杆菌的wcfR基因上嵌入一段质体以破坏其DNA结构后，确实会进一步破坏该基因后续于RNA的合成。

接着，由气相色谱-飞行时间质谱联用仪分析比较本发明戈氏副拟杆菌的原生菌株、与经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’的液体培养代谢产物后，发现本发明戈氏副拟杆菌的原生菌株代谢物中山梨糖醇含量，显著地高于经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’，显示本发明戈氏副拟杆菌可生产出山梨糖醇，且是由涉及调控荚膜多醣的相关基因进行山梨糖醇生产的调控。

本发明利用戈氏副拟杆菌生产天然的山梨糖醇，以取代工业制造时所产生的劣处，同时因戈氏副拟杆菌本身为具多效性的益生菌，因此亦能够结合其本身所产生的功效，以制造益生菌加上山梨糖醇双项结合的组合物，能使山梨糖醇能更有效地应用于低卡或减肥食品、糖尿病患者的食品、预防龋齿、增加保湿等多面向的功能中；再者，本发明能透过调节戈氏副拟杆菌中，涉及调控山梨糖醇生产的相关基因，而可按照需求量以控制山梨糖醇的产量；因此，本发明的戈氏副拟杆菌可用于制备山梨糖醇，且可用于制造益生菌加上山梨糖醇双项结合的组合物，其中该组合物为一食品、一饮品、一营养补充剂、一保养品、或一医药品，且该组合物是粉末、颗粒、溶液、或胶体的剂型，并可藉由口服等方式给予一个体。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的一实施例中戈式副拟杆菌的荚膜多醣基因区预测区的示意图；

图2A是本发明的一实施例中建构戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区突变菌株的示意图；

图2B是本发明的一实施例中确认戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区的DNA结构被破坏的电泳图；

图3A是本发明的一实施例中确认戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区的RNA表现功能被破坏的的测试方法的示意图；

图3B为本发明的一实施例中确认戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区的RNA表现功能被破坏的结果电泳图；

图3C是本发明的一实施例中确认戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区的RNA表现功能被破坏的结果电泳图；

图4是本发明的一实施例中对空白样品以气相色谱-飞行时间质谱联用仪检测分析戈氏副拟杆菌代谢产物的过程中物质残留情况的折线图；

图5A是本发明的一实施例中戈氏副拟杆菌原生菌株、及经荚膜多醣剔除的突变菌株的代谢产物中物质分析的质谱图；

图5B是本发明的一实施例中戈氏副拟杆菌原生菌株、及经荚膜多醣剔除的突变菌株的代谢产物中山梨糖醇含量的柱形图。

具体实施方式

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以单变量变异数分析(One-way ANOVA)进行统计分析。

定义

依据本发明，有关细菌培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

如本文中所使用的，用语「代谢产物」意为培养细菌时，经该细菌代谢后所分泌至细菌培养液中的物质，包含培养该菌的培养液。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种但不限于选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、防腐剂(preservative)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)等。

戈氏副拟杆菌菌株

本发明实施例中所用的戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii,P.goldsteinii)MTS01是一种新颖的益生菌株(Probiotic bacteria)。该戈氏副拟杆菌是寄存于DSMZ-德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,DSMZ)；寄存日期为2018年10月29日；编号DSM 32939。戈氏副拟杆菌为绝对厌氧细菌，需于37℃的无氧培养箱培养约48小时；其中，本发明的实施例中是将戈氏副拟杆菌于37℃下，以Whitley DG250厌氧培养箱(Don Whitley，UK)进行培养，该培养箱是以混合厌氧气体(包含CO₂:10％、N₂:80％、及H₂:10％)制造厌氧环境，并使用厌氧指示剂(Oxoid，UK)以确认环境是否达到厌氧条件。另外，戈氏副拟杆菌的液态培养基为巯基乙酸盐培养基(NIH thioglycollate broth,TGC II，购自BD，美国，编号为225710)，固态培养基则为含5％绵羊血的血液厌氧洋菜胶培养盘(Anaerobic blood agar plate,Ana.BAP，购自启新生物科技公司，中国台湾)。该菌长期保存于-80℃冰箱，保护液为25％的甘油，无须特殊降温处理，且可经由冷冻干燥进行保存，以稳定其活性。

本发明提供一种戈氏副拟杆菌于生产山梨糖醇的用途，本发明的戈氏副拟杆菌是由涉及调控荚膜多醣的相关基因进行山梨糖醇生产的调控。

同时，本发明的亦提供一种含有山梨糖醇的组合物，包含一戈氏副拟杆菌、及一医药上可接受的载体，其中该山梨糖醇是由该戈氏副拟杆菌产生，且该组合物是一食品、一饮品、一营养补充剂、一保养品、或一医药品。

本发明的戈氏副拟杆菌为一种具多效型的益生菌，为了更加且全面地了解该益生菌于个体肠胃道的适应性，且许多研究已指出细菌表面的多醣体(即细菌的荚膜)与其附着于宿主表面、或是适应宿主的生理环境(例如抵抗宿主的免疫反应等)相关；再者，因戈氏副拟杆菌为近期才被分离出来并进行研究的益生菌株，并还未有研究探讨戈氏副拟杆菌的全基因组、编码基因、或是其代谢产物；因此，本发明为更加了解戈氏副拟杆菌于个体肠胃道的适应性，将以下实施例进一步分析、预测本发明的戈氏副拟杆菌中，与细菌荚膜的多醣合成相关的基因，并再进一步探讨该基因的功效或于该细菌中所扮演的角色。

实施例1本发明的戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区的预测

本发明的一实施例为预测本发明的戈氏副拟杆菌MTS01的荚膜多醣合成基因区；其中，已知细菌荚膜的多醣合成基因区通常由数个基因所组成，其中包含糖基转移酶(Glycosyltransferase)、翻转酶(Flippase)、多糖运输蛋白(Polysaccharide exportprotein)、及多糖聚合酶(Polysaccharide polymerase)等功能基因，且多为同向排列的基因组；因此；本实施例以此原则寻找戈氏副拟杆菌MTS01全基因体中，可能为荚膜多醣合成的基因区。

每个待预测的基因皆经由NCBI、KEGG、COG三个公众皆可使用的数据库进行分析。分析结果如图1所示，于本发明的戈氏副拟杆菌MTS01的全基因组中，发现九段CPS region可能为荚膜多醣基因区的序列片段，其中每段基因区大小约为12-36kb，且每段基因区中的每个箭头代表一个开放读序框架(Open reading frame)；其中，糖基转移酶(Glycosyltransferase)为

所示、糖转移酶(Sugar transferase)为

所示、多糖合成蛋白(Polysaccharide biosynthesis protein)为

所示、脂多醣合成蛋白(Lipopolysaccharides(LPS)biosynthesis protein)为

所示、荚膜多醣运输蛋白(Capsule polysaccharide transporter)为

所示、荚膜多醣生成蛋白(Capsuleassembly protein)为

所示、荚膜胞外多醣家族蛋白(Capsule exopolysaccharidefamily protein)为

所示、含O-抗原连接酶结构域的蛋白质(O-antigen ligasedomain containing protein)为

所示、其他功能的基因则为

所示。

图1中的CPS region A(即基因区A，SEQ ID NO.1)带有与脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的菌株NCTC9343的多醣A(Polysaccharide A,PSA)基因区中wcfR基因及wcfS基因相似的核酸序列片段，且其蛋白质序列的相同性分别约为38.6％与69.3％，而在过去研究中已经知道脆弱拟杆菌的wcfR基因及wcfS基因为主要负责该菌的荚膜多醣(Capsular polysaccharide,CPSA)合成的基因；因此，在本发明中将戈氏副拟杆菌WTS01的此基因区定义为荚膜多醣合成基因区，并进行后续的研究。

实施例2本发明的戈氏副拟杆菌的荚膜多醣合成基因区突变菌株的建构和确认

本发明的一实施例为建构和确认本发明的戈氏副拟杆菌MTS01的荚膜多醣合成基因区的突变菌株(以下称MTS01-wcfR’)，用以后续确认实施例1中预测的基因区A为该菌的荚膜多醣合成基因区。考虑到wcfR(胺基醣合成酶，Aminosugar synthetase)基因为合成荚膜多醣的重要基因，因此本发明实施例中选择破坏此基因，以制造本发明的戈氏副拟杆菌MTS01于荚膜多醣的缺失(Knock out)。建构突变菌株MTS01-wcfR’的方法如图2A所示；首先，使用下表1中SEQ ID NO.2的引物(5’-ATTGCCATGTGCTGTCAGAC-3’)及SEQ ID NO.3的引物(5’-TCACCACACATCTTTCCAT G-3’)以聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)将戈氏副拟杆菌MTS01菌株的基因体上的wcfR基因(参见图2A中A的灰色方块区，其中A代表基因区A)放大，且使该放大的wcfR基因片段两端皆带有EcoRV的切位点，并使用EcoRV将该经放大的wcfR基因片段，嵌入同样带有EcoRV切位点的pKNOCK-bla-ermGb质体中，其中该质体带有ermG基因，其为一特定的抗药基因，可用于后续筛选菌株中是否成功带有该质体。

表1.聚合酶连锁反应的组合引物

接着，再将本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与带有建构完成的pKNOCK-bla-ermGb质体的大肠杆菌S17-1λ-pir同时混合，并使其二者于滤纸上、置于有氧环境下36小时以进行接合作用(Conjugation)，以使将大肠杆菌中建构完成的pKNOCK-bla-ermGb质体转移至本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中；并且，该质体转移至本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中后，会与戈氏副拟杆菌MTS01菌株的基因体上的wcfR基因的片段(即灰色方块区)对应，并发生同源重组(Homologous recombination)，以将该质体插入戈氏副拟杆菌MTS01原生菌株的基因体内，以破坏本发明的戈氏副拟杆菌MTS01的wcfR基因，藉此得到带有荚膜多醣突变基因的戈氏副拟杆菌MTS01-wcfR’菌株，如图2A所示；接着，以含有4μg/mL的氯霉素(Chloramphenicol)及10μg/mL的红霉素(Erythromycin)的绵羊血洋菜胶培养盘上筛选突变菌株MTS01-wcfR’，最后以下表2.中A、B、及C三组引物配对确认突变菌株MTS01-wcfR’是否完成。

表2.聚合酶连锁反应的组合引物

接着，为了确认本发明的戈氏副拟杆菌MTS01的荚膜多醣基因是否已成功地被破坏，分别使用引物对A、B及C对所筛选出具有荚膜多醣突变的戈氏副拟杆菌的突变菌株MTS01-wcfR’(Mutant,M)、以及本发明的戈氏副拟杆菌的原生菌株(Wild-type,W)进行聚合酶连锁反应，并以洋菜胶电泳的方式，确认经聚合酶连锁反应分别得到的产物大小；其中，若成功破坏戈氏副拟杆菌的wcfR基因(即成功嵌入建构完成的pKNOCK-bla-ermGb质体)，便会使得突变株丧失原生株原有于750bp位置左右可见到一核酸产物，即使用引物对A，应仅有原生菌株可见该750bp的核酸产物，突变菌株MTS01-wcfR’则无该产物；若使用引物对B或C，则应仅有突变菌株MTS01-wcfR’可见该750bp的核酸产物，原生菌株则无。

该实验结果如图2B所示，使用引子配对A进行聚合酶连锁反应，仅有原生菌株于750bp位置左右见到一核酸产物；而不论是使用引物对B或C进行聚合酶连锁反应，皆可在突变菌株MTS01-wcfR’的组别中，于750bp位置左右见到一核酸产物，而原生株则皆未有该核酸产物，此结果显示本实施例中利用同源基因重组的方法，已成功将本发明的戈氏副拟杆菌MTA01的wcfR基因中，嵌入一段质体序列，并造成该基因DNA结构的破坏。

实施例3本发明的戈氏副拟杆菌的wcfR基因的破坏会影响RNA的合成

实施例2中已证实在本发明戈氏副拟杆菌的wcfR基因上嵌入一段质体以破坏其DNA结构，而本发明的一实施例为确认破坏该基因的DNA结构后，会进一步对该基因后续于RNA的合成造成影响；如图3A所示，本实施例中在wcfR基因上分别设计三对引物，分别为primer1、primer2、及primer3；首先，以

MiniKit(Qiagen,Valencia,CA,USA)分别萃取出前述wcfR基因的DNA结构已被破坏的戈氏副拟杆菌突变菌株MTS01-wcfR’、以及戈氏副拟杆菌原生菌株中总核醣核酸(Total RNA)，接着利用Quant II快速反转录酶试剂套组(Tools，中国台湾)，以萃取的Total RNA作为模板并分别以下表3中primer1、primer2、及primer3三对引物进行反转录反应，以获取互补脱氧核醣核酸(cDNA)，再以聚合酶连锁反应比较突变菌株MTS01-wcfR’与原生菌株MTS01之间的差异，并以RNA为负控制组(Negativecontrol)；若单纯进行聚合酶连锁反应无法得到具有明显信号的产物，则可进行巢式PCR(Nested PCR)，即将第一次的聚合酶连锁反应产物作为第二次聚合酶连锁反应循环的模版，以提高产物信号的特异性及灵敏度。

表3.聚合酶连锁反应的组合引物

其中，primer1及primer2皆是针对未被破坏的wcfR基因进行放大，其中Primer1为pg-wcfR-out R’-R加上pg-wcfR-out-F，所得产物应为863bp；而Primer2则为PSA-wcfR-outF-F加上pg-wcfR-R，所得产物应为647bp；因此，以primer1及primer2进行反转录反应及聚合酶连锁反应，只会放大出正常的wcfR基因片段产物，而被破坏掉的wcfR基因并不会有反应；另外，primer3则是针对以pKNOCK-bla-ermGb进行荚膜多醣剔除(PSA-KO)的质体上所带有的抗药基因进行放大，其中Primer3为ermG-F加上ermG-R，所得产物大小应为350bp；因此，以primer3进行反转录反应及聚合酶连锁反应，只有具有荚膜多醣突变的菌株才会得到放大的片段产物，若wcfR基因未被破坏则将不会有被放大的片段产物。

该实验结果如图3B及图3C所示。其中，由图3B的结果可见，经由引物对Primer3进行反转录反应及聚合酶连锁反应，在荚膜多醣剔除的戈氏副拟杆菌突变菌株MTS01-wcfR’中可成功得到大小约为350bp的cDNA产物，而戈氏副拟杆菌的原生菌株中并未有此大小的产物信号；而由图3C的结果可见，经由引物对Primer2进行反转录反应及巢式聚合酶连锁反应，在戈氏副拟杆菌的原生菌株中可成功得到大小约为647bp的cDNA产物，而在荚膜多醣剔除的戈氏副拟杆菌突变菌株MTS01-wcfR’中并未有此大小的产物信号。此些结果显示，本发明戈氏副拟杆菌的wcfR基因上嵌入一段质体以破坏其DNA结构后，确实会进一步破坏该基因后续于RNA的合成。

实施例4本发明的戈氏副拟杆菌的代谢物的分析

本发明的一实施例为确认本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中该被预测为荚膜多醣合成基因区的序列，究竟在戈氏副拟杆菌MTS01中扮演何种角色，本实施例以气相色谱-飞行时间质谱联用仪(GC-TOF-MS)分析比较本发明戈氏副拟杆菌MTS01原生菌株、与经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’的液体培养代谢产物有何差异，并以空白液体培养基作为对照组。

首先，进行代谢物的萃取，将100μL的样本(即培养该原生菌株MTS01及突变菌株MTS01-wcfR’后培养液)于1.5mL的离心管(Eppendorf)中，并加入0.35mL的甲醇作为萃取溶剂，再加入10μL的核糖醇作为内标准物，于震荡仪上震荡30秒以均匀混合后，于冰水浴槽中以超音波震荡10分钟，再将样本于4℃、12000rpm下离心15分钟，接着取出0.34mL的上清液于新的1.5mL离心管中，并在真空浓缩器中干燥萃取物，待干燥后，将该经纯化的代谢物加入60μL的甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于20mg/mL的吡啶(pyridine)中)，并轻轻混匀后，放入烘箱中以80℃反应30分钟，接着于每个样品中各加入80μL的N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)，其中含有1％的三甲基氯硅烷(Trimethylsilyl chloride,TMCS,v/v)，将该些混合物70℃反应1.5小时后，以气相色谱-飞行时间质谱联用仪进行检测。

本实施例使用的Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪配有Agilent DB-5MS毛细管柱(30m×250μm×0.25μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)，气相色谱-飞行时间质谱联用仪的具体分析仪器参数条件如下表4.所示。

表4.

以气相色谱-飞行时间质谱联用仪检测完后，皆者使用MS-DIAL软件对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等数据的处理与分析。其中，于物质定性的工作中，是使用FiehnBinbase的数据库，其包含质谱的匹配及保留时间指数的匹配。

在质量管控的部分，主要是通过对空白样品的检测，以考察在检测过程中物质残留的情况，检测结果可从图4中看出，空白样品中并无显著峰检出，说明本实施例中物质残留管控良好，不存在样品间交叉污染的现象。

利用表5中所列的已知的标准品作为内标准物，测量该些标准物的滞留时间，藉此确认实验数据，并作为标准化实验数据的参考数值。

表5.

FAMEs	RT(min)	Fiehn RI
			C8	5.4870	262320
C9	6.2362	323120
			C10	6.9540	381020
C12	8.2770	487220
			C14	9.4630	582620
C16	10.5370	668720
			C18	11.5130	747420
C20	12.4070	819620
			C22	13.2330	886620
C24	13.9960	948820
			C26	14.7760	1006900
C28	15.7180	1061700
			C30	16.8480	1113100

本发明戈氏副拟杆菌MTS01原生菌株、及经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’的液体培养代谢产物的物质分析结果如图5A及图5B所示。由图5A的结果可见，本发明戈氏副拟杆菌MTS01原生菌株、经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’、及空白液体培养基的对照组织三组培养液中所有代谢产物的分析信号，一共侦测出2703个信号，其中最底层的折线为空白液体培养基的信号，最高层的折线为本发明戈氏副拟杆菌MTS01原生菌株的信号，中间层的折线为经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’的信号；该所侦测出的每一个信号皆与数据库的质谱信号进行比对，其中三种培养液中侦测到的山梨糖醇信号显著不同；然而，由于侦测到的信号很多，不易直接以图5A看出显示出差异的代谢产物，因此以图5B的柱状图呈现该三种培养液中侦测到的山梨糖醇的表现量。

由图5B的结果可见，经过分析比对，并比较三组液体培养代谢产物的物质间的差异，发现本发明戈氏副拟杆菌MTS01原生菌株代谢物中山梨糖醇含量，显著地高于经荚膜多醣剔除的突变菌株MTS01-wcfR’；其中，是以空白液体培养基中山梨糖醇的含量作为1进行比较。此结果显示本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株可生产出山梨糖醇，且是由涉及调控荚膜多醣的相关基因进行山梨糖醇生产的调控。

综上所述，本发明的戈氏副拟杆菌为一种具多效性的新颖益生菌株，为了更加且全面地了解该益生菌株于个体肠胃道的适应性，本发明进一步分析、预测本发明的戈氏副拟杆菌中，与细菌荚膜的多醣合成相关的基因，并再进一步探讨该基因的功能或是于该细菌中所扮演的角色；预测分析后于本发明的戈氏副拟杆菌的全基因组中，发现九段可能为荚膜多醣基因区的序列片段，其中，因为基因区A(CPS region A)带有与脆弱拟杆菌的NCTC9343菌株中wcfR基因及wcfS基因相似的核酸序列片段，且该二基因所编码的蛋白质在脆弱拟杆菌中，是主要负责该菌的荚膜多醣合成的基因。

本发明利用戈氏副拟杆菌生产天然的山梨糖醇，以取代工业制造时所产生的劣处，同时因戈氏副拟杆菌本身为具多效性的益生菌，因此亦能够结合其本身所产生的功效，以制造益生菌加上山梨糖醇双项结合的组合物，能使山梨糖醇能更有效地应用于低卡或减肥食品、糖尿病患者的食品、预防龋齿、增加保湿等多面向的功能中；再者，本发明能透过调节戈氏副拟杆菌中，涉及调控山梨糖醇生产的相关基因，而可按照需求量以控制山梨糖醇的产量；因此，本发明的戈氏副拟杆菌可用于制备山梨糖醇，且可用于制造益生菌加上山梨糖醇双项结合的组合物，其中该组合物是一食品、一饮品、一营养补充剂、一保养品、或一医药品，且该组合物是粉末、颗粒、溶液、或胶体的剂型，并可藉由口服等方式给予一个体。

【生物材料寄存】

戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)，保藏编号DSM 32939，保存单位为DSMZ-德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,DSMZ)；保存地址：德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B；保存日期为2018年10月29日。