CN112684029A - 一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法及装置，该方法利用LC‑MS对烟叶代谢物进行非靶向代谢物检测分析，并通过XCMS在线平台进行数据预处理和统计分析，筛选出烟叶差异代谢物，构建其分子结构式库，并结合MS‑FINDER软件中质谱预测方法，对筛选出的差异代谢物进行定性，筛选出一种或多种判断烟叶成熟度的差异代谢物。通过检测判断烟叶成熟度的差异代谢物离子流强度，判断烟叶成熟度。该装置是以光谱数据采集单元获取待测烟叶样品的红外光吸收值，通过预测模型预测用于判断烟叶成熟度的差异代谢物的离子流强度大小，最后根据判断模型判断待测烟叶的成熟度。本发明实现了烟叶成熟度的快速、准确判断，为后续烟叶烘烤提供了保障。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法及装置。
背景技术
鲜烟素质可作为鲜烟采收成熟度的内在基础与成熟度形成对应关系，根据烟叶的外观特征将不同部位鲜烟叶分为欠熟、适熟、过熟，研究不同成熟度与烤后烟质量的关系，表明适熟烟叶烤后烟质量最佳。适宜成熟度烟叶可以提高烟农收益和工业可用性。但在生产中，由于地域不同，气候、土壤肥力、水分、栽培方式等有较大差异，适宜成熟度的标准不同，青烟早采和熟烟晚采的现象较为普遍，对烤后烟质量也有不利的影响。欠熟和过熟烟叶采烤的烤后烟叶化学成分不协调，评吸质量表现为香气质差、香气量不足，刺激性明显，潜在质量特征未充分彰显，烟叶内在品质有较大提升空间。适熟处理初烤烟叶产质量最高、内在化学成分最协调、感官评吸质量最好。
不同成熟度烟叶中生物碱，类固醇，酚类，脂质等物质有很大差异，在不同成熟度条件下有不同的应用价值，这些特定的代谢产物可能成为质量评估和确定采收期的潜在指标，但是，现有的检测方法不能直观的反应各代谢物在不同成熟度下的变化情况，无法对不同成熟度烟叶采收提供指导。
代谢组学是对有机体代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理和病理变化相对关系的研究。按研究的目的，代谢组学又可分为靶向和非靶向，其中非靶向代谢组学能从整体反映代谢物的变化，全面地挖掘小分子代谢物，有利于发现新的代谢物和代谢通路。
因此，基于非靶向代谢组学通过高通量的仪器分析技术，研究
一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法及装置是很有必要的。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，本发明的第二目的是提供一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法，本发明的第三目的是提供一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的装置。
本发明的第一目的是这样实现的，本发明一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取不同烤烟品种、不同部位、不同成熟度烟叶中的代谢物得到烟叶代谢提取物；
B、采用LC-MS对所述烟叶代谢提取物进行非靶向代谢物检测分析，得到不同烤烟不同成熟度烟叶的色谱图数据；
C、采用XCMS在线平台对所述色谱图数据进行特征峰检测和对齐，生成具有质荷比、保留时间和强度信息的特征峰表；再通过PCA法评价得到液质数据中是否存在批次效应；移除批次效应后，采用t-SNE对所述特征峰表进行降维以及可视化；最后采用OPLS-DA法建立不同烤烟品种不同成熟度烟叶样品之间的分类模型，并筛选出相关差异代谢物；
D、构建烟叶代谢物分子结构式库，并转换成MS-FINDER 3.44软件可用格式，结合MS-FINDER软件中质谱预测方法，对筛选出的差异代谢物进行定性。
本发明的第二目的是这样实现的，一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法，具体方法如下：基于上述方法所筛选出的不同成熟度烟叶中具有显著差异的一种或多种差异代谢物含量，利用所述的LC-MS检测方法直接检测烟叶中具有显著差异的一种或多种差异代谢物离子流强度大小，根据离子流强度大小判断待测烟叶的成熟度，所述一种或多种差异代谢物为尼古丁氮氧化合物和降烟碱。
本发明的第三目的是这样实现的，一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的装置，包括光谱数据采集单元，数据传输单元，数据处理单元、数据输出单元及数据存储单元；所述光谱数据采集单元将采集的待检测烟叶样品的红外光吸收值通过数据传输单元传送至数据处理单元，数据处理单元根据红外光吸收值预测具有显著差异的差异代谢物的离子流强度大小，判断模型根据具有显著差异的差异代谢物的离子流强度判断得出待检测烟叶的成熟度，并通过数据输出单元输送至智能检测终端并自动存储到数据存储单元中。
本发明的有益效果为：本发明首次基于非靶向代谢组学通过高通量的仪器对不同成熟度的烟叶进行大量差异代谢物分析鉴定，为烟叶的质量评估及烟叶采收期的确定提供了依据及指导。本发明基于上述差异代谢物定性结果，选取不同成熟度烟叶代谢物含量具有显著差异的尼古丁氮氧化合物和降烟碱的相对含量作为判断烟叶成熟度的指标，从而实现烟叶成熟度的快速、准确判断。其中，尼古丁氮氧化合物和降烟碱的相对含量的测定仅需通过测定烟叶样品中红外吸收光吸收值，再通过预测模型预测尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度即可实现，操作方法省时简单，适用于大批量烟叶成熟度的检测；另外，本发明基于烟叶差异代谢物含量判断烟叶成熟度的方法准确率高达97.4%，有效地避免了通过传统肉眼对烟叶状态判断失误，从而导致烟叶烤制的质量的下降，为后续烟叶烘烤提供了保障，提高了烤烟烘烤质量，值得推广应用。
附图说明
图1为本发明一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的装置的原理示意图；
图2为本发明一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的装置的具体结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
本发明一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取不同烤烟品种、不同部位、不同成熟度烟叶中的代谢物得到烟叶代谢提取物；
B、采用LC-MS对所述烟叶代谢提取物进行非靶向代谢物检测分析，得到不同烤烟不同成熟度烟叶的色谱图数据；
C、采用XCMS在线平台对所述色谱图数据进行特征峰检测和对齐，生成具有质荷比、保留时间和强度信息的特征峰表；再通过PCA法评价得到液质数据中是否存在批次效应；移除批次效应后，采用t-SNE对所述特征峰表进行降维以及可视化；最后采用OPLS-DA法建立不同烤烟品种不同成熟度烟叶样品之间的分类模型，并筛选出相关差异代谢物；
D、基于文献资料构建烟叶代谢物分子结构式库，并转换成MS-FINDER 3.44软件可用格式，结合MS-FINDER软件中质谱预测方法，对筛选出的差异代谢物进行定性。
所述步骤A中，烟叶代谢提取物的提取步骤如下：在低温液氮环境下将烟叶磨成粉末后过30-50目筛得到烟叶样品，使烟叶粉末的质量均质化，再取100mg烟叶样品用体积比为7:3-8:2的甲醇/水溶液1-1.5mL进行超声提取得提取液，将提取液离心过滤后干燥即得目标物。
烟叶代谢提取物的具体提取步骤如下：将烟叶样品置于2 mL Eppendorf管中先涡旋20-30秒钟使样品混匀，然后超声处理30-50min，之后在4℃下以13000-16000g离心8-12分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂得到提取物，最后将提取物置于-20℃的冰箱中进行储存；
所述步骤B中，液相色谱分离条件为：进样量1.5-2μL，柱温40℃。100nm×2.1mm，1.7μm的ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相色谱柱为固定相，用于分析的流动相组成如下：流动相A为含有0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B为含有0.1％甲酸的水溶液，梯度洗脱程序为95%B，0.01-1.0min；90%B，0.01-10min；80%B，10-20min；65%B，20-30min；58%B，30-33min；50%B，33-35min；20%B，35-40min；0%B，40-48min，流速为0.4mL/min，总洗脱时间为48分钟；
质谱仪参数为：质量范围为50-1,000 m/z。CDL温度为200°C，加热块温度设为200°C，雾化气体N2保持在流速为1.5 L/min，干燥气体N2压力100kPa，离子阱压力1.8×10-5kPa，离子累积时间60ms。检测器电压设定为1.62kV。RP真空度设为85.0-92.0Pa，IT真空度设为1.8×10-2 Pa，TOF真空度设为1.3×10-4 Pa；在进行MS/MS分析时，以1.5L/min的流速，并在100KPa压力下施加干燥气体N2，碰撞能量设置为50％。
所述步骤C中，利用XCMS进行样品中特征峰的检测时，采用centWave算法，Peakwidth = c(20, 80), noise = 5000, prefilter = c(3, 5000)，然后使用chromPeaks函数访问峰检测分析的结果，且rt和mz参数可以从数据的特定区域提取已识别的色谱峰。
所述步骤C中，采用XCMS进行样品中峰对齐的检测时，使用peakGroups方法，估计样品之间的保留时间偏移，通过设置参数minFraction = 0.4，(检测到存在候选的色谱峰的样本比例)，span = 0.6, (在实验的所有样本中有90％检测到色谱峰)进行对齐，之后，调整后的保留时间与原始保留时间一起存储在结果中，可以通过调用AdjustRtime来调整已识别的色谱峰的保留时间。
所述步骤C中，所述OPLS-DA法建立不同成熟度烟叶样品之间的分类模型，并筛选出相关差异代谢物时，具体步骤为：
1）使用Metaboanalyst导入过熟和欠熟烟叶的代谢特征的原始数据，进行t检验，设置矫正值FDR<0.01,筛选出一些显著性差异大的代谢物；
2）将上一步筛选出的代谢物的经过数据标准化后的的代谢特征的数据导入simca-p中，设置class值，分为两组；
3）进行数据归一化，选择合适的数据归一化类型；
4）进行数据的自动拟合，得到OPLS-DA模型的使R2Y与Q2 尽可能接近1，且差值不超过0.3；
5）绘制散点图，并进行200次置换检验，当Q2与Y轴的交点小于或等于0时，模型没有过拟合，表明此模型可靠；
6）计算此模型中各个代谢物的VIP值，进行代谢物筛选，筛选条件为：过熟烟叶和欠熟烟叶，VIP>1.5且FDR(矫正过的p值)<0.01；过熟烟叶和适熟烟叶，欠熟烟叶和适熟烟叶，VIP>1且FDR(矫正过的p值)<0.05。
本发明一种基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度的方法，基于上述所筛选出的不同成熟度烟叶中具有显著差异的一种或多种差异代谢物含量，利用所述LC-MS检测方法直接检测烟叶中具有显著差异的一种或多种差异代谢物离子流强度大小，根据离子流强度大小判断待测烟叶的成熟度。
优选地，将烟叶中尼古丁氮氧化合物和降烟碱的作为不同烟叶成熟度判断标准；烟叶中尼古丁氮氧化合物和/或降烟碱的相对含量是通过离子流强度来反应。根据离子流强度大小判断待测烟叶的成熟度的判断标准为：当烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度在2.3~3.2×106，降烟碱离子流强度在2.0~3.8×107范围内时，判断烟叶为适熟烟叶；当烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度大于3.2×106，降烟碱离子流强度小于2.0×107时，判断烟叶为欠熟；当尼古丁氮氧化合物离子流强度小于2.3×106，降烟碱离子流强度大于3.8×107时，判断烟叶为过熟。
本发明快速检测烟叶成熟度的装置，包括光谱数据采集单元，数据传输单元，数据处理单元、数据输出单元及数据存储单元；所述光谱数据采集单元将采集的待检测烟叶样品的红外光吸收值通过数据传输单元传送至数据处理单元，数据处理单元根据红外光吸收值预测具有显著差异的差异代谢物的离子流强度，判断模型根据具有显著差异的差异代谢物的离子流强度大小判断得出待检测烟叶的成熟度，并通过数据输出单元输送至智能检测终端并自动存储到数据存储单元中。
在本发明中，预测模型的建立方法如下：首先，基于文献找到尼古丁氮氧化合物和降烟碱的红外吸收光谱范围，再经过查阅文献及试验数据分析处理，分别建立通过红外吸收光吸收值预测尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度的预测模型。
所述判断模型为：当预测的烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值在2.3~3.2×106，降烟碱离子流强度预测值在2.0~3.8×107范围内时，判断烟叶为适熟烟叶；当预测的烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值大于3.2×106，降烟碱离子流强度预测值小于2.0×107时，判断烟叶为欠熟；当预测的尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值小于2.3×106，降烟碱离子流强度预测值大于3.8×107时，判断烟叶为过熟。
所述光谱数据采集单元包括红外光谱仪及检测器，其是这样工作的：不同波段的红外光源发射经过干涉仪，照射到待测烟叶样品上，再经过检测器采集红外吸收光谱数据；
所述数据传输单元为记录仪或键盘和/或读写笔或触摸屏或为读写笔和触摸屏。
所述数据处理单元为51系列单片机、AVR单片机、PIC单片机、ARM处理器中的任意一种，或为相匹配的CPU处理器。
所述数据输出单元为显示器或打印机。
所述烟叶为K326、云烟系列、红花大金元。
作为优选，本发明一种快速检测烟叶成熟度的装置，如图1和图2所示，包括红外光谱仪、检测器、记录仪、数据处理器、数据转换器、信号放大器、显示器及存储器。
本装置的使用方法如下：使用红外光谱仪检测待测烟叶样品的不同红外波段下的红外光吸收值，检测器将测得的红外光吸收值红外干涉图数据通过记录仪传输到数据处理器，数据处理器利用红外光吸收值与尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度的预测模型，对数据进行分析处理预测获得尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度数据，并根据离子流强度大小对烟叶成熟度进行判断，当预测的烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值在2.3~3.2×106，降烟碱离子流强度预测值在2.0~3.8×107范围内时，判断烟叶为适熟烟叶；当预测的烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度大于3.2×106，降烟碱离子流强度预测值小于2.0×107时，判断烟叶为欠熟；当预测的尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值小于2.3×106，降烟碱离子流强度预测值大于3.8×107时，判断烟叶为过熟；成熟度判断结果通过数据转化器转换成模拟信号，被放大器放大，传输到显示器上，自动存储到存储器中。
以下结合实施例对本发明基于烟叶差异代谢物含量快速检测烟叶成熟度方法做进一步说明。
实施例1
在玉溪市江川区九溪镇采集K326上部烟叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例2
在玉溪市九溪镇采集K326中部叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例3
在玉溪市江川区九溪镇采集K326下部叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例4
在玉溪市江川区九溪镇采集红花大金元上部叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例5
在玉溪市江川区九溪镇采集红花大金元中部叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例6
在玉溪市江川区九溪镇采集红花大金元下部烟叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各10片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例7
在玉溪市研和镇采集云烟87上部叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例8
在玉溪市研和镇采集云烟87中部烟叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例9
在玉溪市研和镇采集云烟87下部烟叶，包括三个成熟度（适熟、欠熟及过熟）的烟叶各30片，在液氮的条件下磨成粉末，通过40目筛过滤，使烟叶粉末的质量均质化；将100毫克粉末状样品转移至2 mL Eppendorf管中，加入1 mL甲醇水溶液(甲醇/水=8:2)；将样品涡旋20秒钟，然后超声处理30分钟，并在4℃下以16000g离心10分钟；离心后，获得上清液，并使其通过孔径为0.22μm的针孔过滤器进行过滤，然后在室温下，在氮气的条件下吹干溶剂，此时吹干的样品可放在-20℃的冰箱中进行储存；测定时，将干燥的样品再次溶于300μL萃取溶剂中，利用LC-MS检测方法对烟叶样品中尼古丁氮氧化合物和降烟碱代谢物离子流强度进行检测，根据烟样离子流强度大小，结合本发明方法成熟度判断标准，进而判断各烟叶样品的成熟度。
实施例1-9中根据检测所得烟样离子流强度大小，进行烟叶样品成熟度判断时，判断标准均如下：当所测烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度在2.3~3.2×106，降烟碱离子流强度在2.0~3.8×107范围内时，判断烟叶为适熟烟叶；当所测烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度大于3.2×106，降烟碱离子流强度小于2.0×107时，判断烟叶为欠熟；当所测烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度小于2.3×106，降烟碱离子流强度大于3.8×107时，判断烟叶为过熟。
试验例
将实施例1-9所检测判断出的不同成熟度烟叶，交给10为烟叶栽培、烘烤领域专家，再次进行成熟度判定，根据10位专家给出的判断结果，计算实施例1-9中对不同烤烟品种不同部位烟叶成熟度判断准确率，结果如表1所示：
表1实施例1-9中对不同烤烟品种不同部位烟叶成熟度判断准确率
由表1可得，本发明检测烟叶成熟度的方法针对烤烟品种K326、红花大金元及云烟87不同部位烟叶成熟度判断准确率均在95%以上，最高可达97.40%。以上数据说明本发明检测烟叶成熟度的方法准确率高，适于推广应用。
Claims (10)
1.一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取不同烤烟品种、不同部位、不同成熟度烟叶中的代谢物得到烟叶代谢提取物；
B、采用LC-MS对所述烟叶代谢提取物进行非靶向代谢物检测分析，得到不同烤烟不同成熟度烟叶的色谱图数据；
C、采用XCMS在线平台对所述色谱图数据进行特征峰检测和对齐，生成具有质荷比、保留时间和强度信息的特征峰表；再通过PCA法评价得到液质数据中是否存在批次效应；移除批次效应后，采用t-SNE对所述特征峰表进行降维以及可视化；最后采用OPLS-DA法建立不同烤烟品种不同成熟度烟叶样品之间的分类模型，并筛选出相关差异代谢物；
D、构建烟叶代谢物分子结构式库，并转换成MS-FINDER 3.44软件可用格式，结合MS-FINDER软件中质谱预测方法，对筛选出的差异代谢物进行定性。
2.根据权利要求1所述不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤A中，烟叶代谢提取物的提取步骤如下：在低温液氮环境下将烟叶磨成粉末后过30-50目筛得到烟叶样品，取100mg烟叶样品用体积比为7:3-8:2的甲醇/水溶液1-1.5mL进行超声提取得提取液，将提取液离心过滤后干燥即得目标物。
3.根据权利要求1所述不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤B中，液相色谱分离条件为：进样量1.5-2μL，柱温40℃，100nm×2.1mm,1.7μm的ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相色谱柱为固定相，用于分析的流动相组成如下：流动相A为含有0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B为含有0.1％甲酸的水溶液，梯度洗脱程序为95%B，0.01-1.0min；90%B，0.01-10min；80%B，10-20min；65%B，20-30min；58%B，30-33min；50%B，33-35min；20%B，35-40min；0%B，40-48min，流速为0.4mL/min，总洗脱时间为48分钟；
质谱仪参数为：质量范围为50-1,000 m/z，CDL温度为200°C，加热块温度设为200°C，雾化气体N2保持在流速为1.5 L/min，干燥气体N2压力100kPa，离子阱压力1.8×10-5kPa，离子累积时间60ms；检测器电压设定为1.62kV，RP真空度设为85.0-92.0Pa，IT真空度设为1.8×10-2 Pa，TOF真空度设为1.3×10-4 Pa；在进行MS/MS分析时，以1.5L/min的流速，并在100KPa压力下施加干燥气体N2，碰撞能量设置为50％。
4.根据权利要求1所述一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤C中，利用XCMS进行样品中特征峰的检测时，采用centWave算法，Peakwidth =c(20, 80), noise = 5000, prefilter = c(3, 5000)，然后使用chromPeaks函数访问峰检测分析的结果，且rt和mz参数可以从数据的特定区域提取已识别的色谱峰。
5.根据权利要求4所述一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤C中，采用XCMS进行样品中峰对齐的检测时，使用peakGroups方法，估计样品之间的保留时间偏移，通过设置参数minFraction = 0.4，span = 0.6, 进行对齐之后，调整后的保留时间与原始保留时间一起存储在结果中，通过调用AdjustRtime来调整已识别的色谱峰的保留时间。
6.根据权利要求1所述一种不同成熟度烟叶中大量差异代谢物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤C中，所述OPLS-DA法建立不同成熟度烟叶样品之间的分类模型，并筛选出相关差异代谢物时，具体步骤如下：
1）使用Metaboanalyst导入过熟和欠熟烟叶的代谢特征的原始数据，进行t检验，设置矫正值FDR<0.01,筛选出一些显著性差异大的代谢物；
2）将步骤1筛选出的代谢物的经过数据标准化后的的代谢特征的数据导入simca-p中，设置class值，分为两组；
3）进行数据归一化及自动拟合，得到OPLS-DA模型的使R2Y与Q2尽可能接近1，且差值不超过0.3；
4）绘制散点图，并进行200次置换检验，当Q2与Y轴的交点小于或等于0时，说明分类模型没有过拟合，表明所述分类模型可靠；
5）计算所述分类模型中各个代谢物的VIP值，进行代谢物筛选，筛选条件为：过熟烟叶和欠熟烟叶，VIP>1.5且FDR<0.01；过熟烟叶和适熟烟叶，欠熟烟叶和适熟烟叶，VIP>1且FDR<0.05。
7.一种基于烟叶差异代谢物含量的快速检测烟叶成熟度的方法，其特征在于，基于权利要求1所述方法鉴定获得的不同成熟度烟叶中具有显著差异的一种或多种差异代谢物含量，利用权利要求1中所述的LC-MS检测方法直接检测烟叶中具有显著差异的一种或多种差异代谢物离子流强度大小，根据离子流强度大小判断待测烟叶的成熟度。
8.根据权利要求7所述的一种基于烟叶差异代谢物含量的快速检测烟叶成熟度的方法，其特征在于，所述判断烟叶成熟度的差异代谢物为尼古丁氮氧化合物和降烟碱；所述根据离子流强度大小判断待测烟叶的成熟度的判断标准为：当烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度在2.3~3.2×106，降烟碱离子流强度在2.0~3.8×107范围内时，判断烟叶为适熟烟叶；当烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度大于3.2×106，降烟碱离子流强度小于2.0×107时，判断烟叶为欠熟；当尼古丁氮氧化合物离子流强度小于2.3×106，降烟碱离子流强度大于3.8×107时，判断烟叶为过熟。
9.一种基于烟叶差异代谢物含量的快速检测烟叶成熟度的装置，其特征在于，包括光谱数据采集单元，数据传输单元，数据处理单元，数据输出单元及数据存储单元；所述光谱数据采集单元将采集的待检测烟叶样品的红外光吸收值通过数据传输单元传送至数据处理单元，数据处理单元根据红外光吸收值预测具有显著差异的差异代谢物的离子流强度，判断模型根据具有显著差异的差异代谢物的离子流强度判断得出待检测烟叶的成熟度，并通过数据输出单元输送至智能检测终端并自动存储到数据存储单元中。
10.根据权利要求9所述的一种基于烟叶差异代谢物含量的快速检测烟叶成熟度的装置，其特征在于，所述具有显著差异的差异代谢物为尼古丁氮氧化合物和降烟碱；所述判断模型为：当预测的烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值在2.3~3.2×106，降烟碱离子流强度预测值在2.0~3.8×107范围内时，判断烟叶为适熟烟叶；当预测的烟叶尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值大于3.2×106，降烟碱离子流强度预测值小于2.0×107时，判断烟叶为欠熟；当预测的尼古丁氮氧化合物离子流强度预测值小于2.3×106，降烟碱离子流强度预测值大于3.8×107时，判断烟叶为过熟。
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