CN112680445A - 一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA、重组载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向敲减小鼠肝脏Atf6α基因表达的重组8型腺相关病毒(rAAV8)‑Atf6α shRNA构建及其应用，属于肝脏疾病治疗研究技术领域，本发明中，所述shRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述靶向敲减小鼠肝脏Atf6α基因表达的重组载体，包括骨架载体pAAV8和所述shRNA。本发明所述靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA能够敲减Atf6α基因表达，能够应用于肝内内质网应激相关的小鼠模型研究中，有利于进一步了解Atf6α基因表达在肝损伤中的作用；从而为临床防治肝脏疾病提供新思路和靶点。

Description

一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA、重组载体及其应用

技术领域

本发明属于肝脏疾病治疗研究技术领域，尤其涉及一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA、重组载体及其应用。

背景技术

肝脏作为人体重要的解毒与消化器官，易暴露于损伤因素中。因其含有丰富的内质网(ER)，在受到刺激时易产生内质网应激(ERS)来促进细胞内环境恢复平衡。ERS被认为参与急性和慢性肝病的发病机制，如各种肝炎、脂肪变性、胆汁淤积、纤维化和肝细胞癌。ERS可通过影响细胞凋亡及程序性坏死与肝损伤密切相关。

研究表明，ATF6α是内质网应激感受器蛋白，在维持细胞内环境稳态中起着关键作用。调节Atf6α基因表达有利于研究ATF6α信号在肝损伤中的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA、重组载体及其应用；本发明提供的shRNA、重组载体能够敲减Atf6α基因的表达，适用于肝内内质网应激相关的小鼠模型研究中，利于进一步了解Atf6α基因表达在肝损伤中的作用；从而为临床防治肝脏疾病提供新思路和靶点。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA，所述shRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下5’-GCAGTCGATTATCAGCATACA-3’。

优选的，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：5’-TGTATGCTGATAATCGACTGC-3’。

本发明提供了一种靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体，包括骨架载体pAAV8和所述的shRNA。

本发明提供了所述的shRNA、所述的重组载体在制备肝损伤的小鼠模型中的应用。

优选的，所述肝损伤包括由肝内内质网应激相关的肝损伤。

优选的，将所述靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体导入小鼠体内。

优选的，所述靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体共导入2次，间隔时间为40～60h。

优选的，所述靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体每次导入的量为(0.5～1.5)×10¹⁰vg/只。

本发明的有益效果：本发明提供的靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA以及重组载体，能够应用于肝损伤模型小鼠的肝内内质网应激相关研究中，从而为临床防治肝脏疾病提供新思路和靶点。

附图说明

图1本发明提供的基因沉默腺相关病毒骨架示意图；

图2为完成基因沉默腺相关病毒质粒构建后，对插入的shRNA序列进行测序比对鉴定结果；

图3为体内Atf6αshRNA预干预小鼠6周，后腹腔注射四氯化碳诱导24h的血清ALT水平变化；

图4为体内Atf6αshRNA预干预小鼠6周，后腹腔注射四氯化碳诱导24h的血清TBil水平变化；

图5为rAAV8-control shRNA和rAAV8-Atf6αshRNA分别转导6周，再给予四氯化碳干预24h后的病理HE染色；其中，左图为control shRNA+四氯化碳，右图为Atf6αshRNA+四氯化碳；

图6为rAAV8-control shRNA和rAAV8-Atf6 shRNA分别转导6周，再给予四氯化碳干预24h后肝组织坏死面积百分比变化；

图7为Atf6 shRNA预干预小鼠6周，随后给予四氯化碳干预24h诱导肝损伤，肝内ATF6α、CHOP、casepase-12和P-MLKL的蛋白水平变化。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA，所述shRNA靶向的核苷酸序列具体如下：5’-GCAGTCGATTATCAGCATACA-3’(SEQ ID No.1)；所述shRNA的核苷酸序列优选具体如下：3’-TGTATGCTGATAATCGACTGC-5’(SEQ ID No.2)。在本发明中，所述shRNA(短发夹RNA)能够特异性靶向编码Atf6α基因中如SEQ ID No.1所示的序列，与相应的mRNA结合，由特异的核酸酶结合并降解mRNA，从而实现编码Atf6α基因的表达敲低。

本发明提供了一种靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体，包括骨架载体pAAV8和所述shRNA。在本发明中，所述骨架载体pAAV8(骨架信息为pAAV-ITR-hU6-Atf6 shRNA(mouse，NM_001081304)-CAG-EGFP-WPRE-SV40_polyA-ITR；所述骨架载体的载体类型为沉默腺相关病毒；所述骨架载体优选的委托北京合生基因科技有限公司合成。在本发明中，所述重组载体命名为rAAV8-Atf6 shRNA。

本发明还提供了所述的shRNA、所述的重组载体在制备肝内内质网应激的小鼠模型中的应用。

在本发明中，优选的将所述靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA或重组载体导入小鼠体内；所述靶向敲减Atf6蛋白的重组载体优选的共导入2次，间隔时间优选为40～60h，更优选为45～55h，最优选为48h。在本发明中，所述靶向敲减Atf6蛋白的重组载体每一次导入的用量优选为(0.5～1.5)×10¹⁰vg/0.1mL/只，更优选为1×10¹⁰vg/0.1mL/只。在本发明中，所述小鼠优选的为km小鼠，规格为20～25g/只。在本发明中，所述导入的方法优选为注射，所述注射优选为尾静脉注射。在本发明中，所述重组载体优选的与生理盐水混合后注射，所述重组载体混合与生理盐水的体积比优选为1：(6～10)，更优选为1:8。

在本发明中，所述靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA或重组载体导入小鼠体内后，能够显著增加四氯化碳诱导24h小鼠体内的血清ALT、TBil水平，能够使肝细胞损伤加重，细胞坏死显著，能够加重小鼠肝内内质网应激。本发明提供的靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA或重组载体为防治肝脏疾病的研究提供了新的思路和靶点，具有重大意义。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.构建重组载体：pAAV-ITR-hU6-Atf6 shRNA(mouse,NM_001081304)-CAG-EGFP-WPRE-SV40_polyA-ITR；委托北京合生基因科技有限公司合成，命名为rAAV8-Atf6 shRNA，质粒结构图谱如图1所示。

2.实验小鼠随机分为4组，每组12只小鼠，并按分组给予对应的干预；

1)Atf6 shRNA组：予rAAV8-Atf6 shRNA预干预+橄榄油；2)Control shRNA组：予rAAV8-control shRNA(control shRNA：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’，SEQ ID No.3)预干预+橄榄油；3)四氯化碳组：予rAAV8-control shRNA预干预+四氯化碳；4)Atf6 shRNA+四氯化碳组：予rAAV8-Atf6 shRNA预干预+四氯化碳。

首先进行的是rAAV8-Atf6 shRNA和rAAV8-control shRNA的转导，具体步骤如下：

通过静脉可视小鼠尾静脉注射固定器固定小鼠，充分固定并暴露尾静脉，选择尾巴的外侧为常规静脉注射部位，应避开腹侧动脉；注射时斜面向上并倾斜45°进针，尽可能由小鼠尾部远端致近端。

75％的酒精消毒尾部静脉注射部位(用热纱布敷局部静脉显露效果更佳)，予尾静脉注射的rAAV8-Atf6 shRNA(1×10¹⁰vg/0.1mL/只，每只小鼠的体重为22～25g)；间隔48h重复一次，共2次；或对照rAAV8-control shRNA(1×10¹⁰vg/0.1mL/只，；间隔48h重复一次，共2次)。

在rAAV8-Atf6 shRNA和rAAV8-control shRNA转导6周后，小鼠四氯化碳组分别予以腹腔注射四氯化碳(1mL/kg)，对照组小鼠分别腹腔注橄榄油(0.05mL/10g)，待橄榄油或四氯化碳干预24h后开始小鼠标本收集。

橄榄油或四氯化碳干预24h后，摘取眼球留血送生化检测，每只实验小鼠取血1～1.5mL，采用速率法测定血清ALT水平(图3)，采用重氮试剂法测定血清TBil水平(图4)；图3为BALB/c小鼠经橄榄油或四氯化碳干预24h后，采用速率法测定血清ALT水平结果；与CCl₄组小鼠相比，ATF6αshRNA+CCl₄组小鼠血清ALT水平显著升高(P<0.001)；BALB/c小鼠经橄榄油或四氯化碳干预24h后，采用重氮试剂法测定血清TBil水平，与CCl₄组小鼠相比，ATF6αshRNA+CCl₄组小鼠血清TBil水平较对照组明显升高(P<0.001)。

3.断颈处死小鼠，充分暴露、解剖，取肝脏组织0.5cm×0.5cm做病理切片HE染色。借助CaseViewer2.2软件打开后可以1～400倍任意倍数放大后进行观察。选取切片的目的区域进行100倍成像，成像时让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致，进行坏死面积测量，结果如图5、6所示；BALB/c小鼠经橄榄油或四氯化碳干预24h后，肝脏组织做病理切片HE染色。与CCl₄组小鼠相比，ATF6αshRNA+CCl₄组肝细胞坏死亦显著增加(P<0.001)。

4.在小鼠肝右叶取出肝组织50mg放入5mL加有50μL PMSF液的免疫沉淀测定裂解缓冲液(成分：Tri-HCL，NACL，NP-40，SDS)中进行匀浆，接着用细胞超声破碎仪在4℃下进一步破碎组织至澄清。然后在4℃，12000rpm的条件下离心破碎组织5min，取上清液加入1/5体积的上样缓冲液(5×)(组成：SDS，DTT，溴酚蓝，缓冲盐溶液等，北京索莱宝科技有限公司，货号：P1040)充分混合，在100℃的沸水中煮10min，待其冷却后放入-20℃冰箱备用。通过免疫印迹法(western blot，WB)检测小鼠肝脏ATF6α、P-MLK、CHOP、casepase-12的表达，如图7所示，BALB/c小鼠经橄榄油或四氯化碳干预24h后，通过免疫印迹法(westernblot，WB)检测小鼠肝脏ATF6α、Caspase-12、CHOP、p-MLKL的蛋白水平。与CCl₄组小鼠相比，ATF6αshRNA+CCl₄组显著减少Atf6α蛋白水平，而肝内Caspase-12、CHOP、p-MLKL蛋白水平却显著增加(P<0.001)。

由以上实施例可知，本发明提供的靶向敲减小鼠肝脏Atf6的shRNA、重组载体及其在肝损伤的小鼠模型研究中的应用，通过将靶向敲减Atf6蛋白的shRNA导入小鼠体内，实现编码Atf6蛋白的基因表达量的敲减显著降低ATF6α表达，并加重肝损伤、肝细胞坏死和内质网应激，说明Atf6α在内质网应激及细胞坏死途径中有保护作用，从而为治疗临床肝脏疾病提供潜在靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 遵义医科大学附属医院

<120> 一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA、重组载体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcagtcgatt atcagcatac a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgtatgctga taatcgactg c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttctccgaac gtgtcacgtt t 21

Claims (8)

1.一种靶向敲减Atf6α基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下5’-GCAGTCGATTATCAGCATACA-3’。

2.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：5’-TGTATGCTGATAATCGACTGC-3’。

3.一种靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体，其特征在于，包括骨架载体pAAV8和权利要求1或2所述的shRNA。

4.权利要求1或2所述的shRNA、权利要求3所述的重组载体在制备肝损伤的小鼠模型中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝损伤包括由肝内内质网应激相关的肝损伤。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体导入小鼠体内。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体共导入2次，间隔时间为40～60h。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向敲减Atf6α基因表达的重组载体每次导入的量为(0.5～1.5)×10¹⁰vg/只。

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