CN115518160B - Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用 - Google Patents

Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用，属于生物医学技术领域，本发明通过建立高脂膳食诱发小鼠肥胖，使用基因敲除及基因治疗技术，以Tks4为靶点，在全身及局部脂肪组织中敲减Tks4的表达，以探究Tks4作为基因治疗的靶点治疗肥胖的可能性。结果表明，以Tks4作为基因治疗的靶点，降低Tks4的表达能够显著抑制体重的增长，抑制白色脂肪细胞中的脂滴积累，降低脂肪体积，从而达到高效防治肥胖症的目的。因此本发明首次提出将Tks4用于制备治疗肥胖症药物的新靶点，对于筛选新药具有重要意义，也为肥胖症的治疗提供了一种新思路。

Description

Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用。
背景技术
随着生活水平的提高和生活方式的变化，肥胖日益成为人类健康的巨大威胁。肥胖症的主要病理表现为机体脂肪在体重中所占百分比过高，还可能存在脂肪细胞增大等情况，且通常伴有高血糖、高血脂等糖脂代谢失衡症状。目前对肥胖的治疗方法主要有药物治疗、外科手术和生活干预，但这三种方法目前均存在一定的缺点，如生活干预主要通过节制饮食和加强锻炼来使得机体能量支出大于输入，然而长期规律生活要依靠患者本人的意志力，对许多意志力薄弱的人疗效不稳定且易反弹。外科手术治疗则主要通过缩小胃的体积或在胃中填充气囊等方式增强饱腹感，从而使能量摄入减少，达到治疗的效果，但存在术后风险大、可能出现营养不良等问题，且能接受治疗的人群少。而药物治疗目前主要有奥利司他、氯卡塞林等药物，疗效较稳定，但由于没有良好的靶点导致其副作用较大，如奥利司他可能导致失禁。随着基因治疗技术的发展及对糖脂代谢相关基因的了解深入，在基因层面寻找全新的靶点对肥胖症进行治疗逐渐可行。
Tyrosine kinase substrate with four SH3 domains(Tks4)是Tks4所编码的蛋白产物，由1个PX域和4个SH3结构域以及多个富含脯氨酸的序列组成，共含908个氨基酸，是酪氨酸激酶底物。Tks4是在对弗兰克·特·哈尔综合症(Frank-Ter Haar syndrome，FTHS)的研究中发现的，其位于人11号染色体上，突变则导致FTHS，其主要临床特征有巨大角膜、心脏异常、骨骼与关节畸形、生长发育迟缓等。但是在成熟脂肪细胞内敲减Tks4表达是否能够有效抑制脂肪堆积尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用。
优选的，所述Tks4抑制剂抑制脂肪合成与积累。
优选的，所述脂肪为成熟脂肪。
优选的，所述Tks4抑制剂抑制白色脂肪细胞中的脂滴积累，降低脂肪体积。
优选的，所述Tks4抑制剂包括降低Tks4表达的调节剂。
优选的，所述降低Tks4表达的调节剂包括敲除或沉默Tks4的试剂。
优选的，所述敲除或沉默Tks4的试剂包括siRNA、shRNA或miRNA。
优选的，所述药物包括活性成分Tks4抑制剂及药学上可接受的辅料。
优选的，所述Tks4抑制剂在药物中的含量为1～99％。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用。本发明通过建立高脂膳食诱发小鼠肥胖，使用基因敲除及基因治疗技术，以Tks4为靶点，在全身及局部脂肪组织中敲减Tks4的表达，以探究Tks4作为基因治疗的靶点治疗肥胖的可能性。结果表明，Tks4-/-小鼠在高脂饮食刺激的条件下，极大限度的降低Tks4的表达能够显著抑制体重的增长，显著抑制白色脂肪细胞中的脂滴积累，降低脂肪体积。通过构建包含Tks4-shRNA的AAV9病毒，以Tks4作为基因治疗的靶点，进一步证实在成熟脂肪中敲除Tks4可以有效限制脂滴的积累，因此，Tks4抑制剂达到高效治疗肥胖症的目的。因此本发明首次提出将Tks4用于制备治疗肥胖症药物的新靶点，对于筛选新药具有重要意义，也为肥胖症的治疗提供了一种新思路。
附图说明
图1为Tks4-/-小鼠体重变化、体型及摄食量分析，A：高脂喂养条件下各基因型小鼠的饲料消耗情况，小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)，Student-t test分析，p＝0.3567，本图表中数据展示为Mean±SEM，统计分析结果展示为n.s.：p>0.05；B：高脂喂养期间，各基因型小鼠体重变化曲线，小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)；C：高脂喂养结束后各基因型小鼠的体型对比；
图2为Tks4-/-小鼠各部分脂肪重量变化分析，A：高脂喂养后小鼠的EpiWAT解剖图对比，Tks4+/+小鼠(左侧)的EpiWAT体积显著高于Tks4-/-小鼠(右侧)；B：高脂喂养后小鼠的IngWAT解剖图对比；C：高脂喂养后两种小鼠的EpiWAT重量的统计分析，小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)；Student-ttest分析，本图表中数据展示为Mean±SEM，统计分析结果展示为****：p<0.0001；D：高脂喂养后两种小鼠的IngWAT重量的统计分析，小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)，Student-ttest分析，本图表中数据展示为Mean±SEM，统计分析结果展示为****：p<0.0001；E：高脂喂养后小鼠的EpiWAT重量占体重百分比的统计分析，小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)，Student-ttest分析，本图表中数据展示为Mean±SEM，统计分析结果展示为****：p<0.0001；F：高脂喂养后小鼠的IngWAT重量占体重百分比的统计分析，小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)，Student-ttest分析，本图表中数据展示为Mean±SEM，统计分析结果展示为***：p<0.001；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001，“****”表示p＜0.0001；
图3为高脂喂养前后各基因型小鼠白色脂肪细胞的对比，A：高脂喂养前后小鼠白色脂肪组织石蜡切片的H&E染色；B：高脂喂养前后小鼠白色脂肪细胞面积的统计分析。小鼠数目n＝8(Tks4+/+)、n＝7(Tks4-/-)，Student-t test分析，本图表中数据展示为Mean±SEM，统计分析结果展示为****：p<0.0001；C：高脂喂养前后小鼠白色脂肪细胞面积大小的分布情况；
图4为Western-Blot检测pSuper-Tks4-shRNA质粒沉默效率；
图5为注射病毒小鼠腿部脂肪重量及脂肪细胞面积大小变化，A：小鼠腿部脂肪组织重量变化(小鼠数目：n＝5(control)、n＝7(shRNA)；B：脂肪组织石蜡切片H&E染色(小鼠数目：n＝5(control)、n＝7(shRNA)；C：脂肪细胞面积大小统计及分布图(小鼠数目：n＝5(control)、n＝7(shRNA)；
图6为注射病毒小鼠腹部脂肪重量及脂肪细胞面积大小变化，A：小鼠腹部脂肪组织重量变化(小鼠数目：n＝5(control)、n＝7(shRNA)；B：脂肪组织石蜡切片H&E染色(小鼠数目：n＝5(control)、n＝7(shRNA)；C：脂肪细胞面积大小统计及分布图(小鼠数目：n＝5(control)、n＝7(shRNA)；
图7为Western-Blot检测Tks4在腿部脂肪组织中的表达情况。
具体实施方式
本发明对肥胖症和脂肪含量变化进行研究，发现了一种治疗肥胖症的新靶点Tks4，因此，提供了一种Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用。
在本发明中，Tks4的核苷酸序列可以为或包括NCBI参考序列：Gene ID26839的序列。
在本发明中，所述Tks4抑制剂优选的包括降低Tks4表达的调节剂。进一步优选的，所述降低Tks4表达的调节剂包括敲除或沉默Tks4的试剂。更进一步优选的，所述敲除或沉默Tks4的试剂包括siRNA、shRNA或miRNA。在本发明中，所述siRNA是指短双链RNA，其能够通过切割某些mRNA来诱导RNA干扰，siRNA包括具有与靶基因的mRNA同源的序列的正义RNA链和具有与其互补的序列的反义RNA链，siRNA可以抑制靶基因的表达，可用于基因敲减、基因治疗。在本发明中，所述shRNA(短发夹RNA)是单链RNA，其包括通过氢键形成双链部分的茎部分和环部分，它被诸如Dicer的蛋白加工转化成siRNA，并执行与siRNA相同的功能。在本发明中，miRNA是指21至23个非编码RNA，其在转录后通过促进靶RNA的降解或通过抑制其翻译来调节基因表达。本发明中，与未用Tks4抑制剂处理的脂肪组织相比，Tks4抑制剂是降低脂肪组织中Tks4表达的抑制剂。
在本发明中，所述Tks4抑制剂抑制脂肪合成与积累，抑制白色脂肪细胞中的脂滴积累，降低脂肪体积，从而有效治疗肥胖症。
在本发明中，所述的脂肪为成熟脂肪。
在本发明中，所述药物优选的包括活性成分Tks4抑制剂，如shRNA。所述Tks4抑制剂在药物中的含量优选为1～99％。所述药物还优选的包括药学上可接受的辅料。所述辅料包括赋形剂、稳定剂或防腐剂，例如淀粉、乳糖、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、微粉硅胶、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、亚硫酸钠、抗坏血酸、滑石粉、二氧化硅等。本发明中，所述药物剂型优选的包括片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或胶囊剂。本发明的药物给药途径包括口服、静脉内、胃肠外、肌内、皮下、腹腔内、鼻内、直肠给药或局部给药。在本发明中，本发明的药物剂量可通过治疗疾病的类型、疾病的严重性、给药途径、患者年龄、性别、健康状况等因素确定，例如，本发明药物的剂量可以为每位患者0.01μg～1000mg/天。
在本发明中，没有特殊说明，所述的试剂、材料等均是本领域公知的产品，通过购买或者常规制备即可得到。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下的实施例中，C57BL6小鼠(4周龄)购自亿思实验动物公司。高脂饲料购自ReseachDiet公司，编号为D12492。
本发明对Tks4-/-小鼠或Tks4+/+小鼠的来源没有特殊限定，通过购买或根据常规方法即可制备得到。
本发明涉及的腺相关病毒表达体系是委托大连吉凯基因有限公司构建的。
实施例1
高脂饲喂：将含有60％Kcal脂肪的高脂饲料分别喂养二个月龄的Tks4-/-小鼠或Tks4+/+小鼠，每隔三天添加高脂饲料及更换小鼠饮用水，连续喂养八周，每周换笼一次。
(1)高脂饲养对Tks4-/-小鼠体重及脂肪的影响
遗传和环境因素在肥胖的发生中起重要作用，而饮食是诱导肥胖及相关代谢疾病的主要环境因素之一，因此探究了高脂饲养对Tks4-/-小鼠体重及脂肪的影响。
体重测定：每周称量一次小鼠体重，并记录体重变化情况。
饲料消耗量测定：每天将每笼小鼠剩余高脂饲料取出称重并记录，相减可得小鼠饲料消耗量，记录饲料消耗情况。
由图1结果表明，Tks4+/+和Tks4-/-小鼠对于饲料的消耗量相似(见图1中的A)，但是与Tks4+/+小鼠的体重增长及体型增胖相比，Tks4+/+小鼠(左侧)体型增加明显，但是Tks4-/-小鼠(右侧)体型无明显变化，故高脂喂养不能明显增加Tks4-/-小鼠体重和体型(见图1中的B～C)。因此，在高脂喂养的条件下Tks4的缺失依旧能够显著的抑制小鼠体重的增长，表明Tks4在小鼠体内调节脂肪合成及积累过程中发挥决定性作用。
(2)高脂饲养条件下Tks4-/-小鼠脂肪重量及脂肪细胞面积变化
脂肪组织中的白色脂肪能够将生物体内多余的能量以脂肪的形式储存起来，并且广泛地分布在皮下和内脏组织的周围。当白色脂肪组织在体内积累过多时，就会导致肥胖。在高脂饲料喂养小鼠八周后，剥离每只小鼠的内脏附睾部位(epididymal WAT，EpiWAT)及腹股沟部位(inguinal WAT，IngWAT)的白色脂肪组织并称重。
腹股沟及腹腔白色脂肪的剥取与称重：小鼠处死后，将其腹部朝上置于泡沫板上，展开四肢使其暴露腹部，必要的话可以将四肢钉在泡沫板上。用镊子提起小鼠皮肤，剪开一个小口，用镊子穿入小口撕开皮肤，注意不要弄破腹腔。将皮肤撕开至可以完整的看见长条状的腹股沟脂肪。从后腿根部用镊子和剪刀开始剥离脂肪，一直向上剥离到小鼠身体中部脂肪自然分离为止。将合适大小的离心管置于天平上去皮，然后将剥离出的脂肪塞入离心管中称重，读数稳定后记录。同样的操作剥离称重另一侧腹股沟脂肪。随后从小鼠中间剪开腹腔，可以明显看到一左一右两块白色的腹腔脂肪，用镊子提起一块将其与腹腔内其他脏器之间的系膜剪断即可，同样的操作进行称重。
由图2可以看出，Tks4+/+小鼠(左侧)的EpiWAT体积显著高于Tks4-/-小鼠(右侧)，即高脂饲养后Tks4-/-小鼠的内脏脂肪含量依旧极少，而Tks4+/+小鼠则在腹腔中形成并堆积了大量的EpiWAT(见图2中的A)。同时Tks4-/-小鼠的IngWAT重量也明显小于对照组小鼠(见图2中的B)。相应的脂肪重量的统计数据显示Tks4-/-小鼠的IngWAT和EpiWAT脂肪重量小于对照组小鼠脂肪重量的10％(见图2中的C～D)。并且在Tks4-/-小鼠中，IngWAT和EpiWAT所占体重的相对比值也明显低于对照组小鼠(见图2中的E～F)。
接下来进一步对小鼠的IngWAT脂肪组织进行石蜡切片及H&E染色(见图3中的A)，并利用Image J软件测量脂肪细胞面积的大小。
脂肪的石蜡切片：
1)固定：用PBS灌洗后用PFA固定。
2)脱水：首先是70％乙醇4℃浸泡过夜，然后95％乙醇浸泡2h，转入另一95％乙醇浸泡2h，再转入100％乙醇浸泡4h，最后转入另一100％乙醇浸泡过夜。
3)包埋：将组织浸泡与常温二甲苯代替物中2h。包埋机打开后让组织在62℃水浴中浸蜡2.5h，包埋前30min打开冷台，切片后进行小冷。55℃水浴锅中放入盛水的大烧杯，切片浸泡在水中保温。
4)脱蜡：将切片浸泡在二甲苯中进行脱蜡15min，重复此步骤一次。
5)复水：分别用100％、95％、70％乙醇洗3min。
6)染色：按照Solarbio公司HE染色试剂盒说明书操作进行染色。
7)脱水：将染色后的脂肪组织蜡片分别置于70％乙醇中浸泡1min，95％乙醇中浸泡1min，最后在100％乙醇中浸泡2min。
8)封片：用二甲苯替代物浸泡切片2次，每次5min，之后用中性树脂封片，得到脂肪石蜡切片。
9)观察：将切片置于光学显微镜下观察细胞形态并拍照。
结果表明，在高脂喂养条件下Tks4+/+小鼠的IngWAT脂肪细胞面积平均值为2938.1μm2，而Tks4-/-小鼠的IngWAT平均脂肪细胞面积仅有372.2μm2，显著低于对照组。对比在正常喂养(Regular diet，RD)条件下，Tks4+/+小鼠的IngWAT脂肪细胞面积平均值为231.9μm2，而Tks4-/-小鼠的IngWAT平均脂肪细胞面积仅有142.3μm2(图3中的B)。通过面积分布图进一步分析表明，Tks4+/+小鼠的脂肪细胞面积在高脂喂养前集中在50～500μm2范围，而高脂喂养后则增加到了1000～4000μm2这一范围，有明显的脂滴积累现象。而Tks4-/-小鼠的脂肪细胞面积在高脂喂养前后均分布在50～500μm2以内(图3中的C)。因此，在高脂诱导的条件下，Tks4-/-小鼠的脂肪细胞不能有效积累脂滴增加脂肪细胞面积，这应该是脂肪体积不能增加的根本原因。
(3)高脂饲养条件下注射病毒小鼠脂肪重量及脂肪细胞面积变化
为进一步研究Tks4在哺乳动物生命活动中的功能，首先构建以pSuper为骨架的沉默载体pSuper-Tks4-shRNA，针对Tks4基因(Gene ID 268396)的1202、1357和1574号位点共构建三个沉默载体pSuper-Tks4-shRNA，即pSuper-Tks4-shRNA 1202、pSuper-Tks4-shRNA1357、pSuper-Tks4-shRNA 1574，根据目的基因及载体pSuper设计引物，与酶切后pSuper载体连接转化，而后少量提取质粒测序验证，获得测序结果正确的pSuper-Tks4-shRNA质粒后，在细胞水平进行沉默效率验证，培养表达Tks4的NLT细胞，使用电穿孔转染方法分别将pSuper、pSuper-Tks4-shRNA 1202、1357和1574质粒转入细胞中，48h后分别提取细胞总蛋白，进行Western-Blot检测，结果见图4。
Western-Blot检测方法：
1)选择与上样量相匹配的，合适大小的胶板。将胶板清洗后进行吹干，待完全干燥后将其固定在夹子上。
2)配置合适浓度的浓缩胶和分离胶，每个泳道加入约20μg蛋白质样品。
3)将电压调至80V，待marker完全分开后提高至120V。
4)待电泳完成后，使用220mA恒定电流将目的蛋白转移至PVDF膜上。
5)将膜完全浸入TBST配置的5％BSA溶液，摇床常温封闭1h。
6)配置抗体稀释液，稀释一抗制作抗体反应袋。
7)将膜置于抗体反应袋中4℃孵育过夜。
8)室温下用TBST洗膜，每次5min，洗6次，其间一直置于脱色摇床上。
9)将辣根过氧化物酶标记的二抗用TBST稀释至所需浓度，将膜和二抗同时放入抗体反应袋中，置于水平摇床上室温反应1h。
10)室温下用TBST洗膜，每次5min，洗6次。其间一直置于脱色摇床上。
11)使用ECLWestern Blot试剂盒配置化学发光底物，利用曝光仪曝光。
12)观察并保存图像，分析相应分子量处的目的蛋白的变化情况。
图4结果表明，与对照组相比，三种pSuper-Tks4-shRNA均可沉默细胞中的Tks4，其中pSuper-Tks4-shRNA 1357和pSuper-Tks4-shRNA 1574的沉默效果较好，后续选用Tks4-sh1574(以下称之为shRNA)用于基因治疗。
配置病毒溶液：将包装好的病毒粉末，按照公司说明加入适量蒸馏水配置成1×1012v.g./mL滴度的病毒溶液。
向5周龄的C57BL6小鼠分别注射control virus和shRNAvirus，注射部位为两侧腹股沟的皮下脂肪，在注射病毒之后进行3周的常规喂养，在小鼠8周龄时利用高脂饲料对小鼠进行为期八周的饲养。
小鼠腹股沟皮下注射：
1)抓取小鼠：右手提鼠尾向后轻拉，左手拇指和食指抓取小鼠背部靠耳后皮毛，抓住后将鼠尾夹在左手小拇指和无名指之间，将小鼠整个躯干固定，抓稳后使小鼠腹部朝上，头朝下。
2)注射：用酒精棉球轻轻擦拭小鼠腹股沟部位皮肤，提起注射部位皮肤使皮下产生空隙，将注射器推进空隙，缓慢打入病毒溶液，随后轻轻抽出注射器，每只小鼠每个股骨沟部位分别注射control virus和shRNAvirus病毒溶液50μL，每只小鼠共注射100μL体积的病毒每只小鼠注射的病毒总量为1×1011v.g.。
高脂饲喂：将含有60％Kcal脂肪的高脂饲料分别喂养注射control virus或shRNAvirus的C57BL6小鼠，每隔三天添加高脂饲料及更换小鼠饮用水，连续喂养八周，每周换笼一次。
在用高脂饲料喂养八周后处死小鼠，解剖取得腿部及腹部的脂肪组织，称量重量。此外，分别对腿部及腹部的脂肪组织进行石蜡切片和H&E染色，并用Image J软件统计脂肪细胞面积的大小。
图5和图6结果表明，与注射control virus的小鼠相比，注射shRNAvirus的小鼠腿部脂肪组织的重量以及脂肪细胞面积明显减小，这与注射病毒的部位是腿部相符合。但是二者的腹部脂肪组织重量没有明显差别，甚至注射shRNAvirus的小鼠的腹部脂肪细胞面积高于对照组。
(4)注射病毒小鼠中Tks4的敲减效率的检测
为了确定在小鼠的腿部脂肪组织中注射shRNA病毒是否降低了Tks4的表达，提取腿部脂肪组织蛋白，进行Western-Blot检测。
图7的结果表明，与注射control virus的小鼠相比，注射shRNA virus的小鼠腿部脂肪组织中Tks4的表达明显降低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Tks4抑制剂抑制脂肪合成与积累。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脂肪为成熟脂肪。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述Tks4抑制剂抑制白色脂肪细胞中的脂滴积累，降低脂肪体积。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Tks4抑制剂包括降低Tks4表达的调节剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述降低Tks4表达的调节剂包括敲除或沉默Tks4的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述敲除或沉默Tks4的试剂包括siRNA、shRNA或miRNA。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括活性成分Tks4抑制剂及药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Tks4抑制剂在药物中的含量为1～99％。
CN202211286133.0A 2022-10-20 2022-10-20 Tks4抑制剂在制备治疗肥胖症药物中的应用 Active CN115518160B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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人肝细胞肝癌中TKs4的表达及影响增殖、凋亡及迁移的体外实验研究;李青峰;中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第1期);E072-1339 *

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