CN112680374A - 高持久性的驱蚊生物制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物灭蚊农药技术领域，特别涉及高持久性的驱蚊生物制剂及制备方法；苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.5～1：1～2：0.5～1：0.5～1：3～4：400～500，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2～2.5％、蛋白胨0.2～0.4％、酵母粉0.1～0.2％、豆粕粉2.2～3.0％、玉米浆1.0～1.5％、磷酸二氢钾0.05～0.1％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.1～0.2％、硫酸锰0.003～0.005％和去离子水92.065～94.337％。本发明的驱蚊生物制剂的持续时间长，产品稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物灭蚊农药技术领域，特别涉及高持久性的驱蚊生物制剂及制备方法。
背景技术
蚊子是传播人类疾病的重要媒介昆虫之一。灭蚊剂的发展经历了矿物油、植物粉和化学杀虫剂到微生物灭蚊剂等阶段。幼虫时期是防治蚊虫的关键时期。苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuring iensis subsp.israelensis，简称Bti)以其对蚊科幼虫高毒，且高效安全、易于分解、低残留、与环境相容的特性，成为被广泛关注的新的灭蚊剂的代表。Bti是Goldberg和Margalit于1977年发现的一种对蚊科幼龄害虫具有高度毒力的病原细菌。自发现以来，人们利用Bti制剂为控制蚊媒病的传播做出了大量工作。然而，现有剂型持效期短，限制了Bti的更大规模的应用，通过改进制剂的持效性可以减少使用次数和防治成本，因此，研究开发有缓释作用持效期长的Bti剂型具有重要意义。
为此，提出高持久性的驱蚊生物制剂及制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供高持久性的驱蚊生物制剂及制备方法，该驱蚊生物制剂的持续时间长，产品稳定性高。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.5～1：1～2：0.5～1：0.5～1：3～4：400～500，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2～2.5％、蛋白胨0.2～0.4％、酵母粉0.1～0.2％、豆粕粉2.2～3.0％、玉米浆1.0～1.5％、磷酸二氢钾0.05～0.1％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.1～0.2％、硫酸锰0.003～0.005％和去离子水92.065～94.337％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为1-2支斜面种子/T，所述发酵种子的添加量为1kg/T。
具体的，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为1：2：1：1：4：500。
具体的，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2.5％、蛋白胨0.4％、酵母粉0.2％、豆粕粉3.0％、玉米浆1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.03％、氯化钙0.2％、硫酸锰0.005％和去离子水92.065％。
高持久性的驱蚊生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)发酵种子的斜面种子培养基制备，按配比称取相应的原料组分，将牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水分别置于种子罐中，添加苏云金杆菌以色列亚种原菌，在PH7.0～7.2以及培养温度为32℃的条件下培养4～5d，得到种子A；
(2)发酵培养基的制备，按配比称取相应的原料组分，将玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、豆粕粉、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰和去离子水分别置于种子罐中，在PH 7.5～7.8以及121℃的条件下灭菌30min，备用，得到发酵培养基B；
(3)将种子A接入种子罐的发酵培养基B中进行种子培养，培养温度为32℃，控制通风比为1：1.1，培养时间为28～36h，当菌体中芽孢及晶体含量和芽孢总量大于90％，得到的含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液C，进行(4)步骤；
(4)发酵液的预处理，将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液C用盐酸调节PH至4.1～4.2，并用100目筛网过滤，取滤液且加入去离子水稀释，随后加入0.318％的硫酸锌，搅拌3min，再加入0.227％的黄血盐，搅拌1min，随后静置15min，离心去上清液，得到含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液D；
(5)发酵液的离心浓缩，用碟片式离心机将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液D浓缩3～4倍，弃去上清液，并控制芽孢晶体损失率小于1％，得到含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵浓缩液E；
(6)喷雾造粒，先将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵浓缩液E进行喷雾干燥得到含有苏云金杆菌以色列亚种的菌粉，随后进行制粒，得到驱蚊生物制剂。
具体的，所述(4)步骤中的滤液与去离子水的质量比为7：4。
本发明的有益效果为：
(1)本发明的驱蚊生物制剂使用方便，原料来源广泛，制剂成本低，无化学污染，对环境无危害，具有广阔的应用前景；
(2)本发明的驱蚊生物制剂持续时间长，产品稳定性高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为1：2：1：1：4：500，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2.5％、蛋白胨0.4％、酵母粉0.2％、豆粕粉3.0％、玉米浆1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.03％、氯化钙0.2％、硫酸锰0.005％和去离子水92.065％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T。
高持久性的驱蚊生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(7)发酵种子的斜面种子培养基制备，按配比称取相应的原料组分，将牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水分别置于种子罐中，添加苏云金杆菌以色列亚种原菌，在PH7.0～7.2以及培养温度为32℃的条件下培养4～5d，得到种子A；
(8)发酵培养基的制备，按配比称取相应的原料组分，将玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、豆粕粉、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰和去离子水分别置于种子罐中，在PH 7.5～7.8以及121℃的条件下灭菌30min，备用，得到发酵培养基B；
(9)将种子A接入种子罐的发酵培养基B中进行种子培养，培养温度为32℃，控制通风比为1：1.1，培养时间为28～36h，当菌体中芽孢及晶体含量和芽孢总量大于90％，得到的含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液C，进行(4)步骤；
(10)发酵液的预处理，将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液C用盐酸调节PH至4.1～4.2，并用100目筛网过滤，取滤液且加入去离子水稀释，随后加入0.318％的硫酸锌，搅拌3min，再加入0.227％的黄血盐，搅拌1min，随后静置15min，离心去上清液，得到含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液D；
(11)发酵液的离心浓缩，用碟片式离心机将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液D浓缩3～4倍，弃去上清液，并控制芽孢晶体损失率小于1％，得到含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵浓缩液E；
(12)喷雾造粒，先将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵浓缩液E进行喷雾干燥得到含有苏云金杆菌以色列亚种的菌粉，随后进行制粒，得到驱蚊生物制剂。
具体的，所述(4)步骤中的滤液与去离子水的质量比为7：4。
实施例2
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.5：1：0.5：0.5：3：400，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2％、蛋白胨0.2％、酵母粉0.1％、豆粕粉2.2％、玉米浆1.0％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.01％、氯化钙0.1％、硫酸锰0.003％和去离子水94.337％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T；制备过程同实施例1。
实施例3
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.8：1.2：0.7：0.7：3.4：430，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2.1％、蛋白胨0.3％、酵母粉0.15％、豆粕粉2.5％、玉米浆1.2％、磷酸二氢钾0.06％、硫酸镁0.02％、氯化钙0.13％、硫酸锰0.004％和去离子水93.536％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T；制备过程同实施例1。
实施例4
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.9：1.8：0.9：0.8：3.7：485，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2.4％、蛋白胨0.35％、酵母粉0.18％、豆粕粉2.7％、玉米浆1.4％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.025％、氯化钙0.18％、硫酸锰0.0045％和去离子水92.6805％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T；制备过程同实施例1。
对比例1
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.4：0.8：0.4：0.4：2.7：385，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉1.4％、蛋白胨0.18％、酵母粉0.08％、豆粕粉2.1％、玉米浆0.4％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸镁0.005％、氯化钙0.08％、硫酸锰0.002％和去离子水95.723％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T；制备过程同实施例1。
对比例2
高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为1.2：2.2：1.2：1.2：4.3：550，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2.8％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.3％、豆粕粉3.1％、玉米浆1.7％、磷酸二氢钾0.13％、硫酸镁0.04％、氯化钙0.3％、硫酸锰0.006％和去离子水91.124％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T；制备过程同实施例1。
对比例3
本对比例中采用Bti标准品(苏云金杆菌以色列亚种原菌)进行对照实验，Bti标准品为RB80，其毒力效价为3500ITU/mg，法国巴斯德研究所提供。
毒力试验
对上述实施例1～4和对比例1～2的毒力进行测定，其中，每组(处理)生物对象为50只埃及伊蚊3龄幼虫和50只库蚊4龄幼虫。
表1各组对埃及伊蚊和库蚊幼虫的毒力测定结果
由表1可以看出，实施例1的样品对两种蚊幼虫毒力效果均较好，其中，实施例1中对埃及伊蚊幼虫LC50可达0.27μl/L，实施例3中对库蚊幼虫LC50为0.55μl/L。
持效性试验
对上述实施例1～4和对比例1～3的持效性进行测定，其中，每组(处理)生物对象为50只埃及伊蚊3龄幼虫，隔天检查幼虫死亡率后清除死、活虫，再接入50只埃及伊蚊3龄幼虫，隔天检查并重新接虫，直至30d。
表2埃及伊蚊的死亡率
由表2可以看出，实施例1的样品对埃及伊蚊的防治效果最好，且30d的防治效果仍然维持在65.3～68.8，延长了持效期。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.高持久性的驱蚊生物制剂，苏云金杆菌以色列亚种原菌在斜面种子培养基中进行种子培养，随后将种子接入种子罐的发酵培养基中进行种子培养，其特征在于，所述斜面种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为0.5～1：1～2：0.5～1：0.5～1：3～4：400～500，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2～2.5％、蛋白胨0.2～0.4％、酵母粉0.1～0.2％、豆粕粉2.2～3.0％、玉米浆1.0～1.5％、磷酸二氢钾0.05～0.1％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.1～0.2％、硫酸锰0.003～0.005％和去离子水92.065～94.337％，其中，所述苏云金杆菌以色列亚种原菌的添加量为35g/L，所述种子的添加量为1kg/T。
2.根据权利要求1所述的高持久性的驱蚊生物制剂，其特征在于，所述牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水的质量比为1：2：1：1：4：500。
3.根据权利要求1所述的高持久性的驱蚊生物制剂，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量百分比的各原料制得：玉米淀粉2.5％、蛋白胨0.4％、酵母粉0.2％、豆粕粉3.0％、玉米浆1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.03％、氯化钙0.2％、硫酸锰0.005％和去离子水92.065％。
4.根据权利要求1-3任一所述的高持久性的驱蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵种子的斜面种子培养基制备，按配比称取相应的原料组分，将牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂和去离子水分别置于种子罐中，添加苏云金杆菌以色列亚种原菌，在PH 7.0～7.2以及培养温度为32℃的条件下培养4～5d，得到种子A；
(2)发酵培养基的制备，按配比称取相应的原料组分，将玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、豆粕粉、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰和去离子水分别置于种子罐中，在PH7.5～7.8以及121℃的条件下灭菌30min，备用，得到发酵培养基B；
(3)将种子A接入种子罐的发酵培养基B中进行种子培养，培养温度为32℃，控制通风比为1：1.1，培养时间为28～36h，当菌体中芽孢及晶体含量和芽孢总量大于90％，得到的含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液C，进行(4)步骤；
(4)发酵液的预处理，将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液C用盐酸调节PH至4.1～4.2，并用100目筛网过滤，取滤液且加入去离子水稀释，随后加入0.318％的硫酸锌，搅拌3min，再加入0.227％的黄血盐，搅拌1min，随后静置15min，离心去上清液，得到含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液D；
(5)发酵液的离心浓缩，用碟片式离心机将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵液D浓缩3～4倍，弃去上清液，并控制芽孢晶体损失率小于1％，得到含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵浓缩液E；
(6)喷雾造粒，先将含有苏云金杆菌以色列亚种的发酵浓缩液E进行喷雾干燥得到含有苏云金杆菌以色列亚种的菌粉，随后进行制粒，得到驱蚊生物制剂。
5.根据权利要求4所述的高持久性的驱蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，所述(4)步骤的发酵液的预处理中滤液与去离子水的质量比为7：4。
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