CN112675313A - 连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，该纳米制剂含有美登素、甲氧基封端的丙交酯‑乙交酯共聚物及马来酰亚胺基封端的丙交酯‑乙交酯共聚物的共混物，其中第一种甲氧基封端的丙交酯‑乙交酯的共聚物具有高特性黏度，第二种马来酰亚胺基封端的丙交酯‑乙交酯的共聚物具有低特性黏度。并且，该美登素纳米粒与曲妥珠单抗scFv靶向配体相连接。根据本发明实施方式制备的纳米粒外观圆整、光滑，具有缓释作用，并且比未连接靶向配体的纳米粒相比，连接scFv片段的纳米粒可以更多的进入到肿瘤细胞内。

Description

连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害女性的身心健康和生命。它的发病与遗传相关，发病率占全部恶性肿瘤的7％～10％，并且呈逐年上升趋势，成为女性罹患肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤，是继肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结直肠癌之后，第六大女性癌症死亡原因。

近年来，随着分子生物学研究的深入和发展，将肿瘤发生机制引入到分子领域，多种肿瘤分子标志物的发现为乳腺癌的鉴别诊断治疗等提供了重要的价值。研究发现，HER2基因在许多人类肿瘤中均有扩增或过表达，并与肿瘤治疗的抵抗性和预后密切相关。免疫组化检测HER2在乳腺癌中阳性率25％～30％。

随着对肿瘤的发生机制和生物特性的深入了解，针对于肿瘤进展的特异性生物途径的新型药物及其应用也得到了发展，该治疗方式成为靶向治疗。单克隆抗体可以识别细胞抗原、提高肿瘤杀伤率、减少全身性副作用，成为目前分子靶向药物市场发展趋势。曲妥珠单抗，商品名赫赛汀，1998年在FDA获准上市，适用于转移迅速而难以根治的HER2阳性转移性乳腺癌患者，疗效良好。

ScFv片段是曲妥珠单抗最小的片段，为其重链和轻链的可变区通过共价键连接在一起形成，具有体积小、肿瘤组织中渗透性强的优势，可减少血液循环及肝脏对抗体的摄取，减少完整抗体激发的补体介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞的细胞毒性。并且，scFv片段可通过大肠杆菌等细胞培养得到，与采用哺乳动物细胞培养的完整抗体相比，更加经济实惠且易于批量化生产。因此，scFv片段可作为靶向配体连接到美登素纳米粒上。

美登素，又称作美坦辛，是一种天然的具有抗肿瘤治疗作用的柄型大环内酯类抗生素，是一种高效有丝分裂抑制剂。研究发现，美登素通过与有丝分裂细胞的微管蛋白特异性结合，阻止微管蛋白的聚合，最终抑制细胞中期的有丝分裂。临床前期实验发现美登素对乳腺癌等肿瘤均有非常显著的肿瘤抑制作用，药效比长春碱类高100-1000倍。然而，其最大耐受剂量很低，且超过耐受剂量后，具有很强的毒副作用。因此，临床上迫切需要开发美登素的新型靶向递送系统以克服上述缺陷。针对HER2阳性乳腺癌治疗的曲妥珠单抗美登素共传递系统进行了深入的研究。共传递系统将美登素包裹在纳米粒内，曲妥珠单抗片段通过连接分子连接在载体表面作为靶向配体。通过配体与癌细胞表面受体特异性结合，实现定点释放药物，使药物长期维持在治疗浓度。

发明内容

一种连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，所述美登素纳米粒组合物包含：活性成分美登素，聚合物混合物和靶向配体；所述聚合物混合物包含甲氧基封端的PEG-PLGA和马来酰亚胺基封端的 PEG-PLGA；所述活性成分在所述药物组合物中的含量为0.1％～5％，所述聚合物混合物在所述药物组合物中的重量含量为80％～99.9％。

优选的，所述甲氧基封端的PEG-PLGA具有0.4～0.8dl/g的特性黏度；所述马来酰亚胺基封端的 PEG-PLGA具有0.1～0.35dl/g的特性粘度。

优选的，所述甲氧基封端的PEG-PLGA与所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重量比为(50～ 150):(1～20)。

优选的，所述甲氧基封端的PEG-PLGA的丙交酯和乙交酯的摩尔比为65:35～90:10；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的丙交酯与乙交酯的摩尔比为50:50～75:25。

优选的，所述甲氧基封端的PEG-PLGA的重均分子量为45,000～155,000；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重均分子量为3,500～55,000。

优选的，所述靶向配体的连接量率为20％～70％。

优选的，所述美登素的重量含量为3.5％，所述聚合物混合物在所述药物组合物中的重量含量为96.5％；所述甲氧基封端的PEG-PLGA与马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重量比为96：4；所述甲氧基封端的 PEG-PLGA的分子量为70,000～85,000，特性黏度为0.4～0.8dl/g，丙交酯与乙交酯的摩尔比为75:25；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的分子量为20,000～35,000，特性粘度为0.1～0.35dl/g，丙交酯与乙交酯的摩尔比为50:50；所述靶向配体的连接量率为40～50％。

本发明提供一种连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其含有活性成分和聚合物混合物，其中活性成分选自美登素；药物聚合物混合物包含甲氧基封端的PEG-PLGA和马来酰亚胺基封端的 PEG-PLGA；靶向配体选自曲妥珠单抗片段；药物组合物中活性成分的重量含量为0.1％～5％，优选为 0.2％～4.5％，更优选为0.4％～4％；药物组合物中甲氧基封端的PEG-PLGA和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA 的含量为80％～99.9％，优选为90％～99.8％，更优选为96％～99.6％；所述靶向配体的连接量率为10％～90％。

本文公开的纳米粒是指均匀的溶解和(或)分散于高分子材料中的药物所构成的球形颗粒，粒径范围为50-500nm，且通常制备成注射用的混悬剂。

两种PEG-PLGA，是指第一种高特性黏度甲氧基封端的PEG-PLGA和第二种低特性黏度马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA，高特性黏度为0.4～0.8dl/g，优选为0.5～0.7dl/g，更优选为0.55～0.65dl/g；低特性黏度为0.1～0.35dl/g，优选为0.1～0.3dl/g，更优选为0.2～0.3dl/g。高特性黏度的甲氧基封端的PLGA 与低特性黏度的马来酰亚胺基封端的PLGA的重量比为(50～150):(1～20)，优选为(70～100): (3～10)，更优选为96:4。

PLGA特性黏度按如下条件进行测定：将PLGA用氯仿配制成约0.5％(w/v)的溶液，于30℃采用 Cannon-Fenske玻璃毛细管黏度计测定PLGA的特性黏度。

两种PEG-PLGA也可以是指第一种高分子量甲氧基封端的PEG-PLGA和第二种低分子量马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA，高分子量为45,000～155,000，优选为65,000～100,000，更优选70,000～85,000；低分子量为3,500～55,000，优选为4,500～40,000，更优选为20,000～35,000。高分子量PEG-PLGA 与低分子量PEG-PLGA的重量比为(50～150):(1～20)，优选为(70～100):(3～10)，更优选为96:4；高分子量PEG-PLGA中的丙交酯与乙交酯的摩尔比在65:35～90:10，优选为75:25；低分子量 PEG-PLGA中的丙交酯与乙交酯的摩尔比在50:50～75:25，优选为50:50。本发明所用的术语“分子量”是指“重均分子量”，简称为“分子量”。

为方便描述，在下文中，PEG-PLGA中丙交酯相对于乙交酯的摩尔比以及PLGA的特性黏度在PLGA 之后的括号中表示。例如，“PEG-PLGA(75/25，0.6A)”表示丙交酯与乙交酯的摩尔比为75:25、特性粘度为0.6dl/g且末端基为甲氧基的丙交酯-乙交酯共聚物。

特别的，本发明中具有高特性黏度的甲氧基封端的PEG-PLGA(75/25，0.6A)与具有低特性黏度的马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA(50/50，0.25A)的重量比优选为96:4。

具体地，在本发明的纳米药物组合物中，美登素的优选重量含量为3.5％且甲氧基封端和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重量含量为96.5％，两种PEG-PLGA的重量比为96：4，两种PEG-PLGA的分子量分别为70,000～85,000和20,000～35,000，两种PEG-PLGA的特性粘度分别为0.55～0.65dL/g和 0.2～0.3dL/g，两种PEG-PLGA中丙交酯相对于乙交酯的摩尔比分别为75:25和50:50。

本发明所用的“载药量”为实际载药量，按照以下等式计算：载药量＝[纳米粒中药物的量/(纳米粒中药物的量+纳米粒中聚合物的量)]×100％。

本发明的美登素纳米粒可以采用常规方法来制备，例如乳化－溶剂挥发法、纳米沉淀法等。

乳化-溶剂挥发法：将美登素与PEG-PLGA溶于适当的有机溶剂中，将有机溶剂注入到水溶性高分子配制水相溶液中以进行分散乳化、然后挥干有机溶剂，洗涤残留物并过滤得到微球。有机溶剂可选自卤代烃(例如，二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、或三氯乙烷等)、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙醚、环己烷、苯甲醇或其组合。水溶性高分子可选自聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚甲基丙烯酸钠、和聚丙烯酸钠中的至少一种、或其两种以上的组合。分散乳化可采用机械搅拌来进行或通过静态混合器来进行。

纳米沉淀法：称取一定量的甲氧基封端的PEG-PLGA和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA，溶于有机溶剂作为有机相，超纯水作为水相，在冰水浴条件下，将有机相缓慢滴加到水相，磁力搅拌挥发除去有机溶剂即得纳米粒。

单抗片段的连接是在适合的纳米粒子浓度下加入单抗溶液，冰水浴搅拌一定时间即得连接单抗的纳米粒。本发明还提供连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒在制备抗乳腺癌药物中的用途，其中乳腺癌是只 HER2阳性转移性乳腺癌，既往曾接受曲妥珠单抗和一种紫杉烷类分开或联用患者的治疗。

有益效果：

该技术方案提供了一种新的美登素作为药物且连接较小抗体片段作为靶向配体的主动靶向制剂给药系统，该靶向配体制备成本更为低廉，为HER2阳性乳腺癌治疗提供了一种可行的靶向治疗药物。

附图说明

图1为实施例4中美登素纳米粒和连接scFv片段的美登素纳米粒的透射电镜照片。

图2为实施例4中美登素溶液、美登素纳米粒的体外释放图片。

具体实施方式

如本文所述的，多种实施方式涉及药物组合物，其含有：活性成分为美登素；含有第一种甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物和第二种马来酰亚胺基封端的丙交酯-乙交酯共聚物，其中药物组合物中活性成分的重量含量在0.1％～5％，优选为0.2％～4.5％，更优选为0.4％～4％。药物组合物中聚合物共混物的重量含量在 80％～99.9％，优选为90％～99.8％，更优选为96％～99.6％。所述靶向配体的连接率为10％～90％。该药物组合物以纳米粒形式存在。

本发明一个实施方式的药物组合物中，聚合物共混物由甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物和马来酰亚胺基封端的丙交酯-乙交酯共聚物组成。

在本发明一个实施方式的药物组合物中，甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物具有0.4～0.8dl/g的高特性黏度，优选为0.5～0.7dl/g，更优选为0.55～0.65dl/g；马来酰亚胺基封端的丙交酯-乙交酯共聚物具有0.1～0.35dl/g的低特性粘度，优选为0.1～0.3dl/g，更优选为0.2～0.3dl/g；甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物与第二种未封端的丙交酯-乙交酯共聚物的重量比为(50～150):(1～20)，优选为(70～100):(3～10)，更优选为96:4；甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物中的丙交酯与乙交酯的摩尔比在65:35～90:10，优选为75:25；马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的丙交酯与乙交酯的摩尔比为 50:50～75:25，优选为50:50。

在本发明另一实施方式的药物组合物中，甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物具有45,000～155,000 的重均分子量，优选为65,000～100,000，更优选70,000～85,000；马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA 的重均分子量为3,500～55,000，优选为4,500～40,000，更优选为20,000～35,000。甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物与马来酰亚胺基封端的丙交酯-乙交酯共聚物的重量比为(50～150):(1～ 20)，优选为(70～100):(3～10)，更优选为96:4；甲氧基封端的丙交酯-乙交酯共聚物中的丙交酯与乙交酯的摩尔比在65:35～90:10，优选为75:25；马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的丙交酯与乙交酯的摩尔比为50:50～75:25，优选为50:50。

本发明一个优选实施方式的药物组合物中，美登素的重量含量为3.5％，聚合物共混物的重量含量为 96.5％，甲氧基封端的PEG-PLGA与马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重量比为96：4，甲氧基封端的PEG-PLGA 的分子量为70,000～85,000，马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的分子量为20,000～35,000，甲氧基封端的PLGA的特性黏度为0.55～0.65dl/g，马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的黏度为0.2～0.3dl/g，甲氧基封端的PEG-PLGA中的丙交酯与乙交酯的摩尔比为75：25且马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA中的丙交酯与乙交酯的摩尔比为50：50。

本发明还提供美登素药物组合物在治疗乳腺癌药的制备中的用途，其中乳腺癌主要指HER2阳性的乳腺癌。

将通过以下实施例和测试实施例来进一步说明本发明，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

称取甲氧基封端的PEG-PLGA 57.6mg和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA 2.4mg溶解在3ml丙酮中，加入650μl浓度为3.33mg/ml的美登素溶液，涡旋混匀作为有机相，在冰水浴及磁力搅拌(转速为360rpm) 条件下将有机相缓慢滴加到水相中，然后使有机溶剂完全挥发即得美登素纳米粒。微球的载药量为3.0％，粒度D50为112nm。

实施例2

称取甲氧基封端的PEG-PLGA 57.6mg和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA 2.4mg溶解在3ml丙酮中，加入550μl浓度为3.33mg/ml的美登素溶液，涡旋混匀作为有机相，在冰水浴及磁力搅拌(转速为360rpm) 条件下将有机相缓慢滴加到水相中，然后使有机溶剂完全挥发即得美登素纳米粒。载药量为2.3％，粒度 D50为85nm。

实施例3

称取甲氧基封端的PEG-PLGA 57.6mg和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA 2.4mg溶解在3ml丙酮中，加入450μl浓度为3.33mg/ml的美登素溶液，涡旋混匀作为有机相，在冰水浴及磁力搅拌(转速为360rpm) 条件下将有机相缓慢滴加到水相中，然后使有机溶剂完全挥发即得美登素纳米粒。载药量为1.5％，粒度 D50为80nm。

实施例4

室温下称取8.87mg甲氧基封端的PEG-PLGA、0.37mg马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA，101μl浓度为 3.33mg/ml的美登素溶液，加入2.0mL丙酮超声溶解，作为有机相。将有机相缓慢滴加进入磁力搅拌下的10mL超纯水中(冰水浴条件下)，冰水浴一小时后，撤去冰水浴，常温下磁力搅拌2-3小时，使有机溶剂挥发完全。即得美登素纳米粒。用100k超滤管浓缩上述纳米粒超滤至体积剩余1mL，浓缩条件为4℃下 3500rpm，12min。浓缩结束后将纳米粒浓缩液置于小烧杯中，立即加入10mLscFv片段溶液(溶于0.01mol/L 的pH 7.4的磷酸缓冲液，浓度约4.3544ug/mL)，避光，冰水浴磁力搅拌一小时后室温下继续反应8小时。即得连接scFv片段的美登素纳米粒。反应后取1.0mL离心(4℃，4000rpm，45min)，取上清液按BCA试剂盒说明书操作，检测游离单抗浓度,得单抗连接率。所得纳米粒载药量为3.0％，粒度D50为123nm，单抗连接率为60％。

取1滴美登素纳米粒溶液滴在铜网上，固定，铜网周围多余的液体用滤纸吸干，用磷钨酸液(1％)染色，多余的染色液用滤纸吸干、干燥。用透射电镜观察美登素纳米粒的形态。结果见附图1。由图1可以看出，纳米粒为规则的球形粒子，粒径分布较均匀，没有出现聚团和黏连的现象。

采用膜透析法来考察美登素纳米粒的体外释放特性。取1.5ml美登素纳米粒溶液置于透析袋(分子截留量为8000～14000)中，将透析袋放在40ml含有0.5％吐温80的PBS(pH7.4)缓冲溶液中，设置摇床条件为37℃、130rpm,分别在0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、32h、48h、72h、96h取透析液1ml同时补充同温度同体积的释放介质。用HPLC测定透析液中美登素的含量。计算美登素纳米粒的累积释放度并绘制累积释放曲线。结果见附图2。由图2可以看出，美登素溶液在12h内即可释放完全，累积释放量达到93.82％±2.26％。美登素纳米粒(DM1-NPs，scFv-DM1-NPs)可实现药物的缓慢释放，72小时的累积释放量分别为89.12％±2.32％和83.28％±3.70％。从体外的释放实验可以看出，以高分子PEG-PLGA作为载体包载美登素可以达到缓释的效果。靶头scFv修饰纳米粒，对药物的释放无影响。

采用激光共聚焦显微镜观察连接scFv片段的纳米粒和未连接单抗的纳米粒被肿瘤细胞的摄取情况。取对数生长期的乳腺癌细胞BT-474(HER2+)，接种于24孔板。将孔板放于细胞培养箱中培养48小时，细胞贴壁。然后加入连接scFv片段的纳米粒溶液和未连接scFv片段的纳米粒(纳米粒均用尼罗红标记)，分别培养一段时间。弃去含药培养基，冲洗，多聚甲醛固定，再冲洗，加入hoechst33342孵育，最后用冷的PBS冲洗细胞3次。将细胞爬片倒置于载玻片上，共聚焦显微镜下观察纳米粒在细胞内的摄取部位。结果显示，随着时间的增加，越来越多的纳米粒(红色)分布在蓝色的细胞核周围，也说明了纳米粒被细胞摄取后主要分布在细胞质中。细胞核周围的纳米粒分布的密度显示，scFv-NPs大于NPs。证明了scFv 片段修饰的纳米粒有良好的靶向性和更高的肿瘤渗透性。

Claims (7)

1.一种连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述美登素纳米粒组合物包含：活性成分美登素，聚合物混合物和靶向配体；所述聚合物混合物包含甲氧基封端的PEG-PLGA和马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA；所述活性成分在所述药物组合物中的含量为0.1％～5％，所述聚合物混合物在所述药物组合物中的重量含量为80％～99.9％。

2.根据权利要求1所述的连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述甲氧基封端的PEG-PLGA具有0.4～0.8dl/g的特性黏度；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA具有0.1～0.35dl/g的特性粘度。

3.根据权利要求2所述的连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述甲氧基封端的PEG-PLGA与所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重量比为(50～150):(1～20)。

4.根据权利要求3所述的连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述甲氧基封端的PEG-PLGA的丙交酯和乙交酯的摩尔比为65:35～90:10；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的丙交酯与乙交酯的摩尔比为50:50～75:25。

5.根据权利要求1或2所述的连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述甲氧基封端的PEG-PLGA的重均分子量为45,000～155,000；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重均分子量为3,500～55,000。

6.根据权利要求5所述的连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述靶向配体的连接量率为20％～70％。

7.根据权利要求6所述的连接曲妥珠单抗片段的美登素纳米粒组合物，其特征在于，所述美登素的重量含量为3.5％，所述聚合物混合物在所述药物组合物中的重量含量为96.5％；所述甲氧基封端的PEG-PLGA与马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的重量比为96：4；所述甲氧基封端的PEG-PLGA的分子量为70,000～85,000，特性黏度为0.4～0.8dl/g，丙交酯与乙交酯的摩尔比为75:25；所述马来酰亚胺基封端的PEG-PLGA的分子量为20,000～35,000，特性粘度为0.1～0.35dl/g，丙交酯与乙交酯的摩尔比为50:50；所述靶向配体的连接量率为40～50％。

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