CN112674349B - 一种铁强化剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁强化剂及其制备方法，通过离子交换法制备的GAFe3+，取质量比为0.5‑2的WPI和GAFe3+，分别制成溶液并进行混合，调节pH值至3.5‑4.8之间，使WPI和GAFe3+发生静电作用形成可溶性分子内复合物，热处理使之形成稳定的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，得到一种铁强化剂，该铁强化剂将铁离子包覆在WPI和GA复合得到的纳米微球中，提高了其在模拟胃液pH下的稳定性，提高了铁离子生物利用度，为补铁剂的强化应用提供新的思路。
Description
技术领域
本发明属于蛋白-多糖复合物制备技术领域，具体涉及一种铁强化剂及其制备方法。
背景技术
铁离子是人体最重要的微量元素之一，它参与氧转运蛋白的合成，特别是血红蛋白和肌红蛋白的合成，缺铁常导致缺铁性贫血（IDA）。IDA被认为是影响全球22亿人口的最常见的全球健康问题。饮食中摄入的铁量不足以及食物中铁的利用率低是导致缺铁的主要原因。目前，通过补铁剂或食物强化来增加铁摄入量是较为有效的方法，而铁强化是很困难的，因为最具生物可利用性的水溶性强化剂，如硫酸亚铁和乙二胺四乙酸铁钠（EDTA），在铁离子和食品成分之间的相互作用易引起食品品质劣变。水难溶性铁强化剂，如焦磷酸铁和富马酸亚铁，反应活性较低，通常在液体食品基质中具有较低的生物利用度，且同样存在铁腥味和引起食品变色等问题。因此研究开发新型的易于吸收、副作用小的铁强化剂是十分必要的。
最近，新开发的多糖-铁（Ⅲ）配合物与硫酸亚铁和EDTA钠铁相比具有较高的生物利用度和较低的反应性，并被提出作为新型铁强化剂。研究表明，多糖-铁（Ⅲ）配合物可被人体吸收，其生物相容性不低于硫酸亚铁。由于在生理条件下相对高浓度的铁的无毒形式，这些复合物可以作为治疗IDA的铁强化剂。张等人通过在碱性条件下向低分子量卟啉溶液中加入氯化铁溶液，制备了一种新型多糖-铁络合物。该复合物可使IDA小鼠的红细胞数量增加。然而，还有研究表明，多糖-铁（Ⅲ）配合物与无机铁盐相比没有明显的优势，因为多糖-铁（Ⅲ）配合物会在模拟胃液中迅速水解成无机铁离子。Lu等报道，在模拟胃液消化15min时，约有52.9%的铁离子从黄芪多糖-铁（Ⅲ）复合物中释放，2h后达到87.37%，表现出铁离子持续释放。此外，多糖提取和纯化工艺的复杂性及其分子构型的不同限制了其应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种在模拟胃液pH下具有稳定效果的一种铁强化剂及其制备方法，该铁强化剂能改善多糖铁在模拟胃肠液下的稳定性，提高铁离子生物利用度。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种铁强化剂的制备方法，包括如下步骤：
S1 制备载铁阿拉伯胶（GAFe3+），取质量比为0.5-2的乳清分离蛋白（WPI）与载铁阿拉伯胶（GAFe3+），分别配制成溶液；
S2 将WPI溶液滴加在GAFe3+溶液中得到第一前驱体；
S3调节第一前驱体的pH值为3.5-4.8，加热，得到质量浓度为0.5%-5.0%的乳清分离蛋白-载铁阿拉伯胶（WPI/GAFe3+）纳米微球溶液即为铁强化剂。
进一步的，步骤S1中，采用离子交换法制备GAFe3+，具体步骤如下：
1）将氢离子交换树脂用1M HCl处理4h-6 h，并用去离子水充分洗涤除去游离氢离子；
2）将0.5M FeCl3加入氢离子交换树脂中3h-5h，然后用去离子水清洗；
3）将质量浓度为15%阿拉伯胶（GA）溶液加入氢离子交换树脂中3h-5h，对交换后的GA溶液进行透析后，冷冻干燥，得到GAFe3+粉末。
进一步的，步骤2）中清洗完后使用0.5M AgNO3溶液检测氢离子交换树脂中的游离氯离子是否完全被除去。
进一步的，步骤S2中，WPI溶液滴加在正在搅拌的GAFe3+溶液中。
进一步的，步骤S3中，所述加热的温度为80 ℃-90 ℃，加热时间为10 min -20min。
进一步的，步骤S3中，调节第一前驱体的pH值为4。
进一步的，步骤S3中，所述WPI/GAFe3+纳米微球溶液的质量浓度为2%。
本发明还提供根据上述制备方法得到的一种铁强化剂，所述铁强化剂为质量浓度为1.0%-2.0%的WPI/GAFe3+纳米微球溶液。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供一种铁强化剂的制备方法，将铁离子与GA复合，得到GAFe3+，并在GAFe3+的基础上引入WPI，调节混合物的pH值，使两者发生静电相互作用形成稳定的可溶性分子内复合物，热处理后得到WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即为铁强化剂，本发明中严格控制制备过程中WPI和GAFe3+的质量比、WPI溶液和GAFe3+溶液混合后的溶液pH值，以及最终得到的WPI/GAFe3+纳米微球溶液的溶液浓度，从而得到能在模拟胃液pH下能稳定存在铁强化剂，该铁强化剂在模拟胃液中解离的铁离子的时间长，可以提高铁离子的生物利用度，为新型补铁剂的强化应用提供了新思路。
本发明中采用WPI和GAFe3+混合制备铁强化剂，制备方法简单，便于实际应用，制得的铁强化剂质地均匀，水分散性良好，胃肠刺激小、易于吸收，并且该铁强化剂中铁离子被包裹在纳米微球中，可掩盖铁离子的铁腥味，提升口感。
附图说明
图1为WPI与GAFe3+的质量比为0.5时的GA、WPI、GAFe3+、WPI/GAFe3+纳米微球溶液的Zeta电位图；
图2 为葡萄糖醛酸内酯（GDL）酸化过程中，WPI/GAFe3+混合物的浊度（500nm，τ）、散射光强（173o，I173）及流体力学半径（Rh）随pH变化的变化图；
图3 为GA、GAFe3+和WPI/GAFe3+的粒度分布图；
图4为WPI/GAFe3+纳米微球的微观形貌图；
图5为GAFe3+和WPI/GAFe3+纳米微球在模拟胃液（pH=2）和肠液（pH=7.5）中铁离子释放率图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例1
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分洗涤游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中3h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15%的GA溶液加入树脂中3h，用去离子水透析，得到GAFe3+。取质量比为1：2的WPI和GAFe3+，分别制备成溶液，将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中，调节样品的pH值至4.8并在80℃下加热20分钟，得到0.5%（w/w）浓度的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即铁强化剂。
实施例2
用1M HCl处理氢离子交换树脂6h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中5h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中5h，用去离子水透析，得到GAFe3+。取质量比为1：2的WPI和GAFe3+，分别制备成溶液，将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中，调节样品的pH值至3.5并在85℃下加热15分钟，得到1.0%（w/w）浓度的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即铁强化剂。
实施例3
用1M HCl处理氢离子交换树脂5h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。取质量比为1：2的WPI和GAFe3+，并分别配制成溶液，将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中，调节样品的pH值至4.0并在85℃下加热15分钟，得到2.0%（w/w）浓度的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即铁强化剂。
实施例4
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。取质量比为1：2的WPI和GAFe3+，并分别配制成溶液，将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中，调节样品的pH值至4.0并在90℃下加热10分钟，得到5.0%（w/w）浓度的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即为铁强化剂。
实施例5
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。取质量比为1：1的WPI和GAFe3+，并分别配制成溶液，将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中，调节样品的pH值至4.0并在85℃下加热15分钟，得到2.0%（w/w）浓度的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即为铁强化剂。
实施例6
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。取质量比为2：1的WPI和GAFe3+，并分别配制成溶液，将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中。调节样品的pH值至4.0并在85℃下加热15分钟，得到2.0%（w/w）的WPI/GAFe3+纳米微球溶液，即为铁强化剂。
对比例1
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中来制备1.0%的WPI/GAFe3+混合物溶液，WPI和GAFe3+质量比为5：1，调节样品的pH值至3.0，生成不溶性分子间复合物。85℃下加热15分钟，蛋白间因架桥絮凝发生沉淀，载铁率偏低。
对比例2
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中来制备5.0%的WPI/GAFe3+混合物溶液，WPI和GAFe3+质量比为1：1。调节样品的pH值至5.0，85℃下加热15分钟出现大量絮状沉淀，并未形成载铁纳米微球。
对比例3
用1M HCl处理氢离子交换树脂4h，用去离子水充分清洗游离氯离子。配制浓度为0.5M FeCl3溶液。将FeCl3溶液加入树脂中4h，用去离子水洗涤，用0.5M AgNO3溶液检测树脂中的游离氯离子是否被完全除去。将质量浓度为15% GA溶液加入树脂中4h，用去离子水透析，得到GAFe3+。将WPI溶液滴加到正在搅拌的GAFe3+溶液中来制备2.0%浓度的WPI/GAFe3+混合物溶液，WPI和GAFe3+质量比为1：5。调节样品的pH值至4.0并在85℃下加热15分钟，因WPI含量过低，得到的WPI/GAFe3+纳米微球较少，因此载铁率仅为22.2%。
其中，实施例1-6制备得到的WPI-GAFe3+纳米微球溶液及对比例1-3中得到的产物的各项性能数据见表1。
表1 WPI/GAFe3+纳米微球的粒径、电位及载铁率
| 混合比例 | pH值 | 总浓度(%) | 平均粒径(nm) | Zeta电位（mV） | 载铁率（%） | |
| 实施例1 | 1:2 | 4.8 | 0.5% | 947.5±14.2 | -23.3±0.2 | 58.0±0.2 |
| 实施例2 | 1:2 | 3.5 | 1.0% | 784.7.6±7.9 | -23.9±0.5 | 65.6±0.8 |
| 实施例3 | 1:2 | 4 | 2.0% | 259.3±2.5 | -22.4±0.7 | 83.4±0.5 |
| 实施例4 | 1:2 | 4 | 5.0% | 5259.9±18.2 | -16.8±0.9 | 68.0±0.6 |
| 实施例5 | 1:1 | 4 | 2.0% | 198.4±5.6 | -19.6±0.4 | 61.2±0.3 |
| 实施例6 | 2:1 | 4 | 2.0% | 434.8±12.9 | -20.6±0.3 | 55.2±0.4 |
| 对比例1 | 5:1 | 3 | 1.0% | 沉淀 | / | 20.9±0.7 |
| 对比例2 | 1:1 | 5 | 5.0% | 沉淀 | / | 23.5±1.8 |
| 对比例3 | 1:5 | 4 | 2.0% | 193.5±11.5 | -25.9±0.2 | 22.2±1.9 |
由表1可知，WPI/GAFe3+纳米微球溶液的总浓度为2.0%，WPI和GAFe3+的混合质量比为1：2，pH为4.0时，WPI/GAFe3+纳米微球的粒径最小，且载铁率最高，达到（83.4±0.5）%，将WPI/GAFe3+纳米微球溶液作为一种新型的铁强化剂，载铁率越高最终的补铁效果越好。
由表1中对比例的各项性能数据可以看出，当WPI与GAFe3+的质量比或其混合溶液的pH值偏离本发明中限定的范围，则出现蛋白絮凝引起的沉淀现象或形成的载铁纳米微球较少，载铁量偏低。
图1展示了WPI、GAFe3+及WPI/GAFe3+混合物的ξ-电位随pH的变化情况。纯WPI的等电点（IEP）为4.8。当pH﹥4.8时，GAFe3+的Zeta电位绝对负值超过33mV；当pH﹤2.0时，GAFe3+的Zeta电位接近于零。因此WPI和GAFe3+在pH为2.0-4.8时可通过静电相互作用形成复合物。
图2展示了总浓度为0.3% (w/w)，WPI与GAFe3+的混合质量比为0.5时WPI/GAFe3+静电复合物的浊度（τ，△）、散射光强（I173，◇）随pH的变化。从蛋白等电点（IEP）开始散射光强开始缓慢增加而浊度未发生变化，pHc为散射光强开始剧烈增加的pH，IEP被认为是可溶性复合物形成的起始点，pHc则是导致相分离的不溶性复合物形成的起点。由图1可知，当pH﹥IEP时，浊度和散射光强基本保持不变；当IEP﹤pH≤pHc时，浊度无明显变化，散射光强开始增加并偏离初始值，说明WPI和GAFe3+发生了静电相互作用；当pH≤pHc时，散射光强开始剧烈增加，浊度开始升高，说明WPI和GAFe3+之间的静电作用显著增强。介于IEP和pHc间pH可认为形成了可溶性分子内复合物。因此WPI/GAFe3+可溶性分子内复合物形成的pH值的区域为3.5-4.8。
图3显示了GA，GAFe3+和WPI/GAFe3+纳米微球的粒径分布。WPI/GAFe3+纳米微球的平均粒径为259.25nm，显著高于GAFe3+的平均粒径159.85nm，表明WPI与GAFe3+发生了有效结合。
图4为WPI/GAFe3+纳米微球的微观形貌图，从图中可以看出，WPI/GAFe3+纳米微球呈球状分布，分散均匀，无粘连团聚现象。
图5显示了GAFe3+和WPI/GAFe3+纳米微球在模拟胃液（pH 2）和肠液（pH 7.5）中铁离子的释放率。从图中可以看出在模拟胃液中，前1hGAFe3+呈现突释且释放率较大，在接下来4h Fe3+释放量呈持续增加趋势。而WPI/GAFe3+纳米微球在前1h Fe3+释放相对GAFe3+较缓慢，在模拟胃液中5h后其释放率约为20%远低于GAFe3+的65%。这可能是由于该可溶性分子内复合物具有良好的pH稳定性，蛋白聚集可屏蔽其消化位点，多糖可提供空间位阻阻止消化酶的靠近。因此能有效缓解WPI/GAFe3+纳米微球中Fe3+在模拟胃液pH下的解离。在模拟肠液中GAFe3+和WPI/GAFe3+纳米微球具有相同的缓释趋势，这主要归因于该分子内复合物具有良好的pH稳定性。
本发明采用的检测方法：
（1）测定ξ-电位的方法：
通过Zetasizer Nano-ZS型纳米激光粒度及电位分析仪（光散射检测角度为173°，激光器波长633nm，He/Ne气体激光器功率4mW）检测pH 2.0-8.0下WPI/GAFe3+纳米微球溶液的ξ-电位。
（2）测定流体力学和散射光强的方法：
通过纳米粒度及电位分析仪（光散射检测角度为173°，激光器波长633nm，He/Ne气体激光器功率4mW）测定3.5 h内混合物酸化过程中，流体力学半径及散射光强的变化。流体力学半径及散射光强每30s记录一次。
（3）测定浊度的方法：
使用紫外可见分光光度计在500nm下连续测定3.5 h内混合物酸化过程中浊度的变化，每隔30s记录一次透过率的变化。
（4）测定在线酸化的方法：
将GDL（浓度为0.25wt%）添加到混合溶液中进行酸化。GDL通过水解产生葡萄糖酸，进而形成葡萄糖酸内酯和葡萄糖酸的平衡溶液，从而葡萄糖酸释放H+，降低溶液pH。由于GDL水解过程和酸化过程比较缓慢，因此可以通过在线监测溶液pH的连续变化。样品混合并迅速摇匀，用pH计连续测定3.5 h内混合物酸化过程中pH随时间的变化，每30s记录一次pH值。
（5）测定粒径的方法：
通过Zetasizer Nano-ZS型纳米激光粒度及电位分析仪测定WPI/GAFe3+纳米微球溶液中的WPI/GAFe3+纳米微球的粒径分布。
（6）测定模拟胃肠稳定性的方法：
模拟胃液的配制：室温下，取7mL浓盐酸，2.00g氯化钠，3.20g胃蛋白酶，加入到900mL纯水中，随后用2mol/L盐酸调节pH至1.3，定容至1000mL。
模拟肠液的配制：室温下，称取6.8g磷酸二氢钾溶于250mL去离子水中，完全溶解后加入190mL 0.2mol/L NaOH和400mL去离子水，加胰蛋白酶10g，胆盐5g，混匀后用0.2mol/L NaOH将溶液pH值调为7.5，随后定容至1000mL。
采用透析袋法测定WPI/GAFe3+纳米微球在模拟胃肠液体系下Fe3+的释放情况。取2mL湿样置于分子量为14000的透析袋中，在37℃下将透析袋没于100mL人工模拟胃肠液中，并在150rpm下搅拌不同的时间，在设定的时间内从模拟胃肠液中取出3mL透析液，采用邻菲罗啉比色法测定模拟胃肠液中铁离子的释放率。
Claims (4)
1.一种铁强化剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1制备载铁阿拉伯胶，取质量比为0.5-2的乳清分离蛋白与载铁阿拉伯胶，分别配制成溶液；
S2将乳清分离蛋白溶液滴加到正在搅拌的载铁阿拉伯胶溶液中得到第一前驱体；
S3调节第一前驱体的pH值为4，80 ℃-90 ℃，加热10 min -20min，得到质量浓度为1.0%-2.0%的乳清分离蛋白-载铁阿拉伯胶纳米微球溶液即为铁强化剂。
2.根据权利要求1所述的一种铁强化剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，采用离子交换法制备载铁阿拉伯胶，具体步骤如下：
1）将氢离子交换树脂用1M HCl处理4h-6 h，并用去离子水充分洗涤除去游离氢离子；
2）将0.5M FeCl3加入氢离子交换树脂中3h-5h，然后用去离子水清洗；
3）将质量浓度为15%阿拉伯胶溶液加入氢离子交换树脂中3h-5h，对交换后的阿拉伯胶溶液进行透析后，冷冻干燥，得到载铁阿拉伯胶粉末。
3.根据权利要求2所述的一种铁强化剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中清洗完后使用0.5M AgNO3溶液检测氢离子交换树脂中的游离氯离子是否完全被除去。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法制得一种铁强化剂，其特征在于，所述铁强化剂为质量浓度为1.0%-2.0%的乳清分离蛋白-载铁阿拉伯胶纳米微球溶液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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