CN112662670A

CN112662670A - 花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112662670A
Application number: CN202011565051.0A
Authority: CN
Inventors: 张新友; 石磊; 苗利娟; 黄冰艳; 张忠信; 齐飞艳; 代小冬; 孙子淇; 秦利; 董文召
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112662670B

Abstract

本发明涉及花生脂酰‑酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用。该启动子为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明从花生中克隆出脂酰‑酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子，利用本发明提供的启动子构建重组表达载体，然后将所述表达载体利用农杆菌介导的方法转化拟南芥，启动下游重组基因在种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片中表达，是一个类似于组成型的启动子，可以应用于转基因提高作物的抗病性、抗逆性、抗虫性，可将其应用于转基因工程中，使得目的基因表达产物在上述各个植物组织中积累，增加组织中的表达量，发挥更好效果，因此在基因工程育种及转基因研究中具有重要的应用价值。

Description

花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用，属于植物基因工程和生物技术领域。

背景技术

在植物转基因过程中有两个必需元件，分别是启动子和基因。启动子是位于基因5′端上游被RNA聚合酶特异性识别并结合的一段DNA序列，调控下游基因在不同组织、不同发育阶段和不同环境下的表达，是基因表达调控的必需元件。启动子按功能与转录模式可分为3类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子，在某些情况下一类启动子也会兼有其它类型启动子的特性。在实际应用中，每一类启动子的适用范围不同，各有优缺点，组织特异性和诱导型启动子可以驱动下游目的基因在特定组织中或特定条件下表达，最大限度的减少了由组成型启动子带来的负面效应，适用于启动在特定条件下和特定植物组织中表达的基因，而在实际应用过程中，人们往往需要在很多组织或整个植株中都表达某些特定基因，如抗虫或抗病基因的应用，因此这类启动子在实际应用中也有一定的局限性。

目前植物基因工程中广泛应用的是组成型启动子，如CaMV35S、玉米Ubiquitin和水稻Actl启动子，该类启动子驱动目的基因在植物各个组织和整个发育阶段持续高效表达，尽管这会造成植物体内物质和能量的浪费，增加植物的代谢负担，有时候影响植物的发育，甚至引起植物形态的改变，也存在可能增加生物安全风险的可能性。尽管存在上述不足，由于这类启动子效果明显，在实际应用中仍是人们的首选，同时可以通过增加植物营养等手段进行补偿，减少对植物的伤害。随着目前转基因植物的应用越来越广泛，发掘更多适用于未来转基因植物的启动子，具有重要理论和实际意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2，其序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为：

P_AhFATB2S：5′-ACGCGTCGACGAAAACGCACGCGATAAAAACC′-3′，

P_AhFATB2A：5′-CGCGGATCCAATTGAATTCTTCACCTGAATGCGC-3′；

(2)以基因组DNA为模板，以P_AhFATB2S、P_AhFATB2A为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括：10×buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs mixture 1.0μL，10μmol/L引物P_AhFATB2S 2.5μL，10μmol/L引物P_AhFATB2A2.5μL，5单位/μL Taq酶0.2μL，模板30～100ng；

扩增过程为：95℃预变性1min；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；

(3)PCR产物经质量体积比1.0％的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段；按目的片段、pMD18-T载体3:1的摩尔比混合，加入5个单位的T₄ DNA连接酶，10×反应缓冲液2.5μL，用无菌水补充体积至25μL，16℃连接过夜，获得连接液；

(4)用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，用小量碱法提取质粒，SalⅠ/BamHI双酶切1μg质粒，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测；将检测正确的阳性重组质粒克隆，将目的片段连入pMD18-T载体，获得载体pMD18-P_AhFATB2，即得到所述的P_AhFATB2启动子。

其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15min，4℃冷藏备用。

其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

一种含有权利要求1所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2的重组载体。

所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2的重组载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

首先用SalⅠ/BamHI双酶切克隆载体pMD18-P_AhFATB2，同时用SalI/BamHI双酶切pBI-P_AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，反应4～6小时后用质量体积比为1％的琼脂糖胶电泳检测；

将克隆载体pMD18-P_AhFATB2酶切下的1676-bp的小片段和pBI-P_AhSAD-GUS酶切下的10Kb的大片段用DNA凝胶回收试剂盒回收；按1676-bp的小片段、10Kb的大片段以摩尔浓度3:1的比例混合，加入T4 DNA连接酶5个单位、10×反应缓冲液2μL，用无菌水补充体积至20μL，16℃过夜；

用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证对正确的重组质粒命名为pBI-P_AhFATB2。

所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生种子中表达的应用。

所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生子叶、叶片或叶芽中表达的应用。

所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生花粉中表达的应用。

所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生下胚轴中表达的应用。

本发明有益效果：

1、本发明的启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物基因工程研究和花生的转基因研究中。

2、本发明的启动子能够调控下游GUS基因表达，并通过组织化学分析，获得具有种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片中表达功能的花生启动子。这一具有类似组成型表达性质的启动子在植物基因工程和转基因安全中具有应用价值，如改良种子中的营养成分、提高种子含油量、改良种子中脂肪酸组分、提高植物抗病性、改善植物耐旱性、限制外源基因扩散等方面。

3、本发明克隆到花生来源的启动子P_AhFATB2，从改良种子中的营养成分、提高种子含油量、改良种子中脂肪酸组分、提高植物抗病性、改善植物耐旱性、限制外源基因扩散等方面考虑，这种启动子具有应用潜力。用P_AhFATB2替换pBI-P_AhSAD-GUS质粒上的P_AhSAD启动子，构建pBI-P_AhFATB2重组植物表达载体，其中的GUS基因受P_AhFATB2的调控。通过转基因实验证明，该启动子在种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片中高强度驱动GUS基因的表达，可以用此启动子代替CaMV35S强启动子驱动与植物抗病性、耐旱性等相关的基因，从而创制出具有更好的抗病性、耐旱性植株或种质资源；此启动子驱动和提高种子中含油量、改良种子中脂肪酸组分及营养成分相关的基因，使得该启动子在受体植物中驱动下游目的基因在种子中表达，创制出营养丰富、含油量更高、脂肪酸组分构成更健康、品质更高的种子产品；构建含有该启动子驱动的致死基因的载体，转化受体植株，人工创制种子致死型转基因植株，防控外源基因扩散，可应用于转基因植株的安全防控领域。

4、本发明的基因启动子P_AhFATB2制备方法，操作简单、结果稳定可靠，易于实施；提供的含有该启动子核苷酸序列植物的重组载体，大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过该载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

附图说明

图1为本发明中的一种PCR扩增P_AhFATB2片段电泳图；

其中：泳道1、3为P_AhFATB2的PCR扩增结果；泳道2为阴性对照；泳道M代表500bpladder的核酸Marker；

图2为本发明中的一种AhFATB2基因的5′RACE电泳图；

其中：泳道1代表AhFATB2的5′RACE；泳道M代表500bp ladder的核酸Marker；

图3为本发明中的一种构建的pBI-P_AhFATB2载体示意图；

图4为本发明中的一种构建的pBI-P_AhFATB2载体的酶切验证图；

其中：泳道M代表500bp ladder的核酸Marker；泳道1为SalⅠ/BamHI双酶切后的效果图；

图5为本发明中的转化载体pBI-P_AhFATB2的部分转基因拟南芥植株PCR鉴定图；

其中：泳道M代表500bp ladder的核酸Marker；泳道P代表pBI-P_AhFATB2质粒的PCR扩增结果；泳道CK代表野生型拟南芥的PCR扩增结果；泳道1-9代表部分阳性株的PCR扩增结果；

图6为本发明中的P_AhFATB2驱动GUS的转基因植株的组织化学染色结果；

其中，A：10日苗(蓝色)；B：茎及叶片(茎无色、叶片蓝色)；C：幼嫩叶芽(蓝色)；D：花序(蓝色)；E：花药(蓝色)；F：角果(柱头及基本蓝色)；G：种子(蓝色)；H：胚(蓝色)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2及制备方法1、一种分离的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2，其序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

花生P_AhFATB2启动子的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用SDS裂解法提取基因组DNA

本发明所用花生(Arachis hypogeae L.)供试材料播种于大田，田间正常管理。利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)科学出版社)提取基因组DNA。

所用引物为：

P_AhFATB2S：5′-ACGCGTCGACGAAAACGCACGCGATAAAAACC′-3′(SEQ ID NO.2)；

P_AhFATB2A：5′-CGCGGATCCAATTGAATTCTTCACCTGAATGCGC-3′(SEQ ID NO.3)；

(2)以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

反应体系为25μL，体系如下：10×buffer(不含MgCl₂)2.5μL，dNTPs mixture(10mmol/L)1.0μL，引物P_AhFATB2S(10μmol/L)2.5μL，引物P_AhFATB2A(10μmol/L)2.5μL，Taq酶(5单位/μl)0.2μL，模板约100ng。

反应步骤为：95℃预变性1min；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

(3)PCR产物经1.0％(质量体积比)琼脂糖凝胶检测(图1)，凝胶回收试剂盒回收目的片段。按回收片段：载体(0.3pmo1回收片段：0.1pmol载体)＝3:1的比例混合样品，加入T₄DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液2.5μL，用无菌水补充体积至25μL，16℃连接过夜，获得连接液。

(4)冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞。将连接液涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑3个，做菌落PCR检测；PCR反应体系为25μL，内含：1×PCRbuffer、MgCl₂1.5 mmol/L、dNTP 0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，用灭菌牙签挑取少量菌斑做模版，根据具体情况设置循环参数；

将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基，37℃200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)科学出版社)提取质粒，SalⅠ/BamHI酶切质粒1μg，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。检测将目的片段正确连入pMD18-T载体的阳性重组克隆，得到P_AhFATB2启动子。

其中LB固体培养基配方如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠、8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，然后分装于500毫升三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用；

LB液体培养基配方如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

为了确保载体中启动子的序列信息，以M13F/M13R为引物，

M13F：5＇-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3＇(SEQ ID NO.4)；

M13R：5＇-GTAAAACGACGGCCAGT-3＇(SEQ ID NO.5)，

将pMD18-P_AhFATB2进行测序，分析结果，获得了P_AhFATB2，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.分离的花生P_AhFATB2启动子的鉴定：

根据RACE试剂盒(SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit，购自Clontech公司，货号：634941)操作说明，以花生叶片RNA为模版合成first-strand(第一链)cDNA，步骤如下：

取1.0-2.75μL RNA，1.0μL 5ˊCDS PrimerA，加dd H₂O补齐至3.75μL；72℃温浴3min，42℃冷却2min，加入1μL SMARTerⅡAoligo，加入5.25μL混合液(含5×first-strand(第一链)buffer 2.0μL、1.0μL DTT、1.0μL dNTPs mixture、0.25μLRNase Inhibitor以及1.0μL SMARTScribe Reverse Transcriptase)，42℃温浴90min，72℃加热10min以终止反应，获得first-strand cDNA模板的储存液。加入100μL EDTA稀释，得到first-strand cDNA模板的工作液；

以first-strand cDNA模板的工作液为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR以GSP1和UPM为引物，

GSP1：5'–GTCCCACAGATGAGCTTCAAACCTCCCT–3'(SEQ ID NO.6)；

UPM：5′-GTGATTTTGTTTGAGCCCTCCGC-3′(SEQ ID NO.7)；

反应体系如下：10×buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPs mixture(浓度各2.5m mol/L)1.0μL，GSP1(浓度10μmol/L)2.5μL，UPM(浓度10μmol/L)5.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，first-strand cDNA模板的工作液2.5μL，无菌水补至50μL。反应程序如下：94℃预变性1min；98℃变性10s，72℃延伸2min，共7个循环；98℃变性10s，68℃延伸2min，共33个循环；72℃延伸10min。

第二轮PCR：以第一轮PCR的反应产物50倍的稀释液作为模板，以GSP2和NUP为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPs mixture(浓度各2.5mmol/L)1.0μL，GSP2(浓度10μmol/L)2.5μL，NUP(浓度10μmol/L)2.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板溶液1.0μL，无菌水补至50μL，反应程序同第一轮PCR。PCR产物用1.0％的(质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图2。

GSP2：5'–TGTCCACCTATGCCTGGTTACTCCTCTGT–3'(SEQ ID NO.8)；

NUP：5′-GGAAAAACGACGACGTAGCAGCAG-3′(SEQ ID NO.9)。

凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司，以下相同)，转化大肠杆菌DH5ɑ菌株的感受态细胞(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，转化后的感受态均匀涂在氨苄青霉素LB固体培养基(50mg/L)上，培养16小时后挑取阳性菌斑，并在氨苄青霉素LB液体培养基(50mg/L)中扩繁，提取质粒并经酶切验证后以M13F/M13R为引物，经测序后和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列比对，两者完全同源，证明所获得的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是花生P_AhFATB2启动子。

实施例2：花生P_AhFATB2植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司)的转化

构建重组载体，是将质粒pBI-P_AhSAD-GUS(质粒pBI-P_AhSAD-GUS，河南省农业科学院经济作物研究所保存，下同)上的P_AhSAD启动子序列用克隆得到P_AhFATB2片段替换获得。

为完成此目的，首先用SalⅠ/BamHI双酶切克隆载体pMD18-P_AhFATB2，同时用SalⅠ/BamHI双酶切pBI-P_AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，约反应4～6小时后，用1％(质量体积比，下同)的琼脂糖胶电泳检测。

将克隆载体pMD18-P_AhFATB2酶切下的约1.6Kb的片段和pBI-P_AhSAD-GUS酶切下的约10Kb的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。按照pMD18-P_AhFATB2酶切下的约1.6Kb的片段和pBI-P_AhSAD-GUS切下的约10Kb的片段(75ng 1.6Kb的片段：50ng 10Kb的片段)＝3:1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4 DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液2μL，无菌水补充体积至20μL，16℃连接，过夜，获得连接液。

冻融法转化连接液至DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证正确的重组质粒，命名为pBI-P_AhFATB2；构建成植物表达载体pBI-P_AhFATB2(图3、图4)。

利用冻融法将pBI-P_AhFATB2转入根癌农杆菌EHA105，用卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)双抗性平板筛选，48小时后挑斑，菌落用PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保存菌株，命名为pBI-P_AhFATB2EHA105。

其中的冻融法步骤如下：(1)取0.2mL农杆菌EHA105感受态，于冰水中缓慢融化；(2)加入约2μg重组质粒DNA,轻轻混匀，冰浴30min后，投入液氮速冻5min，然后37℃水浴5min，融化细胞；(3)加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃轻摇培养4～5h；(4)12000rpm离心30s，去上清，细胞重悬于0.2mL的LB培养基中；(5)将培养物均匀涂布在含Rif(50mg/L)、Str(50mg/L)和Kan(50mg/L)的琼脂板上，28℃培养2天，待平板上出现转化子后挑菌，进行PCR检测。

实施例3：P_AhFATB2植物表达载体pBI-P_AhFATB2在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选

参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X.R,et al.Agrobacterium-mediatedtransformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature,2006,1:1-6)。制备含有植物表达载体pBI-P_AhFATB2的根癌农杆菌EHA105菌液，在转化拟南芥前一天，将pBI-P_AhFATB2EHA105转入含有卡那霉素50μg/mL、利福平50μg/mL的LB液体培养基200mL中，28℃、220r/min过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEKOL 1300)于276纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值在1.6～2.0之间时取出。室温(20～25℃，下同)以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％蔗糖溶液中(质量体积比)。将浑浊的蔗糖溶液倒入直径为15cm的培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的Silwet L-77(购自北京五洲元业科贸中心)，混匀。把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，15秒后取出植株花序。转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生长箱中培养。

第二天将塑料袋揭开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，将种子在培养箱或日光下干燥3～5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)的酒精和0.01％(质量比)的升汞分别消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，均匀地吹打到含卡那霉素(50mg/L)的MS固体筛选培养基表面(MS固体筛选培养基组成：MS大量元素母液100mL；MS微量元素母液10mL；MS有机母液10mL；MS铁盐10mL；肌醇10mL；蔗糖30g；用1mol/L的NaOH调pH至5.8，8g琼脂粉，定容至1L，121℃，6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，备用。各种母液配方见表1)。4℃避光放置3～5天后，转入植物生长培养箱【光周期16(白天)/8(黑暗)小时，温度：白天22℃，黑夜20℃】培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。

表1 MS培养基母液配方

当叶片长到足够大时(3～4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测，反应体系为25μL，内含：1×PCRbuffer，MgCl₂1.5 mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng；

所用引物为：

P_AhFATB2 S：5′-ACGCGTCGACGAAAACGCACGCGATAAAAACC-3′，

P_AhFATB2A：5′-CGCGGATCCAATTGAATTCTTCACCTGAATGCGC-3′；

根据具体情况设置循环参数，结果表明获得了转基因阳性苗。

将获得的转基因阳性苗进行培养，待绿苗长出两片真叶后，将其移栽到蛭石中，待植株长出花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA，做PCR鉴定。PCR鉴定时采用的引物序列为P_AhFATB2S和P_AhFATB2A；

PCR反应体系如下：基因组DNA模板1μL(约50ng)、10×Taq酶反应缓冲液2uL、25mmol/L的MgCl₂1.2 uL、2mmol/L的dNTP 1.5uL、10umol/L引物各0.2uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μL。

反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸5min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明：P_AhFATB2植物表达载体pBI-P_AhFATB2的T-DNA区段已经成功转入拟南芥(图5)，共获得55株阳性苗。

实施例4：花生P_AhFATB2启动子的功能分析

本发明首次克隆得到P_AhFATB2的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，采用拟南芥转化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子(即T2代)。取T2代10个株系的不同时期组织进行GUS染色。

T2代取染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液中，抽真空5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸溶液(体积比为1:1)进行脱色，直至叶片变为无色，之后用50％的酒精漂洗3-5次，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，取嫩叶、成熟叶片、开过的花朵、未开的花蕾、不同时期的角果及幼胚，开花后的幼胚用解剖针在显微镜下取出。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。其中GUS染液的组成为：X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-1000.001％(体积比)，甲醇20％(体积比)。

染色结果发现(表2、图6)：在拟南芥的整个生长过程中，拟南芥的种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片、幼嫩的芽(叶芽)中被染成蓝色在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片、幼嫩的芽中表达，其它组织中不表达。

实验结果表明，花生P_AhFATB2启动子具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片、幼嫩的芽中表达，在其它组织中不表达。P_AhWRI-1调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，这说明P_AhFATB2具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，GUS基因能够主要在转基因植株的种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片、幼嫩的芽中表达，而在其它组织中不表达。

这一具有组成型启动子表达特点的启动子P_AhFATB2在植物基因工程和转基因安全(提高植物抗病性、改善植物耐旱性、改良种子营养成分、提高种子含油量、改良脂肪酸组分、限制外源基因扩散)中具有应用价值。例如：利用该启动子驱动植物抗病相关基因表达，首先构建P_AhFATB2驱动目的基因的过表达载体，然后转化目的受体植物，目的基因在P_AhFATB2驱动下，可以使受体植物的叶片、种子等组织中表达抗病基因，从而使植物具备抗病性；利用该启动子驱动耐旱相关基因，首先构建P_AhFATB2驱动目的基因的过表达载体，然后转化目的受体植物，目的基因在P_AhFATB2驱动下，可以使该基因在根、叶片中富集，从而使受体植物具备更好的耐旱特性；利用该启动子驱动改善种子营养或增加含油量的目的基因，首先构建P_AhFATB2驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P_AhFATB2启动子的驱动下，在种子表达，导致种子按照设计者的方案增加营养成分或含油量，增加了种子价值；构建含有该启动子驱动的致死基因的载体，转化受体植株，人工创制种子致死转基因植株，防控基因扩散，可应用于转基因植株的安全防控领域。

染色结果发现(表2、图6)：在拟南芥的整个生长过程中，拟南芥的种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片、幼嫩的芽(叶芽)中被染成蓝色，在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在种子、子叶、下胚轴、根、花粉、叶片、幼嫩的芽中表达，其它组织中不表达。

表2 P_AhFATB2转基因拟南芥T₂代株系的GUS染色统计表

注：Y表示蓝色，N表示无色。

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用

<130> 植物基因工程

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1676

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gaaaacgcac gcgataaaaa ccttttaaca gtgcaaatgc aataataagt ccaccaatgc 60

atatggaata aataaagttc cataatccga atttatacca aacaaaacta ggtggttgtt 120

gatctataat tctatattct agctactttg cgaatctcag agcgataatg caacgaaatt 180

aacataatct agtgaacatt ttcctgcaag ggaatatatc tcatgaactt aattccatac 240

ataattaaat atttttcaaa taattattta aggagaatgc taaaactaat gtcattcttt 300

aggtgaacat tactaagttt taccatataa ctagtaatat cgaatttaat aatttaatta 360

tatttttaat tttttctaaa attaaaagtg agattcaaac ttataacttc taaaattaaa 420

agttttaagt acaaagagac tatgtcattt gaattagtgt ttgttggcac gcttttaatt 480

taaatgatat ttttctatca attaattaat ataatacata tacttgaagg aataaaaatt 540

caatctaata tatcattgtc tagatattaa aacttttaaa ggacaaaata ttatagttaa 600

ttttataaaa aaaaataata gttaatatat actatctctt ataatttaca atttcgtttc 660

aaactcaacg ttacctattt ttgaaatgga gcacctagtg tttaaaaggc catttattta 720

actaattttt aatatatatt ttatatttaa taaatatttt atataaataa ttaatttagt 780

aattaatttt tagtgtatac atattttaaa atagagtatt ttcaaattgg gataatttct 840

aaatcatatt ttaatttagg ttatatattt cttcttatta aactattgta atattgttat 900

aaaatacact aatttaaata aaaaatgtaa aattaaatgt ttaacattga tatttgttgg 960

taaaacggta aagacgcggc tagaaaagaa gagaggagag tagaggggta aaatggtaaa 1020

aaaggggaaa atagaagagt agagaagcac tcgtgtgttt tgaaaagaga agcgggagga 1080

agggacaggt ggattgtagt tctactatat aaataactaa ctttcctgct tcacaattcg 1140

gtgcgtgcca ctcactttcc tcctccgctg gccctaaata ttttacaact cataatctat 1200

atatattcat tatcctccca ttttcctttt acttttcaaa ttcaaaacca accatccttt 1260

cttcttctct gggttcacca cccacaggga gccatcacta tcaattaaac gacgtcgtag 1320

cctctcctca ataaccttcc acttatattt tcaatttcac ctctctcctt ctcttcttct 1380

tcttcttcat tcttcttctt cttcttcttc ttcaggtact gttttttaat ttgttgttct 1440

ccctcgtctg atctggctca atatttttta tgcgaatttt tcttaagcca atgccagatc 1500

tgcgcgcagt ttcgcagcgg ttttaacatt aatttctcga ttaattattg atgtgttgat 1560

gtaaaatctc attcgtgttg aatatttatt ttaattttgt ttgaaattgg aagcttgagg 1620

aaaatattgt tttctaatca actaaaacta tgcgcattca ggtgaagaat tcaatt 1676

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acgcgtcgac gaaaacgcac gcgataaaaa cc 32

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgcggatcca attgaattct tcacctgaat gcgc 34

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtcccacaga tgagcttcaa acctccct 28

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gtgattttgt ttgagccctc cgc 23

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tgtccaccta tgcctggtta ctcctctgt 29

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ggaaaaacga cgacgtagca gcag 24

Claims

1.一种花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2，其特征在于，其序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为：

P_AhFATB2S：5′-ACGCGTCGACGAAAACGCACGCGATAAAAACC′-3′，

P_AhFATB2A：5′-CGCGGATCCAATTGAATTCTTCACCTGAATGCGC-3′；

(2)以基因组DNA为模板，以P_AhFATB2S、P_AhFATB2A为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括：10×buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs mixture 1.0μL，10μmol/L引物P_AhFATB2S 2.5μL，10μmol/L引物P_AhFATB2A 2.5μL，5单位/μL Taq酶0.2μL，模板30～100ng；

3.如权利要求2所述的启动子P_AhFATB2的制备方法，其特征在于，其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15min，4℃冷藏备用。

4.如权利要求2所述的启动子P_AhFATB2的制备方法，其特征在于，其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

5.一种含有权利要求1所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的启动子P_AhFATB2的重组载体。

6.如权利要求5所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2的重组载体的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

7.如权利要求书1所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生种子中表达的应用。

8.如权利要求书1所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生子叶、叶片或叶芽中表达的应用。

9.如权利要求书1所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生花粉中表达的应用。

10.如权利要求书1所述的花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子P_AhFATB2在花生下胚轴中表达的应用。