CN112662619A - 一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞制剂技术领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂。该用工与治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂中含有脂肪细胞，且该脂肪细胞是由脂肪干细胞经过周期性冷处理步骤后获得的。本发明还将经过周期性冷处理后的脂肪干细胞注射到DMM造模小鼠关节腔内，用于治疗骨关节炎。结果表明，经过周期性冷处理后脂肪干细胞状态更加，并且体内实验表明暴露于冷环境后增强了脂肪干细胞修复软骨潜力，该方法有望成为脂肪干细胞治疗骨关节炎的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及细胞制剂技术领域，尤其涉及一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性关节疾病。骨关节炎患病率高，列全球致残疾病第六位。其主要病变是关节软骨的退行性变，滑膜炎和继发性骨赘形成。多见于中老年人，女性多于男性。好发于负重大的膝关节、踝关节、脊柱及频繁活动的手指关节等部位，该病又称骨关节病、退行性关节炎、增生性关节炎、老年关节炎等。关节软骨主要由Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖组成，其结构改变导致软骨功能丧失。骨关节炎导致关节软骨破坏，骨髓腔纤维化以及软骨下骨硬化。这些病理改变和病人关节的疼痛症状密切相关，并造成关节活动障碍和关节畸形，严重影响了患者的生活质量，引起或加剧其他的合并症，降低了预期寿命。
针对OA的治疗主要以对症缓解疼痛及控制炎症为主，并不能逆转关节组织的进行性退变，至今没有一种方法可以治愈OA。常规的治疗方法包括非药物治疗、药物治疗以及外科手术治疗。非药物治疗包括健康教育、物理治疗、支具辅助、针灸推拿、减肥、增强关节周围肌肉力量及改变运动方式等；药物治疗包括口服消炎止痛药、氨基葡萄糖及中药治疗、局部注射糖皮质激素和透明质酸钠；手术治疗包括关节镜手术治疗，主要有关节镜下清理、冲洗、半月板成形术，关节镜下游离体摘除术，关节镜下钻孔减压术，截骨术(胫骨高位截骨、腓骨截骨等)，人工关节置换术等。
传统的OA治疗方法存在很多的局限性和缺点，比如传统药物治疗后存在胃肠道甚至心血管不良反应的风险，关节腔内药物注射存在感染的风险。虽然目前人工关节置换术取得了非常大的成绩，但也局限在终末期OA，而且创伤大，并不是所有患者都能获得满意的治疗效果。一些外科治疗方法，如关节镜下自体软骨细胞植入和基质诱导自体软骨细胞植入等确实可以重建部分退化的软骨，但不能阻止OA的进展。而且这些治疗需要额外的手术来获取自体软骨，可能出现移植处软骨整合不良与周围软骨的移植缺损。因此需要研发新的治疗手段来干预骨关节炎关节重塑和破坏的关键阶段，阻止疾病的进展，促进关节功能的恢复。
在组织工程种子细胞的研究中，脂肪干细胞(ADSCs)以其快速增殖能力和多向分化潜能而被广泛研究。ADSCs在体内外的成软骨、成骨能力都得到证实，一些临床研究报道了运用人自体ASDCs成功修复了骨缺损。随着医学及相关领域的迅速发展，再生医学利用干细胞以及细胞因子发挥治疗效应，已逐渐成为一种新的治疗OA的手段。脂肪干细胞(ADSCs)由于具有多分化潜能，用于软骨再生被认为是一个很有前景的选择。ADSCs是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，属成体干细胞，来源于自身脂肪组织，因其来源丰富、获取方便、损伤小等优势近年来受到广泛关注。
ADSCs来源广泛，且易于获取，获取时局部使用麻醉药即可，创伤也较小。关于获取ADSCs的首例报道发表于2001年，它是从脂肪组织中分离出的血管基质成分中提取出来的。在之后的十几年中，这类细胞引起了人们极大的关注，因为ADSCs已被证实对软骨再生有疗效，而且是安全的。ADSCs具有促血管生成、抗氧化和免疫耐受调节等作用，组织中的多能干细胞可合成介质(细胞因子、神经调节肽、营养因子)参与组织修复和调节炎症及免疫反应，而且可以被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞系谱。从很小的脂肪组织中分离出富含间充质干细胞又带有完整血管的脂肪提取物，而且已有学者在临床中将这种自体脂肪提取物直接进行关节腔注射来修复损伤的软骨。但现有的ADSCs在使用时存在细胞质量较低、活力较差、疗效不佳的问题，还需要进一步对ADSCs的生产和培养进行进一步研究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，所述治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂的疗效佳，且易与培养和获得。
为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，该脂肪细胞制剂中含有脂肪细胞，且该脂肪细胞是由脂肪干细胞经过周期性冷处理步骤后获得的。
进一步地，所述周期性冷处理是指通过设置一个冷处理温度，将脂肪干细胞在37℃和冷处理温度下进行循环培养。
进一步地，所述循环培养中在冷处理温度下的单次冷处理时间为15min-60min，37℃下的单次处理时间为15min-60min。
进一步地，所述冷处理温度为4℃-20℃。
进一步地，所述脂肪干细胞选用P3脂肪干细胞。
进一步地，所述培养基采用高糖的DMEM培养基进行培养。
进一步地，所述循环培养时间为7d。
进一步地，所述脂肪细胞制剂在治疗骨关节炎中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，该脂肪细胞制剂中含有脂肪细胞，且该脂肪细胞是由脂肪干细胞经过周期性冷处理步骤后获得的。通过对脂肪干细胞进行周期性冷处理，能够有效地改善脂肪干细胞的生长状态，同时，通过小鼠实验证明经过周期性冷处理后的脂肪干细胞的疗效相对于常规培养温度下的脂肪干细胞效果更佳，该脂肪细胞制剂有望成为脂肪干细胞治疗骨关节炎的新途径。
附图说明
图1为不同温度处理的ADSCs状态；
其中，A为P3 ADSCs在37℃条件下培养30min的状态；B为P3 ADSCs在20℃条件下培养30min的状态；C为P3 ADSCs在10℃条件下培养30min的状态；D为P3 ADSCs在4℃条件下培养30min的状态；
图2为不同时间下10℃冷处理的ADSCs状态；
其中，A为P3 ADSCs在37℃条件下培养15min的状态；B为P3 ADSCs在10℃条件下培养15min的状态；C为P3 ADSCs在37℃条件下培养30min的状态；D为P3 ADSCs在10℃条件下培养30min的状态；E为P3 ADSCs在37℃条件下培养60min的状态；F为P3 ADSCs在10℃条件下培养60min的状态；
图3为不同冷处理温度下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔后的小鼠关节切片(番红/固绿染色)；
其中，A为正常小鼠关节腔注射PBS的膝关节的组织学图片；B为DMM 4周后关节腔注射PBS的膝关节的组织学图片。C、D、E、F为DMM 4周后关节腔注射ADSC的膝关节的组织学图片，以上关节均为DMM 8周后取材，标尺为150μm；
图4为不同温度冷处理下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔后的小鼠关节切片(番红/固绿染色)；
其中，A为正常小鼠关节腔注射PBS的膝关节组织学图片；B为DMM 4周后关节腔注射PBS的膝关节组织学图片；C、E、G为DMM 4周后关节腔注射ADSCs的膝关节组织学图片；D、F、H为DMM 4周后关节腔注射ADSCs的膝关节，且以上关节均为DMM 8周后取材，标尺为150μm；
图5为不同冷处理温度下的ADSCs注射到小鼠关节腔组的OARSI评分结果；其中，CTRL+PBS组与DMM+PBS组n＝6，其他组n＝8；**P＜0.01，***P＜0.001；
图6为不同冷处理时间下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔组的OARSI评分结果；
其中，CTRL+PBS组与DMM+PBS组n＝6，其他组n＝8；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
脂肪干细胞的获取和体外培养：
人来源的脂肪干细胞从临床标本中分离获得。具体获取方式为：于全麻状态下进行抽脂操作，将含有脂肪细胞的样品运送到实验室，洗涤后使用胶原酶进行人脂肪组织的消化，去除成熟脂肪细胞和残余脂肪组织，经洗涤离心后，获得的细胞属脂肪血管基质细胞，进一步培养扩增后，获得脂肪干细胞。
分离得到的脂肪干细胞用10％(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素-链霉素的改良Eagle培养基(DMEM)培养液重悬细胞并接种于培养皿上，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
P0脂肪干细胞每隔3天更换一次培养液。待细胞密度达80％～90％时，用0.05％浓度的胰蛋白酶消化传代，离心后收集细胞重悬，调整浓度接种于培养皿。P1后，每3天传一次代。
实施例2
1、采用现有技术和本申请的技术方案分别进行脂肪干细胞培养
用10％(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素-链霉素的改良Eagle培养基(DMEM)培养液重悬P3脂肪干细胞并接种于直径10cm的培养皿上，置于恒温培养箱中(型号为：Galaxy170R，Eppendorf)，设置温度为37℃，其中含5％(v/v)的CO2。每两天更换一次培养液。
现有技术中的脂肪干细胞培养方法，步骤包括：
S1:将P3脂肪干细胞置于恒温培养箱中(型号为：Galaxy 170R，Eppendorf)中，用高糖的DMEM培养基(含10％的胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)进行培养。处理方法为；在37℃下恒温培养7d。
S2:培养完成后，拍摄脂肪干细胞的细胞状态并纪录，实验结果记录为图1中的A。
本申请中的脂肪干细胞培养方法，步骤包括：
S1:将P3脂肪干细胞置于提供定期冷却/加热的培养箱(型号为：Instec，USA)中，用高糖的DMEM培养基(含10％的胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)进行培养。处理方法为：对各组分别设置不同的冷处理温度，并在37℃和冷处理温度两个温度点处对细胞进行周期性冷处理，每组均进行循环培养7d，具体操作为：冷处理温度下的单次冷处理时间为30min，37℃的单次处理时间为30min，各组的变化频率均为60次/min。
其中，本实施例中各组设置的冷处理温度分别为4℃、10℃、20℃。
S2：培养完成后，拍摄各组经过不同冷处理温度进行处理的脂肪干细胞的细胞状态并纪录，其中，20℃冷处理温度、10℃冷处理温度以及4℃冷处理温度下的实验结果分别记录为图1中的B、C、D。
2、结果分析
由附图1实验结果可知，37℃恒温培养的ADSCs体积较大，形态不均一，细胞纤长，有分叉触角，部分细胞集聚发生融合(图1A)。20℃条件下培养30min的ADSCs较疏离(图1B)。进行10℃冷处理后，ADSCs分布均匀，形态均一，无分叉触角，多呈梭形，细胞状态较图1A更佳(图1C)。ADSCs在4℃条件下培养30min后细胞密度明显减小，细胞状态较差(图1D)。因此，在相同处理时间下以10℃冷处理温度对ADSCs进行处理后细胞状态更佳，说明该周期性冷处理能够有效地改善细胞的生长状态。
实施例3
1、采用相同的冷处理温度、不同的单次冷处理时间对脂肪干细胞进行培养
S1：用10％(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素-链霉素的改良Eagle培养基(DMEM)培养液重悬P3脂肪干细胞并接种于直径10cm的培养皿上，置于恒温培养箱中(Galaxy 170R，Eppendorf)，设置温度为37℃，分别培养7d。培养完成后，拍摄脂肪干细胞的细胞状态并纪录，实验结果记录为图2中的A、C、E。
S2：用10％(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素-链霉素的改良Eagle培养基(DMEM)培养液重悬P3脂肪干细胞并接种于直径10cm的培养皿上，置于定期冷却/加热的培养箱(型号为：Instec，USA)设置，设置冷处理温度为10℃，并在10℃和37℃两个温度点下对脂肪干细胞进行周期性冷处理，共培养7d，每组分别设置不同的单次冷处理时间。
其中，本实施例中每组的单次冷处理时间分别设置为15min、30min以及60min，各组的变化频率对应为30次/min、60次/min以及120次/min。培养完成后，拍摄脂肪干细胞的细胞状态并纪录，实验结果记录依次为图2中的B、D、F。
2、结果分析
由附图2实验结果可知，与37℃恒温培养的7d的ADSCs(图2A)相比，于10℃下进行周期性冷处理且单次冷处理时间为15min的ADSCs细胞较疏散(图2B)。与37℃培养的7d的ADSCs细胞相比(图2C)，于10℃下进行周期性冷处理且单次冷处理时间为30min的ADSCs形态完整，生长状态良好(图2D)。于37℃条件下培养7d的ADSCs(图2E)相比，于10℃下单次冷处理60min的ADSCs，部分ADSCs有分叉触角，细胞状态变差(图2F)。其中，以10℃下进行周期性冷处理且单次冷处理时间为30min的细胞的生长状态最佳。
实施例4
采用实施例2和实施例3获得的脂肪干细胞进行动物实验，包括步骤：
S1：采用DMM方法建立小鼠骨关节炎模型
选用雄性C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，使用饲养10w后的C57小鼠通过1.5％戊巴比妥钠以45mg/kg浓度行腹腔注射麻醉，酒精棉球进行膝关节局部消毒。在小鼠膝关节内侧做纵向切口，沿髌韧带内侧打开关节腔。钝性分离髁间区的脂肪垫，找到连接内侧半月板的半月板胫骨韧带并横断。压迫止血后关闭切口。术毕均以6-0可吸收缝合线闭合手术切口，并用酒精棉球再次消毒，完成造模。在造模8周后，处死小鼠，分离出膝关节做组织学检测检查，记录组织学图片结果见图3并进行OARSI评分。
S2:实验处理
将实施例2以及实施例3中获得的各组脂肪干细胞培养液按照下述方法对步骤S1中造模成功的小鼠进行实验处理，处理方法为：将DMM造模8周后小鼠随机分为实验组和对照组，实验组小鼠关节腔注射脂肪干细胞(细胞数为1×105)，对照组关节腔注射PBS溶液。
具体操作为：麻醉小鼠后备皮消毒，取膝关节正中纵向皮肤切口，长约2mm，牵拉皮肤寻找膝关节髌韧带，应用微量注射器以髌韧带内缘中点为进针点，斜向后上方约1.5mm深度注射生理盐水或脂肪干细胞入关节腔，拔针后稍用力加压针眼处，最后缝合皮肤切口。
S3：组织学检查
对小鼠膝关节标本进行处理，处理方法具体为：将小鼠膝关节于4％多聚甲醛固定24h。后于摇床中采用10％EDTA脱钙10d，再进行石蜡包埋，在胫骨平台前中部做冠状位切片或胫骨平台内侧做矢状位切片，获得的切片做番红(Safranin-O)/固绿(fast green)染色。
S4：对获得不同处理小鼠的膝关节并进行组织学检查，记录组织学图片结果见图3和图4。
其中，附图3为不同冷处理温度下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔后的小鼠关节切片(番红/固绿染色)。与对照组相比(图3A)，DMM术后OA现象明显，内侧胫骨平台和股骨内髁关节软骨结构破坏更加严重(图3B)。37℃(图3C)及20℃(图3D)培养30min后的ADSCs注射到小鼠关节腔后效果相似，OA现象减少，软骨破坏程度至潮线，对软骨有一定的修复。相同时间下10℃冷处理后ADSCs注射到小鼠关节腔内产生更多软骨，OA现象显著减少(图3E)。4℃环境下培养30min的ADSCs注射到关节腔后，OA现象极其显著，软骨破坏严重，深达潮线以下。因此，相同冷处理时间下10℃冷处理后ADSCs注射到小鼠关节腔内后能够产生更多软骨。
附图4为不同温度冷处理下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔后的小鼠关节切片(番红/固绿染色)。图中，DMM 4周后关节腔注射PBS的膝关节胫骨平台出现Safranin O染色丢失(图4B)，软骨破坏严重，深达钙化层，引发了OA。10℃环境下冷处理15min后对关节软骨有一定修复作用，番红/固绿染色显示关节软骨表层破坏(图4D)。10℃环境下冷处理30min注射到小鼠关节腔内产生更多的软骨(图4F)，提示10℃环境下冷处理30min后增强ADSCs修复软骨潜力，对OA有较好的治疗效果。冷处理60分钟对软骨修复效果较差，染色结果显示软骨破坏严重，深至潮线(图4H)。
S5：对获得的组织学切片进行OARSI评分结果见表1和表2；
表1不同冷处理温度下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔组的OARSI评分
表2不同冷处理时间下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔组的OARSI评分
对上述原始数据进行统计学检验，采用的统计方法有单因素方差分析(One-WayANOVA)，方差齐性的独立样本T-检验(student s t test)，Mann-Whitney U test。使用统计软件为SPSS 11.0，P<0.05认为具有统计学差异。对表1数据和表2数据进行统计分析的结果见图5和图6。
其中，图5为不同冷处理温度下的ADSCs注射到小鼠关节腔组的OARSI评分结果；其统计结果显示DMM术后4周时内侧胫骨平台的评分显著增高。37℃及20℃评分相似，但是平均分值均比DMM组低。10℃冷处理后ADSCs注射到小鼠关节腔内评分显著降低，说明相同时间下10℃冷处理后ADSCs注射到小鼠关节腔内产生更多软骨，治疗OA效果明显。与DMM手术组相比，注射4℃环境下培养30min的ADSCs评分没有变化。
图6为不同冷处理时间下的脂肪干细胞注射到小鼠关节腔组的OARSI评分结果；其统计结果显示DMM术后4周时内侧胫骨平台的评分显著增高。37℃及10℃冷处理15min评分相似，但是平均分值均比10℃环境下冷处理30min组高。10℃冷处理30min后ADSCs注射到小鼠关节腔内显著降低了评分，说明相同温度下冷处理30min后ADSCs在小鼠关节腔内产生更多软骨，治疗OA效果明显。与DMM手术组相比，注射10℃环境下培养60min的ADSCs评分没有明显变化(图6)。
Claims (9)
1.一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：该脂肪细胞制剂中含有脂肪细胞，且该脂肪细胞是由脂肪干细胞经过周期性冷处理步骤后获得的。
2.如权利要求1所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述周期性冷处理是指通过设置一个冷处理温度，将脂肪干细胞在37℃和冷处理温度下进行循环培养。
3.如权利要求2所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述循环培养中在冷处理温度下的单次冷处理时间为15min-60min，37℃下的单次处理时间为15min-60min。
4.如权利要求2所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述冷处理温度为4℃-20℃。
5.如权利要求3所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述单次冷处理时间为30min，所述冷处理温度为10℃。
6.如权利要求2所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述脂肪干细胞选用P3脂肪干细胞。
7.如权利要求2所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述循环培养过程采用高糖的DMEM培养基对脂肪干细胞进行培养。
8.如权利要求2所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述循环培养时间为7d。
9.如权利要求1所述的一种治疗骨关节炎的脂肪细胞制剂，其特征在于：所述脂肪细胞制剂在治疗骨关节炎中的应用。
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