CN112662609A

CN112662609A - 一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基及应用方法

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Publication number: CN112662609A
Application number: CN202110104824.3A
Authority: CN
Inventors: 冯志彬; 张娟; 程仕伟; 黄清荣; 张建龙
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112662609B

Abstract

本发明公开了一种用于提高β‑丙氨酸产量的发酵培养基及应用方法，属于微生物发酵技术领域，所述的基础发酵培养基组分包括：葡萄糖、氯化铵、甘蔗糖蜜、KH2PO4、MgSO4、玉米浆、菌体水解液、生物素、DL‑蛋氨酸、L‑苏氨酸、烟酰胺、维生素B1、ZnSO₄、CoCl₂。以菌体水解液代替发酵培养基中有机氮源，循环自用，完全替代酵母浸粉和麸皮水解液，减少玉米浆的用量，有效降低了生产成本。发酵过程中采用好氧与厌氧结合模式，降低动力消耗的同时，大幅度提升糖酸转化率，本发明的发酵工艺β‑丙氨酸48h产酸产酸可达75.6g/L，糖酸转化率亦提升至66.2％。

Description

一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基及应用方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基及应用方法。

背景技术

β-丙氨酸是自然界中唯一存在β型氨基酸，作为一种重要的精细化工品和药物中间体,其用途广泛。工业上，是合成泛酸钙和肌肽的重要原料，也是合成聚β-氨基丙酸的前体物质；医药上，作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮，还是复方氨基酸的一种重要成分；同时还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。由于β-丙氨酸及其衍生物在医药、美容、食品、饲料及化工等领域的广泛应用，市场需求量呈日渐上升趋势。

目前工业上主要通过化学方法生产β-丙氨酸，如丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法、β-氨基丙腈法等，存在成本高、工艺条件苛刻、副产物较多及生产环境不友好等缺点。生物转化法是以L-天冬氨酸为生产原料，利用微生物细胞胞内的L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate α-decarboxylase)催化L-天冬氨酸脱α位羧基生产β-丙氨酸。酶活不高，且酶需要多次反复投放，操作较为复杂。由葡萄糖开始发酵生产β-丙氨酸被认为是最有前景的替代方法。然而关于发酵生产β-丙氨酸的研究偏少，且发酵浓度偏低，糖酸转化率亦不高，限制了发酵法生产β-丙氨酸技术在工业中的应用和推广。目前β-丙氨酸发酵培养基中添加的有机氮源如酵母浸粉进一步增加了β-丙氨酸的生产成本，因此，稳定生产水平的前提下，降低有机氮源的使用量，并提高β-丙氨酸的发酵浓度及转化率，是实现发酵法工业生产β-丙氨酸的关键所在。

发明内容

本发明的目的针对目前发酵法生产β-丙氨酸发酵浓度及转化率不高的问题，提供一种添加水解菌体液替代部分有机氮源的发酵培养基及用于β-丙氨酸的发酵方法、实现低成本高效制造β-丙氨酸。

本发明实现发明目的的技术方案为：

一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基，所述发酵培养基的组分包括：

葡萄糖、氯化铵、甘蔗糖蜜、KH₂PO₄、MgSO₄、酵母浸粉、麸皮水解液、玉米浆、菌体水解液、生物素、DL-蛋氨酸、L-苏氨酸、烟酰胺、维生素B₁、ZnSO₄和CoCl₂。

进一步的，所述发酵培养基组分的终浓度为：葡萄糖30-80g/L、氯化铵5-10g/L、甘蔗糖蜜5-20g/L、KH₂PO₄1-5 g/L、MgSO₄ 1-3g/L、酵母浸粉0-10g/L、麸皮水解液0-10g/L、玉米浆0-10g/L、菌体水解液0-20g/L、生物素50-200μg/L、DL-蛋氨酸0.1-2g/L、L-苏氨酸0.1-2g/L、烟酰胺1-10mg/L、维生素B₁1-10mg/L、ZnSO₄1-10mg/L和CoCl₂ 1-10mg/L。

进一步的，所述的菌体水解液的制作方法为：收集大肠埃希氏菌ZF009，80℃烘干至恒重，按100g/L的浓度配制菌悬液，并用NaOH调节pH至10.0，在120℃条件下水解5h，大肠埃希氏菌ZF009于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏号为CGMCC NO：17830。(大肠埃希氏菌ZF009首次公开的日期2019年9月24，专利号2019104747539，专利名称为β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途)。

利用上述发酵培养基生产β-丙氨酸的应用方法，所述应用方法包括如下步骤：

1)种子培养：无菌水洗涤大肠杆菌工程菌斜面，接入装有种子培养基的自控发酵罐，分别控制培养温度为37℃，pH值7.0，维持溶氧为18-22％，培养10-16h；

2)发酵培养：按体积比5-10％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有上述发酵培养基的自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，维持溶氧在18-22％，待菌体光密度值OD₆₀₀达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，控制pH在7.0；待初加入的葡萄糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L，发酵40-56h。

进一步的，所述的大肠杆菌工程菌为大肠埃希氏菌ZF009，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO：17830，保藏日期为2019年5月20日。

进一步的，所述的种子培养基组分及终浓度为：葡萄糖20-30g/L、硫酸铵3-10g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉15g/L、KH₂PO₄ 3-6g/L、MgSO₄ 1-2g/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-异亮氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L和L-赖氨酸0.1g/L。

进一步的，pH调节剂为：25％氨水和10％碳酸铵按体积比1:1混合，其中10％碳酸铵溶液通过0.2μm滤膜过滤除菌。

本发明与现有技术相比的有益效果：

根据β-丙氨酸代谢特点优选发酵培养基组分，收集利用大肠埃希氏菌ZF009生产β-丙氨酸之后的发酵液，离心后获得大肠埃希氏菌ZF009菌体，以大肠埃希氏菌ZF009菌体水解液代替发酵培养基中有机氮源，循环自用，完全替代酵母浸粉和麸皮水解液，减少玉米浆的用量，有效降低了生产成本。发酵过程中采用好氧与厌氧结合模式，降低动力消耗的同时，大幅度提升糖酸转化率，本发明的发酵工艺β-丙氨酸48h产酸产酸可达75.6g/L，糖酸转化率亦提升至66.2％。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

麸皮水解液和玉米浆购买于山东阳成生物科技有限公司。

菌体水解液的制作方法为：所述的菌体水解液的制作方法为：收集大肠埃希氏菌ZF009，80℃烘干至恒重，按100g/L的浓度配制菌悬液，并用NaOH调节pH至10.0，在120℃条件下水解5h，大肠埃希氏菌ZF009于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏号为CGMCC NO：17830。(大肠埃希氏菌ZF009首次公开的日期2019年9月24，专利号2019104747539，专利名称为β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途)。

其它试剂均为市售商品。

实施例1

1)种子培养：无菌水洗涤大肠埃希氏菌ZF009斜面，接入装有3L种子培养基的5L自控发酵罐，分别控制培养温度为37℃，pH值为7.0，维持溶氧为20％左右，培养10h。

2)发酵培养：按5％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，通过调节通气量、转速和罐压全程维持溶氧在20％左右，利用pH调节剂控制pH在7.0；待初糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L左右，42h结束发酵，β-丙氨酸浓度为48.3g/L，糖酸转化率40.7％。其中发酵培养基为：葡萄糖80g/L，甘蔗糖蜜10g/L、氯化铵5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1g/L、酵母浸粉10g/L、麸皮水解液10g/L、玉米浆10g/L、生物素50μg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L、烟酰胺5mg/L、维生素B₁ 5mg/L、ZnSO₄ 1mg/L、CoCl₂ 1mg/L。

实施例2

1)种子培养：无菌水洗涤大肠埃希氏菌ZF009斜面，接入装有3L种子培养基的5L自控发酵罐，分别控制培养温度和pH为37℃和7.0，维持溶氧为20％左右，培养10h。

2)发酵培养：按5％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，通过调节通气量、转速和罐压维持溶氧在20％左右，待菌体光密度值OD₆₀₀达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，利用pH调节剂控制pH在7.0；待初糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L左右，42h结束发酵，β-丙氨酸浓度为54.3g/L，糖酸转化率62.5％。其中发酵培养基为：葡萄糖80g/L，甘蔗糖蜜10g/L、氯化铵5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1g/L、酵母浸粉10g/L、麸皮水解液10g/L、玉米浆10g/L、生物素50μg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L、烟酰胺5mg/L、维生素B₁ 5mg/L、ZnSO₄ 1mg/L、CoCl₂ 1mg/L。

实施例3

2)发酵培养：按5％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，通过调节通气量、转速和罐压维持溶氧在20％左右，待菌体光密度值OD₆₀₀达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，利用pH调节剂控制pH在7.0；待初糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L左右，42h结束发酵，β-丙氨酸浓度为68.6g/L，糖酸转化率64.3％。其中发酵培养基为：葡萄糖80g/L，甘蔗糖蜜10g/L、氯化铵5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1g/L、菌体水解液15g/L、玉米浆3g/L、生物素50μg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L、烟酰胺5mg/L、维生素B₁ 5mg/L、ZnSO₄ 1mg/L、CoCl₂ 1mg/L。

实施例4

2)发酵培养：按5％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，通过调节通气量、转速和罐压维持溶氧在20％左右，待菌体光密度值OD₆₀₀达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，利用pH调节剂控制pH在7.0；待初糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L左右，42h结束发酵，β-丙氨酸浓度为75.6g/L，糖酸转化率66.2％。其中发酵培养基为：葡萄糖80g/L，甘蔗糖蜜10g/L、氯化铵10g/L、KH₂PO₄ 3g/L、MgSO₄ 1g/L、菌体水解液20g/L、玉米浆3g/L、生物素100μg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L、烟酰胺5mg/L、维生素B₁ 5mg/L、ZnSO₄ 2mg/L、CoCl₂ 2mg/L。

Claims

1.一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基的组分包括葡萄糖、氯化铵、甘蔗糖蜜、KH₂PO₄、MgSO₄、酵母浸粉、麸皮水解液、玉米浆、菌体水解液、生物素、DL-蛋氨酸、L-苏氨酸、烟酰胺、维生素B₁、ZnSO₄和CoCl₂。

2.根据权利要求1所述的一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基组分的终浓度为：葡萄糖30-80g/L、氯化铵5-10g/L、甘蔗糖蜜5-20g/L、KH₂PO₄1-5g/L、MgSO₄ 1-3g/L、酵母浸粉0-10g/L、麸皮水解液0-10g/L、玉米浆0-10g/L、菌体水解液0-20g/L、生物素50-200μg/L、DL-蛋氨酸0.1-2g/L、L-苏氨酸0.1-2g/L、烟酰胺1-10mg/L、维生素B₁1-10mg/L、ZnSO₄1-10mg/L和CoCl₂ 1-10mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基，其特征在于所述的菌体水解液的制作方法为：收集大肠埃希氏菌ZF009，80℃烘干至恒重，按100g/L的浓度配制菌悬液，并用NaOH调节pH至10.0，在120℃条件下水解5h，大肠埃希氏菌ZF009于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏号为CGMCC NO：17830。

4.利用权利要求1-3任何一项所述发酵培养基生产β-丙氨酸的应用方法，其特征在于所述应用方法包括如下步骤：

1)种子培养：无菌水洗涤大肠埃希氏菌ZF009斜面，接入装有种子培养基的自控发酵罐，分别控制培养温度为37℃，pH值7.0，维持溶氧为18-22％，培养10-16h；

2)发酵培养：按体积比5-10％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有上述发酵培养基的自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，调节pH为7.0，维持溶氧在18-22％，待菌体光密度值OD₆₀₀达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，控制pH在7.0；待初加入的葡萄糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L，发酵40-56h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的种子培养基组分及终浓度为：葡萄糖20-30g/L、硫酸铵3-10g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉15g/L、KH₂PO₄ 3-6g/L、MgSO₄ 1-2g/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-异亮氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L和L-赖氨酸0.1g/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)中调节pH的调节剂为体积比25％氨水和体积比10％碳酸铵按体积比1:1混合，其中体积比10％碳酸铵溶液通过0.2μm滤膜过滤除菌。