CN112661904A - 一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法，属于分析化学领域。所述制备方法包括以下步骤：首先将磷脂酸通过席夫碱反应共价结合到载体表面；然后将该磷脂酸修饰的载体与荧光功能单体、交联剂和引发剂分散到溶剂中，在搅拌或者摇晃的条件下加热引发聚合反应；其次通过静置方式，去除上层溶液，并用氯仿溶剂洗涤载体材料；最后通过超声用氯仿溶液将分子印迹荧光纳米粒子从载体表面洗脱，获得磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子。本发明采用共价键固载模板的策略制备磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子，不仅制备简单，操作方便，而且能够避免模板分子残留在分子印迹聚合物中，能够显著提高分子印迹荧光纳米粒子的特异性识别能力。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法。
背景技术
分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer, MIP），是一种具有特殊分子识别能力的高分子聚合物，其选择性识别能力的形成原理是：先将模板分子与功能单体通过共价键或非共价作用形成复合物，随后加入交联剂和引发剂获得分子印迹预聚液；然后，引发聚合反应获得含有模板分子的高分子聚合物；最后，移除聚合物中的模板分子，从而在聚合物中会留下与模板分子形状互补的印迹空腔，该空腔中还保留有功能单体的作用官能团，因此该印迹空腔对模板分子具有选择性识别能力。由于分子印迹聚合物制备简单、成本低、稳定性高、使用寿命长、可大规模生产，在分离科学、生物传感、药物递送、模拟酶催化等领域已经展现出重要的应用价值 [L. Ye, K. Haupt, Anal. Bioanal. Chem. 378(2004) 1887; L.X. Chen, X.Y. Wang, W.H. Lu, X.Q. Wu, J.H. Li, Chem. Soc. Rev.45 (2016) 2137; J.M. Pan, W. Chen, Y. Ma, G.Q. Pan, Chem. Soc. Rev. 47 (2018)5574]。
磷脂酸是一种重要的生物分子，细胞膜的重要组成成分，可以作为脂类的合成前体，特别是鞘磷脂，其经过酶解可产生不同的脂类信号分子，参与细胞的凋亡和分化增殖，调节免疫系统和炎症等等生命活动过程。目前，磷脂酸类分子的检测分析主要依赖于大型仪器比如液相色谱-质谱，价格昂贵，需要专业人员操作和维护保养，分析成本高；基于抗体等生物分子建立起来的酶联免疫和传感器分析方法的成本也高，而且稳定性和重现性差，导致该类分析方法的准确度低。因此，发展低成本的能够特异性识别磷脂酸的分析方法具有重要的研究价值和意义。
由于磷脂酸分子是一种两亲性大分子，制备特异性高的分子印迹材料具有较高的挑战性，目前关于制备磷脂酸分子印迹聚合物仅有数篇文献报道。例如，Sellergren 课题组在2014年采用整体分子印迹技术制备了能够识别磷脂酸分子的分子识别材料，用于富集磷脂酸分子，但是缺乏特异性，而且需要和液相色谱-质谱联用才能完成目标磷脂酸分子的分析[Pradeep Narayanaswamy, et al., Anal. Chem. 2014, 86, 3043−3047]。后来，该课题组以含有脲基或双咪唑基的可聚合分子为功能单体，采用整体印迹方法制备了脂质A分子印迹聚合物，用于选择性去除含有脂质A分子的内毒素[Robert Sulc, et al., Sci.Rep. 2017, 7, 44299]；还以2-甲基丙烯酸2-[3-(7-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-4-基)-脲基]-乙酯（NBD）为荧光功能单体，采用可控自由基印迹方法制备了核壳结构的荧光分子印迹纳米粒子，用于鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的荧光分析，但是这些分子印迹技术均存在模板分子洗脱困难和利用率低等问题，导致制备成本高 [Qianjin Li, et al., Sci. Rep.2020, 10, 9924]。
发明内容
解决的技术问题：针对目前分子印迹技术中模板利用率低和难以洗脱、现有技术中磷脂酸分子印迹聚合物缺乏特异性等技术问题，本发明提供一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法，所述方法能够解决传统方法中模板分子会残留在分子印迹聚合物中的问题，显著提高分子印迹荧光纳米粒子的特异性；另外，本发明通过使用合适的溶剂，可以采用静置方式分离产物和副产物，避免了使用离心机，操作更加简单。
技术方案：一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一.将磷脂酸通过席夫碱反应共价结合到载体表面得到磷脂酸功能化材料，所述磷脂酸为含有氨基官能团的磷脂酸，所述载体为含有醛基官能团的材料，该醛基能够和目标磷脂酸中的氨基官能团形成席夫碱共价键；
步骤二.将磷脂酸功能化材料与荧光功能单体、交联剂和引发剂分散到溶剂中，在搅拌或者摇晃的条件下加热引发聚合反应；
步骤三.通过静置方式，去除上层溶液，并用氯仿溶剂洗涤载体材料；
步骤四.通过超声，用氯仿溶剂将分子印迹荧光纳米粒子从载体表面洗脱，获得磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子。
作为优选，所述含有氨基官能团的磷脂酸为芬戈莫德磷脂酸或鞘磷脂酸类分子。
作为优选，所述载体为醛基修饰二氧化硅纳米粒子。
作为优选，所述步骤一中磷脂酸通过席夫碱反应共价结合到载体表面是通过磷脂酸与载体在磷酸盐缓冲液中室温搅拌反应，经过洗涤后获得。
作为优选，所述磷脂酸与载体在磷酸盐缓冲液中室温搅拌反应24 h，磷脂酸和载体的比值为0.075 mmol：0.25 g。
作为优选，所述步骤二中荧光功能单体为1,8-蒽-双(3-乙烯基-1H-咪唑)二溴化物，交联剂为乙二醇二(甲基丙烯酸酯)，引发剂为偶氮二异庚腈，溶剂为体积比为(1~50)：50的甲醇和氯仿混合液，荧光功能单体和交联剂的摩尔比为(0.1~1)：6，交联剂与溶剂的体积比为1：(100~200)，引发剂的浓度为0.4~0.6 mg/mL，磷脂酸载体浓度为5 mg/mL，加热的温度为50 ℃，时间为12 h。
作为优选，所述步骤三中的静置方式具体如下：在室温下，将反应体系静置1~3 h，使固体载体材料与液体溶液分离，从而去除上清溶液。
作为优选，所述步骤四中的超声指将载体材料置于氯仿溶剂中，放于超声波中，从而将磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子从载体材料表面洗脱下来，超声频率40 kHz，超声时间10分钟。
上述的方法制备的磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子。
有益效果：1. 与现有的整体印迹技术和可控自由基印迹技术相比，本发明首次采用固载模板分子的印迹策略制备磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子，能够避免模板分子在分子印迹聚合物中的残留，提高分子印迹效率，从而获得高特异性的磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子。
2. 与将模板分子溶于预聚液的常规分子印迹方法相比，本发明中的模板分子磷脂酸是通过共价键修饰到固载材料上，在聚合反应完成和洗脱分子印迹聚合物后，该修饰有模板分子的固载材料能够回收重复使用，节省成本。
3. 在共价修饰的模板材料上，模板分子的一端和材料相连，朝向材料表面；另一端会伸展到溶液中，背向材料表面，因此模板分子在预聚液中会展现出方向一致性；当进行分子印迹聚合反应时，有利于在分子印迹材料表面形成高度一致性的印迹空腔，从而提高分子印迹材料的选择性和特异性。
4. 由于分子印迹纳米粒子在聚合反应溶剂中分散性较好，且稳定存在，所以需要采用离心或透析的方式进行洗涤，去除未反应物和副产物。本发明所用固载材料即二氧化硅能够依靠自身密度较大的性质在氯仿中沉淀，而未反应物和副产物仍然溶解在氯仿中，因此可以采用静置方式，去除未反应物和副产物，无需离心设备或透析，操作简单，节省纯化处理成本。
5. 本发明采用可聚合的含有咪唑基团的荧光功能单体，能够一步合成具有高特异性的磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子，不仅可用于目标磷脂酸的选择性萃取和分离，而且能够用于构建目标磷脂酸的荧光检测分析方法。
附图说明
图1为实施例1中醛基修饰二氧化硅纳米粒子的合成路线示意图；
图2为实施例2中磷脂酸模板分子（芬戈莫德磷脂酸，FP）功能化材料的制备路线示意图；
图3为实施例3制备的磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法示意图；
图4为二氧化硅纳米粒子（SN），氨基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-NH2），醛基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-CHO）和芬戈莫德磷脂酸功能化二氧化硅纳米粒子（SN-FP）的动态光散射（DLS）粒径分布图，溶剂为甲醇；
图5为芬戈莫德磷脂酸（FP），氨基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-NH2），醛基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-CHO），芬戈莫德磷脂酸功能化二氧化硅纳米粒子（SN-FP）和芬戈莫德磷脂酸二（四丁基铵）盐功能化二氧化硅纳米粒子（SN-FP(2TBA)）的红外光谱图；
图6为磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）及其对照聚合物（poly(IMID-EGDMA)-NIP）的动态光散射（DLS）粒径分布图，溶剂为氯仿；
图7为磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）及其对照聚合物（poly(IMID-EGDMA)-NIP）对测试分子（FP(TBA)）的荧光响应变化图，测试分子浓度50 μM，纳米粒子浓度0.2 mg/mL，溶剂为氯仿；
图8为磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）对不同磷脂酸分子（FP(TBA)：芬戈莫德磷脂酸（单四丁基铵）盐；FP(2TBA)：芬戈莫德磷脂酸双（四丁基铵）盐；DPPA(Na)：二棕榈酰磷脂酸单钠盐；DMPS：二肉豆蔻酰基丝氨酸；POPE：1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺；POPC：1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂；DLPC：二月桂酰基卵磷脂；DMPC：二肉豆蔻酰基卵磷脂；DOPS：二油酰基磷脂酰丝氨酸）在不同浓度（1，2，5，10，20，30，40，50，80和100 μM，其中FP(TBA)测试浓度还包括60和70 μM）条件下的荧光响应变化图。
图9为对比例1制备的磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法示意图；
图10为磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子poly(IMID-EGDMA)-MIP和poly(NBD-EGDMA)-MIP及其对照聚合物poly(IMID-EGDMA)-NIP和poly(NBD-EGDMA)-NIP对测试分子（FP(TBA)）的荧光响应变化图，测试分子浓度50 μM，纳米粒子浓度0.2 mg/mL，溶剂为氯仿。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
制备醛基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-CHO），参见图1，具体步骤如下：
步骤1：首先，将氨水溶液（25 wt.%，30.4 mL）、乙醇（200 mL）和水（306 mL）混合在1 L圆底烧瓶中并以600 rpm的速度搅拌；随后，加入正硅酸乙酯（45.6 mL）和乙醇（456 mL）的混合液，室温下搅拌反应8小时；最后，通过离心（10000 rpm，10 min）收集二氧化硅纳米粒子，并用乙醇洗涤至少三次，在室温下真空干燥24 h，获得二氧化硅纳米粒子（SN），产率37%。
步骤2：在500 mL的三口圆底烧瓶中通过磁力搅拌将SN（14 g）分散到无水甲苯（280 mL）中；然后，在氮气保护下添加3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，2.37 g，10.7 mmol），并且在油浴温度130 ℃下回流12 h；反应完成后，将混合物体系冷却到室温，通过离心（10000 rpm，10 min）收集纳米粒子并用甲醇洗涤至少三次；最后，将纳米粒子在室温下真空干燥24 h，获得氨基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-NH2），产率92%。
步骤3：通过磁力搅拌，在50 mL的圆底烧瓶中将SN-NH2（10 g）分散到30 mL磷酸盐缓冲液（10 mM，pH 7.4）中；然后，加入戊二醛（50 wt.%，2.5 mL），在室温下搅拌反应24小时；反应完成后，通过离心（10000 rpm，10 min）收集纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液、纯水和甲醇分别洗涤三次；最后，将纳米粒子在室温下真空干燥24 h，获得醛基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-CHO），产率97%。
实施例2
制备芬戈莫德磷脂酸双(四丁基铵)盐功能化的二氧化硅纳米粒子（命名为SN-FP(2TBA)），参见图2，具体制备过程如下：
在磁力搅拌下，将模板分子芬戈莫德磷脂酸（FP）（29 mg，0.075 mol）加入到SN-CHO（0.25 g）的2 mL磷酸盐（10 mM，pH 7.4）分散液中，室温反应24 h后，离心（10000 rpm，10 min）收集纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液、纯水和甲醇分别洗涤三次，然后将纳米粒子在室温下真空干燥，即获得FP修饰二氧化硅纳米粒子（SN-FP）。随后将0.25 g SN-FP分散在甲醇（2mL）中，加入氢氧化四丁基铵（TBA-OH，0.3 mmol），室温搅拌反应12 h，然后用甲醇洗涤三次，室温真空干燥后可获得模板分子修饰材料即SN-FP(2TBA)。
实施例3
制备芬戈莫德磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）及其对照聚合物（poly(IMID-EGDMA)-NIP）。
制备芬戈莫德磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP），如图3所示，具体制备过程如下：
（1）将SN-FP(2TBA)（50 mg）、荧光功能单体1,8-蒽-双(3-乙烯基-1H-咪唑)二溴化物（IMID）（5.7mg、10.3μmol）、交联剂乙二醇二(甲基丙烯酸酯)（EGDMA）（65μL、344μmol）和引发剂偶氮二异庚腈（ABDV）（5 mg，20.1μmol）溶于10 mL氯仿和0.2 mL甲醇混合液中。
所述荧光功能单体1,8-蒽-双(3-乙烯基-1H-咪唑)二溴化物（IMID）的合成方法如下：首先将1,8-二溴蒽（1.09 g，2.0 mmol）溶于25 mL乙腈，然后加入N-乙烯基咪唑（0.38g，4.0 mmol），同时加入0.2 g单质硫，氮气保护下回流反应12 h。反应完毕后，冷却至室温，滤除硫单质，旋转蒸发除去溶剂。将所得固体物溶于乙醇，然后用乙醚沉淀获得白色固体物，常温真空干燥后获得最终产物IMID 0.47 g，产率32%。
（2）超声5 min后，用氮气吹扫10 min，然后在50℃温度条件下反应12 h。反应后，冷却至室温，静置1 h，去除上层液体。
（3）收集poly(IMID-EGDMA)-MIP的步骤如下：加入1 mL 氯仿，超声5 min，室温下静置1h，然后收集氯仿溶液；重复上述步骤3次，合并收集到的氯仿溶液。将氯仿溶液蒸发后，即可获得poly(IMID-EGDMA)-MIP，产量12 mg。
制备对照聚合物（poly(IMID-EGDMA)-NIP），具体方法如下：在相同的实验条件下，用SN代替SN-FP(2TBA)，进行上述聚合反应，可获得对照聚合物（poly(IMID-EGDMA)-NIP），产量24 mg。
实施例4
通过动态散射光粒径分析和红外光谱分析确证磷脂酸模板分子成功固载到载体材料表面。
如图4所示，实施例1和实施例2中制备的二氧化硅纳米粒子（SN），氨基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-NH2），醛基修饰二氧化硅纳米粒子（SN-CHO）和芬戈莫德磷脂酸功能化二氧化硅纳米粒子（SN-FP）的平均粒径分别为272 nm，306 nm，981 nm和1623 nm，证明FP功能化载体材料制备成功。另外，如图5所示，与SN-NH2和SN-CHO的红外光谱图相比，SN-FP和SN-FP(2TBA)上出现新的吸收峰1780 cm-1，1355 cm-1，940 cm-1和857 cm-1，进一步证实FP成功固载到载体材料表面。
实施例5
如图6所示，通过动态散射光粒径分析表明芬戈莫德磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）及其对照聚合物（poly(IMID-EGDMA)-NIP）均是纳米粒子，平均粒径分别为32 nm和344 nm；而且poly(IMID-EGDMA)-MIP具有更窄的尺寸分布。
实施例6
芬戈莫德磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）的选择性评价。
分别制备0.2 mg/mL的poly(IMID-EGDMA)-MIP及其对比荧光纳米粒子poly(IMID-EGDMA)-NIP的氯仿分散液，采用激发波长371 nm激发该分散液，获得其在发射波长408 nm处的荧光强度信号，记为F0；然后加入50 μM的测试分子FP(TBA)，轻轻摇动反应5 min，采用激发波长371 nm再次激发该分散液，获得其在发射波长408 nm处的荧光强度信号，记为F；计算获得荧光响应变化值（（F0-F)/F0）。如图7所示，poly(IMID-EGDMA)-MIP的荧光响应变化值显著高于其对比荧光纳米粒子的荧光响应变化值，二者的比值即为印迹因子（IF），结果高达9.4，表明poly(IMID-EGDMA)-MIP具有高选择性。
实施例7
芬戈莫德磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子（poly(IMID-EGDMA)-MIP）的特异性评价。
制备0.2 mg/mL的poly(IMID-EGDMA)-MIP的氯仿分散液，采用激发波长371 nm激发该分散液，获得其在发射波长408 nm处的荧光强度信号，记为F0；然后加入不同浓度（1，2，5，10，20，30，40，50，80和100 μM，其中FP(TBA)测试浓度还包括60和70 μM）的测试分子，轻轻摇动反应5 min，采用激发波长371 nm再次激发该分散液，获得其在发射波长408 nm处的荧光强度信号，记为F；计算获得不同测试分子在不同浓度条件下的荧光响应变化值（（F0-F)/F0）。如图8所示，poly(IMID-EGDMA)-MIP对FP(TBA)和FP(2TBA)的荧光响应变化值显著高于其对其他测试分子的荧光响应变化值，表明poly(IMID-EGDMA)-MIP具有高特异性。
对比例1
如图9所示，按照实施例3中的制备方法和条件，将荧光功能单体是1,8-蒽-双(3-乙烯基-1H-咪唑)二溴化物（IMID）（5.7 mg、10.3 μmol）换为2-甲基丙烯酸2-[3-(7-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-4-基)-脲基]-乙酯（NBD）（3.5 mg、10.3 μmol），其他一切保持不变。最终能够制备获得poly(NBD-EGDMA)-MIP和poly(NBD-EGDMA)-NIP。
对比例2
按照实施例6中的评价方法对对比例1中制备的poly(NBD-EGDMA)-MIP进行选择性评价，具体实验过程如下：
分别制备0.2 mg/mL的poly(NBD-EGDMA)-MIP及其对比荧光纳米粒子poly(NBD-EGDMA)-NIP的氯仿分散液，采用激发波长440 nm激发该分散液，获得其在发射波长500 nm处的荧光强度信号，记为F0；然后加入50 μM的测试分子FP(TBA)，轻轻摇动反应5 min，采用激发波长440 nm再次激发该分散液，获得其在发射波长500 nm处的荧光强度信号，记为F；计算获得荧光响应变化值（（F0-F)/F0）。如图10所示，poly(NBD-EGDMA)-MIP的荧光响应变化值仅仅略高于其对比荧光纳米粒子的荧光响应变化值，二者的比值即为印迹因子（IF），结果为1.1，表明poly(NBD-EGDMA)-MIP几乎没有选择性。
Claims (9)
1.一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一.将磷脂酸通过席夫碱反应共价结合到载体表面得到磷脂酸功能化材料，所述磷脂酸为含有氨基官能团的磷脂酸，所述载体为含有醛基官能团的材料；
步骤二.将磷脂酸功能化材料与荧光功能单体、交联剂和引发剂分散到溶剂中，在搅拌或者摇晃的条件下加热引发聚合反应；
步骤三.通过静置方式，去除上层溶液，并用氯仿溶剂洗涤载体材料；
步骤四.通过超声，用氯仿溶剂将分子印迹荧光纳米粒子从载体表面洗脱，获得磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述含有氨基官能团的磷脂酸为芬戈莫德磷脂酸或鞘磷脂酸类分子。
3.根据权利要求1所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述载体为醛基修饰二氧化硅纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤一中磷脂酸通过席夫碱反应共价结合到载体表面是通过磷脂酸与载体在磷酸盐缓冲液中室温搅拌反应，经过洗涤后获得。
5.根据权利要求4所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述磷脂酸与载体在磷酸盐缓冲液中室温搅拌反应24 h，磷脂酸和载体的比值为0.075mmol：0.25 g。
6.根据权利要求1所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤二中荧光功能单体为1,8-蒽-双(3-乙烯基-1H-咪唑)二溴化物，交联剂为乙二醇二(甲基丙烯酸酯)，引发剂为偶氮二异庚腈，溶剂为体积比为(1~50)：50的甲醇和氯仿混合液，荧光功能单体和交联剂的摩尔比为(0.1~1)：6，交联剂与溶剂的体积比为1：(100~200)，引发剂的浓度为0.4~0.6 mg/mL，磷脂酸载体浓度为5 mg/mL，加热的温度为50 ℃，时间为12 h。
7.根据权利要求1所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的静置方式具体如下：在室温下，将反应体系静置1~3 h。
8.根据权利要求1所述的一种磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的超声指将载体材料置于氯仿溶剂中，放于超声波中，超声频率40 kHz，超声时间10分钟。
9.权利要求1~8中任一所述的方法制备的磷脂酸分子印迹荧光纳米粒子。
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