CN112656790B

CN112656790B - 谷氨酰胺酶抑制剂bptes在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用

Info

Publication number: CN112656790B
Application number: CN202110110893.5A
Authority: CN
Inventors: 李明清; 杨少良; 赖真真; 彭海燕
Original assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Current assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN112656790A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用，本发明分别进行了体外实验和体内动物试验，体外实验结果显示，谷氨酰胺能促进异位内膜的增殖活力，而BPTES能明显抑制这一作用；动物实验显示，腹腔注射BPTES可以明显下调内异症小鼠的异位灶数量和重量。提示BPTES进一步可用于制备治疗内异症的药物，为内异症这类患者提供了新的治疗方法和思路。

Description

谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用。

背景技术

现有技术公开了子宫内膜异位症(简称内异症，Endometriosis，EMs)是一种常见的妇科疾病，是具有生长功能的子宫内膜种植于宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的位置，经雌孕激素的刺激发生周期性的出血，伴随纤维组织增生，并形成包裹的异位病灶。内异症一方面影响女性的正常月经，导致逐渐加重的痛经，还可能因为影响了盆腔局部的微环境而导致不孕，严重影响女性的生殖健康和心理状态。

子宫内膜异位症虽然是一种良性疾病，但是异位的子宫内膜却表现出类似肿瘤细胞的高增殖、高侵袭、抗凋亡能力。而快速的增殖和显著的侵袭能力，必然需要大量的能量供应。谷氨酰胺是细胞最为重要的能量来源之一，除了可以经谷氨酸，α-酮戊二酸进入三羧酸循环产生大量ATP外，还能提供5个碳原子的骨架，合成细胞扩增所需要的的嘌呤、嘧啶、NADPH、谷胱甘肽等重要代谢产物。多项研究均发现，肿瘤细胞具有高度活化的谷氨酰胺摄取和代谢能力，大量攫取周围组织中的谷氨酰胺供自身利用，形成谷氨酰胺成瘾。谷氨酰胺的代谢能力，与肿瘤细胞的增殖、凋亡和耐药等行为密切相关。抑制谷氨酰胺的代谢，可以显著抑制肿瘤细胞的生长。而在子宫内膜异位症患者中，异位子宫内膜的谷氨酰胺代谢情况目前仍未见研究。

在本项研究中我们发现，与正常内膜基质细胞相比，异位的子宫内膜细胞谷氨酰胺代谢酶也更为活跃。代谢物质谱分析发现谷氨酰胺下游代谢物在异位内膜细胞中明显富集。与不含谷氨酰胺的培养条件相比，一定浓度的谷氨酰胺可以明显促进异位内膜细胞的增殖，抑制其凋亡。体内实验也证实谷氨酰胺酶抑制剂BPTES处理后的子宫内膜，在小鼠体内生长明显较对照组减慢，病灶数量降低。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟通过实验研究评估谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在治疗内异症中的潜在价值，提供BPTES用于制备治疗内异症药物中的用途，为内异症的临床治疗提供新方法和新思路。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供BPTES的药用用途，具体涉及BPTES用于制备治疗内异症药物的用途。

本发明中通过评估BPTES在体外实验和EMS动物模型中的抗EMS内膜ESC生长活性；提供了一种BPTES用于制备治疗内异症的药物中的用途。

本发明进行了体外实验和体内动物试验，体外实验结果显示，谷氨酰胺能促进异位内膜的增殖活力，而BPTES能明显抑制这一作用；动物实验显示，腹腔注射BPTES可以明显下调内异症小鼠的异位灶数量和重量。提示BPTES进一步可用于制备治疗内异症的药物。

具体的，本发明公开了一种通过BPTES的生物学作用，发挥抗内异症内膜ESC生长的作用，可用于制备治疗内异症的药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

收集正常内膜组织和内异症患者异位病灶包埋切片后进行免疫组织化学染色，结果显示与正常内膜相比，异位灶表达更高水平的谷氨酰胺酶GLS(图1，GLS抗体购自于abcam公司)。收集正常内膜12份，异位灶9份，进行代谢物质谱检测，结果显示谷氨酰胺下游代谢物谷氨酸，酮戊二酸，延胡索酸，苹果酸，柠檬酸等的水平均在异位灶中明显富集(如图2所示)。与不添加谷氨酰胺的培养条件相比，一定浓度的谷氨酰胺可以明显促进异位内膜细胞的增殖，而添加谷氨酰胺酶抑制剂GLS之后可以抑制谷氨酰胺促进异位内膜增殖的作用(如图3所示)。与不添加谷氨酰胺的培养条件相比，谷氨酰胺可以抑制异位内膜细胞的凋亡(如图4所示)。进一步，本发明获取对照小鼠和BPTES处理小鼠的子宫，分别种植于受体鼠腹腔，构建特异性抑制内膜谷氨酰胺代谢的内异症模型，结果显示BPTES处理组小鼠异位灶数量和重量明显下降(如图5所示)。

本发明优点在于：

本发明首次通过实验验证了谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备治疗内异症药物的用途；尤其是经体外实验和动物实验证实，BPTES显著抑制异位内膜的生长，减少异位灶数量和重量，且实验结果还显示当谷氨酰胺浓度为1mM，2mM会抑制eESC的凋亡，当谷氨酰胺浓度为5mM会促进eESC的凋亡。

附图说明

附图1是正常内膜和内异症患者异位灶内膜中谷氨酰胺酶GLS的表达，

其中，Normal：正常内膜组，

Ectopic：异位内膜组，

Isotype：空白对照；

20X为物镜放大倍数，图例标尺为100μm。

附图2是谷氨酰胺下游代谢物在正常内膜和内异症患者异位灶内膜中的相对富集水平，

其中，ESC1-12：正常内膜ESC，

eESC1-9：异位灶内膜ESC，

Relative to ESC：异位灶内膜ESC与正常内膜ESC相比的相对富集倍数；

*P<0.05,***P<0.001，and****P<0.0001。

Citric acid：柠檬酸,Glutamate：谷氨酸，Oxoglutaric acid：酮戊二酸，Fumaricacid：

延胡索酸，Malic acid：苹果酸，Glyceric acid：甘油酸。

附图3是适宜浓度的谷氨酰胺可以促进异位灶内膜ESC的增殖，

其中，0,1,2,5为谷氨酰胺浓度(mmol/l)，

Ctrl：对照组(不含谷氨酰胺)，

Gln：谷氨酰胺组(2mmol/l)，

Gln+BPTES:谷氨酰胺+BPTES(10μM)组；

Cell viability：eESC(异位灶内膜ESC)活力指数，以对照组为100，各组活力指数＝100*实验组OD值/对照组平均OD值；

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001and****P<0.0001。NS:无显著差异。

附图4是适宜浓度的谷氨酰胺可以抑制异位灶内膜ESC的凋亡，

其中，0,1,2,5为谷氨酰胺浓度(mmol/l)，

Early apoptosis为早期凋亡细胞的比例。

附图5是BPTES处理显著降低小鼠异位灶数量和重量，

其中，Ctrl:对照组内异症小鼠，

BPTES：BPTES腹腔注射组(12.5mg/kg，100uL)内异症小鼠，

*P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1分析正常内膜和内异症异位灶内膜中谷氨酰胺酶GLS的表达

收集正常内膜组织及EMS患者异位灶内膜组织，经PBS洗涤后用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。

经免疫组织化学染色(免疫组化抗体购于abcam公司)结果显示：正常内膜组织中，谷氨酰胺酶GLS主要表达在上皮细胞，基质细胞中GLS表达较低；异位灶内膜组织中，上皮细胞和基质细胞中均可以看到明显的GLS表达。与正常内膜相比，异位灶内膜中上皮细胞和基质细胞的GLS表达都明显升高。

实施例2体外实验证实谷氨酰胺下游代谢物在异位内膜中明显富集

收集正常内膜组织12例及EMS患者异位内膜组织9例，原代分离培养获得ESC，种于6孔板中。待细胞长满后，胰酶消化收集于EP管中，加入200μl ddH₂O反复冻融3次，再加入900μl甲醇吹打萃取完全，20,000g离心10分钟，收取上清液于旋转挥发仪上不高于45℃挥干，收集挥干后的代谢物进行液相色谱-串联质谱分析，并用Analyst软件分析各种代谢产物的峰度。

实验结果表明，异位内膜细胞中的谷氨酸浓度为正常内膜的3.09倍，酮戊二酸为正常内膜的1.88倍，延胡索酸为1.46倍，苹果酸为7.80倍，甘油酸为2.52倍，柠檬酸为1.88倍，NADH为3.24倍，差异均具有统计学意义。

实施例3分析BPTES对异位灶内膜ESC细胞活力的作用

首先我们收集EMS患者异位灶内膜组织，通过IV胶原酶(Sigma)消化并分离培养原代异位灶ESC(eESC)，然后利用不同浓度的谷氨酰胺(0-5mM)来刺激eESC，48小时后采用CCK8法(购自于东仁化学公司)检测各组细胞活力。

结果显示，与对照组(谷氨酰胺0mM)相比，1mM，2Mm和5mM的谷氨酰胺均可以明显促进eESC的增殖，其中谷氨酰胺浓度为2mM时促进eESC增殖的作用最为显著(如图3A所示)。在给与2mM谷氨酰胺的同时加入BPTES(10μM)可以消除谷氨酰胺促进增殖的作用(如图3B所示)。表明谷氨酰胺可以促进eESC的增殖，而BPTES可以通过抑制eESC的谷氨酰胺代谢来抑制其增殖。

实施例4分析BPTES对异位灶内膜ESC细胞活力的作用

收集EMS患者异位灶内膜组织，通过IV胶原酶(Sigma)消化并分离培养原代异位灶ESC(eESC)，然后利用不同浓度的谷氨酰胺(0-5mM)来刺激eESC，48小时后用凋亡试剂盒(购自于BD公司)检测各组细胞的凋亡。

结果显示，与对照组(谷氨酰胺0mM)相比，谷氨酰胺浓度为1mM，2Mm时可以明显抑制eESC的凋亡，且两组之间没有显著性差异。而当谷氨酰胺浓度为5mM时，eESC的凋亡比例上升(如图4所示)。表明合适浓度的谷氨酰胺可以抑制eESC的凋亡，而浓度过高时可以促进eESC的凋亡。

实施例5动物实验：验证BPTES显著抑制内异症小鼠异位灶生长

我们首先如图5A所示构建内异症(EMs)小鼠模型，具体为：健康7周龄雌性C57B/L6小鼠(上海杰思捷实验动物有限公司)，受体鼠术前用雌激素肌肉注射诱导2次；供体鼠术前用雌激素肌肉注射诱导1次后根据体重平均分为2组，一组腹腔注射BPTES(12.5mg/kg，100μl)，一组注射等量的PBS作为对照。7天后将供体小鼠子宫取出，剪碎至<1mm的组织碎屑，腹腔注射至受体小鼠(1只供体小鼠子宫碎屑一分为二注射至两只受体小鼠)。术后观察14天，14天后采用颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔查看内异灶的形成情况，统计内异灶的数量并称重。

结果显示，腹腔注射BPTES的内异症模型与对照组相比，异位灶的数量和重量均明显下降(如图5B和5C所示)。

本发明经体外和体内试验结果证实，利用BPTES可以明显抑制异位灶ESC细胞活力和内异症小鼠异位灶的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用。

2.谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备抑制子宫内膜异位症中异位内膜生长的药物中的应用。

3.谷氨酰胺酶抑制剂BPTES在制备减少子宫内膜异位症中异位灶数量、重量的药物中的应用。