CN110772504B - 刺甘草查尔酮作为抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了刺甘草查尔酮作为炎症抑制剂的用途，刺甘草查尔酮可以作为炎症小体抑制剂，并能够抑制ASC斑点形成，以及后续caspase‑1 p20的活化和IL‑1β的分泌。刺甘草查尔酮可作为为治疗炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。

Description

刺甘草查尔酮作为抑制剂的用途
技术领域
本发明属于但不限于生物医学和药物领域，特别涉及刺甘草查尔酮作为炎症小体抑制剂的用途，以及其在治疗相关疾病中的应用。
背景技术
炎症小体主要是由受体蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-like protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1前体(pro-caspase-1)组成的多蛋白复合物；其中,受体蛋白包括多种NOD样受体蛋白家族如NOD样受体家族3(NLRP3)、NOD样受体家族半胱天冬酶激活募集结构域4(NLRC4)、黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)蛋白和pyrin。当细胞受到病原相关分子模式(pathogenassociated molecular pattern,PAMP)或危险相关分子模式(danger-associated molecular pattern,DAMP)刺激时,会促进炎症小体的组装活化,pro-caspase-1自我剪切产生活性caspase-1,活性caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18,从而分泌成熟IL-1β和IL-18等促炎因子,介导多种疾病的发生。NLRC4炎症小体的激活与嗜肺性军团菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌等胞内寄生的致病菌感染密切关联，其可以被细菌鞭毛蛋白所激活诱发感染性肺炎。
其中NLRP3炎症小体研究最为广泛。可被ATP、Nigericin(尼日尼亚菌素)、MSU(单钠尿酸结晶)及病原体等多种因素诱导活化，介导多种疾病的发生。NLRP3炎症小体是固有免疫的重要组成部分，但其异常活化和功能失调与多种获得性炎症性疾病和遗传性NLRP3突变引起的自身免疫病的病理过程密切相关。目前研究发现溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、2型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风和非酒精性脂肪性肝炎等都NLRP3炎症小体异常活化密切相关。目前在治疗NLRP3炎症小体或其他炎症小体相关疾病方面，并未有相关药物的临床应用，因此开发NLRP3炎症小体抑制剂，抑制NLRP3炎症小体的异常活化，将有利于缓解上述炎症性疾病以及提供新的治疗途径。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
刺甘草查尔酮(Echinatin)，CAS号为34221-41-5，分子式为C16H14O4,分子量为270，黄色粉末，溶于甲醇，DMSO。
Figure BDA0002246342380000021
尽管文献报道了刺甘草查尔具有抗肿瘤活性、治疗牛皮癣、抑制氧化造成的细胞损伤和组织损伤以及保护肝损伤等，但是未涉及抑制炎症小体活化。
本发明人发现刺甘草查尔酮对炎症小体具有抑制作用，能有效抑制炎症小体的活化，可用于制备治疗相关疾病的药物。
在本发明的实施方案中，本发明提供了刺甘草查尔酮作为炎症小体抑制剂的用途。
在本发明的实施方案中，所述炎症小体抑制剂包括但不限于寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域3(NLRP3)炎症小体抑制剂、寡聚化结构域样受体家族半胱天冬酶激活募集结构域4(NLRC4)抑制剂。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了刺甘草查尔酮作为核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域3(NLRP3)炎症小体抑制剂的用途，或者，刺甘草查尔酮作为NLRP3炎症小体活化抑制剂的用途。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了刺甘草查尔酮作为寡聚化结构域样受体家族半胱天冬酶激活募集结构域4(NLRC4)抑制剂的用途，或者，刺甘草查尔酮作为NLRC4炎症小体活化抑制剂的用途。
在本发明的一种实施方案中，本发明还提供了刺甘草查尔酮抑制凋亡相关斑点样蛋白(ASC)多聚化的用途。
在本发明的一种实施方案中，本发明还提供了刺甘草查尔酮抑制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1p20蛋白(caspase-1p20，Casp-1p20)的活化的用途。
在本发明的一种实施方案中，本发明还提供了刺甘草查尔酮抑制白细胞介素-1β(IL-1β)分泌的用途。
在本发明的实施方案中，本发明提供了刺甘草查尔酮在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病、或者NLRC4炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用，这里，所述相关疾病包括但不限于：痛风；动脉粥样硬化；非酒精性肝炎；感染性炎症性疾病，如脓毒症、感染休克(例如革兰氏阴性菌感染休克)、溃疡性结肠炎；遗传性Cryopyrin相关周期性发热综合征；神经性疾病及脑损伤，如多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症等。优选地，所述相关疾病为感染休克(例如革兰氏阴性菌感染休克)、溃疡性结肠炎、或非酒精性脂肪性肝炎。
本发明在研究过程中还发现，刺甘草查尔酮能够抑制ASC斑点形成，以及caspase-1p20的活化，最终抑制IL-1β的分泌。动物实验进一步发现，刺甘草查尔酮能够在体内抑制LPS(脂多糖)诱导的感染休克和治疗DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的溃疡性结肠炎。因此，刺甘草查尔酮可能成为治疗NLRP3异常活化相关疾病、或者NLRC4炎症小体异常活化相关疾病的潜在特效药物。
所述的治疗NLRP3相关疾病的、或者NLRC4炎症小体异常活化相关疾病、或抑制NLRP3炎症小体活化、或者NLRC4炎症小体活化药物，它们包含治疗有效量的刺甘草查尔酮、药学上可接受的辅料，还可以包含其他起配伍协同作用的有效成分；所述的药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。所述药物的给药对象为哺乳动物，包括人。
目前临床上尚无可有效防止细菌感染或由内源性DAMP诱导的NLRP3炎症小体活化的药物。刺甘草查尔酮作为NLRP3炎症小体的抑制剂，用于制备防治因感染或内源性DAMP而引起的NLRP3炎症小体活化药物的应用，对临床治疗NLRP3相关疾病(如痛风；遗传性Cryopyrin相关周期性发热综合征；神经性疾病及脑损伤：如多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症等；感染性炎症性疾病，如脓毒症。)等具有重要意义，可用于相关药物开发。
本发明中刺甘草查尔酮是NLRP3炎症小体抑制剂，能抑制由外源性刺激因子Nigericin(尼日尼亚菌素)诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化，最终抑制caspase-1p20的活化以及成熟IL-1β炎症因子的分泌，有效降低LPS致敏的感热休克症反应和感染引起的死亡。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1显示的是本发明实施例1中刺甘草查尔酮剂量依赖性抑制LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体IL-1β分泌的作用；
图2显示的是本发明实施例1中刺甘草查尔酮剂量依赖性抑制LPS+尼日尼亚菌素诱导的NLRP3炎症小体IL-1β分泌的作用；
图3显示的是本发明实施例1中刺甘草查尔酮剂量依赖性抑制LPS+ATP诱导NLRP3炎症小体caspase-1前体(pro-caspase-1)以及IL-1β前体(pro-IL-1β)的剪切的作用；
图4显示的是本发明实施例1中刺甘草查尔酮剂量依赖性抑制LPS+尼日尼亚菌素诱导NLRP3炎症小体caspase-1前体(pro-caspase-1)以及IL-1β前体(pro-IL-1β)的剪切的作用；
图5显示的是本发明实施例2中刺甘草查尔酮剂量依赖性抑制LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体caspase-1p20的酶活的作用
图6显示的是本发明实施例2中刺甘草查尔酮剂量依赖性抑制LPS+尼日尼亚菌素诱导的NLRP3炎症小体caspase-1p20的酶活的作用；
图7显示的是本发明实施例3中刺甘草查尔酮特异性抑制ASC多聚化(斑点)的免疫印迹(Western blot)；
图8显示的是本发明实施例4中刺甘草查尔酮对LPS+鞭毛蛋白(Lfn-FliC)诱导的NLRC4炎症小体、LPS+dsDNA类似物(Poly(dA:dT))诱导的AIM2炎症小体的IL-1β的分泌的影响结果；
图9显示的是本发明实施例4中不同炎症小体激动剂刺激下，刺甘草查尔酮对IL-1β前体及caspase-1前体剪切的影响结果；
图10显示的是本发明实施例4中刺甘草查尔酮能够抑制多种NLRP3炎症小体激动剂诱导的NLRP3炎症小体IL-1β的分泌作用；
图11显示的是本发明实施例5中刺甘草查尔酮能够抑制LPS诱导小鼠感染休克血清中IL-1β和TNF-α的分泌作用；
图12显示的是本发明实施例5中刺甘草查尔酮可以显著降低革兰氏阴性菌感染引起的死亡；
图13显示的是本发明实施例6中急性结肠炎动物模型建立示意图；
图14显示的是本发明实施例6中刺甘草查尔酮对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠体重和DAI(疾病活动指数)评分的影响；
图15显示的是本发明实施例6中刺甘草查尔酮对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响；
图16显示的是本发明实施例6中刺甘草查尔酮对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织损伤程度的影响；
图17显示的是本发明实施例6中刺甘草查尔酮对DSS诱导溃疡性结肠炎NLRP3炎症小体相关蛋白的表达影响；
图18显示的是本发明实施例7中刺甘草查尔酮显著降低非酒精性脂肪性肝炎模型中ALT、AST水平；
图19显示的是本发明实施例7中刺甘草查尔酮明显改善非酒精性脂肪性肝炎模型中肝脏组织损伤和肝纤维化程度；
图20和图21分别显示的是本发明实施例7中刺甘草查尔酮明显抑制非酒精性脂肪性肝炎模型中α-Sma、Collal、Il-1β、Tnf-α的mRNA的表达水平和caspase-1p20蛋白表达水平。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例中所用到的材料：
刺甘草查尔酮购自成都普思生物科技股份有限公司,纯度99.44％；ATP和Nigericin均购自美国Sigma公司；poly(dA:dT)、ultrapure LPS购自美国Invivogen公司；Lfn-FliC(中国人民解放军军事医学科学院，参见Tao Li等“NLRP3 Phosphorylation Isan Essential Priming Event for Inflammasome Activation”，https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.08.017)；NLRP3、ASC和caspase-1抗体均购自美国Adipogen公司；IL-1β抗体购自美国R&D公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体购自美国Santa Cruz公司；PVDF膜(孔径0.45μm)购自美国Millipore公司；opti-MEM无血清培养基及其他所有细胞培养试剂均购自美国Gibco公司；caspase-1活性检测试剂盒购自美国Promega公司，IL-1β/TNF-αELSIA检测试剂盒购自中国达科为生物技术股份有限公司，C57BL/6小鼠购自北京斯贝福实验动物技术有限公司。
实施例1
本实施例用于说明刺甘草查尔酮能明显抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体活化后IL-1β的加工成熟及释放。
1.小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的培养分化：取10-12周龄左右的C57BL/6小鼠，脱臼处死后在超净台分离小鼠的双侧股骨并用细针头吸取DMEM培养基冲出骨髓细胞，反复吹散细胞后转移至50mL离心管,室温离心后，去上清,用10％胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)及1％双抗的DMEM培养基重悬细胞,同时加入巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)终质量浓度为25ng·mL-1,细胞培养5天后获得BMDMs。
2.利用小鼠原代骨髓巨噬细胞构建NLRP3炎症小体活化模型：取上述分离培养好的BMDMs，胰酶与EDTA联合消化后接种8.5×105个细胞/孔至24孔板中,用DMEM高糖培养基细胞培养箱12h后,培养基替换成浓度为50ng·mL-1脂多糖(LPS)的DMEM培养基,预处理4h后,撤除LPS刺激,用不同浓度的刺甘草查尔酮处理1h后,再分别加入NLRP3炎症小体激活剂ATP和尼日尼亚菌素(Nigericin)刺激45min,刺激时间结束后收取细胞上清液，采用IL-1βELSIA检测试剂盒检测，结果如图1和2。
3.样品处理及Western blot测定NLRP3炎症小体相关蛋白的表达：重复上述2步骤，收集细胞培养上清液及细胞裂解液，在3500r·min-1离心后,上清中加入1/4体积三氯乙酸(TCA),冰箱-20℃过夜后,13 000r·min-1、4℃离心15min,弃去上清,加冰丙酮洗1次,105℃金属浴挥干丙酮,待丙酮挥发后加1×上样缓冲液40μL振荡混匀,水浴煮沸,冷却后作为上清样品。贴壁细胞用PBS洗板2次，置于冰上,每孔加入1×上样缓冲液200μL,10min后刮下细胞,吸取细胞裂解液,水浴煮沸20min,冷却后作为细胞裂解样品。取蛋白样品20μL进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF膜上,10％脱脂奶室温封闭0.5h后，分别加入pro-IL-1β、caspase-1p20、IL-1β、ASC、NLRP3、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的一抗溶液4℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗溶液室温孵育1h后,用Carestream公司的化学发光液显色,X光片显影，结果如图3和4。
结论：NLRP3炎症小体活化后，细胞分泌大量成熟的IL-1β，由图1-2的结果显示，在不同的NLRP3炎症小体激动剂刺激下，刺甘草查尔酮能够剂量依赖性抑制IL-1β分泌；图3-4结果显示，刺甘草查尔酮能够剂量依赖性抑制IL-1β前体的加工和剪切。综上可知，刺甘草查尔酮能够显著抑制NLRP3炎症小体IL-1β的加工成熟及释放。
实施例2
本实施例用于说明刺甘草查尔酮能够抑制NLRP3炎症小体中caspase-1 p20的酶活。
1.BMDMs的获取和收集：LPS刺激的ATP、尼日尼亚菌素分别诱导的BMDMs细胞培养上清，同实施例1的步骤1和2。细胞培养上清液采用
Figure BDA0002246342380000081
1 Inflammasome Assay检测试剂盒测定caspase-1p20酶活性,检测按照试剂盒说明书操作进行,最后用PromegaGloMax 20/20发光检测仪检测,结果如图5和6。
结论：
Figure BDA0002246342380000082
1Inflammasome Assay检测试剂盒是目前检测caspase-1p20酶活性的有效工具，由图5-6结果可知，刺甘草查尔酮能够剂量依赖性抑制caspase-1p20酶活。
实施例3
本实施例用于说明刺甘草查尔酮抑制ASC多聚化。
1.将BMDMs细胞接种在6孔板中(密度为8.5×105孔)，过夜后，50ng/mL LPS诱导4小时，加入刺甘草查尔酮40uM作用1小时，再加入不同的NLRP3炎症小体刺激因子作用相应时间。吸弃上清液，每孔加入500μL预冷的Triton裂解液[50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mMNaCl,0.5％Triton X-100,and EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche)]，静置15分钟后，6000g离心15分钟，吸弃上清，加入预冷的PBS洗涤两次，然后重悬于200μL的PBS，直接加入辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)，使其终浓度为2mmol/L，37摄氏度下反应30分钟。随后6000g离心15分钟，去上清液后，加入30μL的2×电泳上样缓冲液，煮沸5分钟，经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测，结果如图7。
实施例4
本实施例中用于说明刺甘草查尔酮对LPS+鞭毛蛋白(Lfn-FliC)诱导的NLRC4炎症小体、LPS+Poly(dA:dT)(dsDNA类似物)诱导的AIM2炎症小体及NLPR3炎症小体的影响。
1.利用BMDMs细胞构建NLRC4和AIM2、NLRP3炎症小体活化模型：BMDMs的获取同实施例1的步骤1；取上述分离培养好的BMDMs，胰酶与EDTA联合消化后接种8.5×105个细胞/孔至24孔板中,用DMEM高糖培养基细胞培养箱12h后,培养基替换成浓度为50ng·mL-1脂多糖(LPS)的DMEM培养基,同时预留两个孔用TLR1/2激动剂—Pam3CSK4预处理(构建NLRP3炎症小体非经典活化通路)，预处理4h后,撤除LPS、Pam3CSK4刺激,用40μmol浓度的刺甘草查尔酮处理1h后,分别在实验孔中加入AIM2炎症小体激活剂Poly(dA:dT)、NLRC4炎症小体激活剂Lfn-FliC刺激6h，用Pam3CSK4预处理的两个孔通过脂质体包被的LPS刺激6h，同时用NLRP3炎症小体激活剂尼日利亚菌素刺激45min，刺激时间结束后收取细胞上清液，用IL-1βELSIA检测试剂盒检测，结果如图8。
2.样品处理及Western blot测定NLRP3炎症小体相关蛋白的表达：重复上述1步骤，收集细胞培养上清液及细胞裂解液，在3500r·min-1离心后,上清中加入1/4体积三氯乙酸(TCA),冰箱-20℃过夜后,13 000r·min-1、4℃离心15min,弃去上清,加冰丙酮洗1次,105℃金属浴挥干丙酮,待丙酮挥发后加1×上样缓冲液40μL振荡混匀,水浴煮沸,冷却后作为上清样品。贴壁细胞用PBS洗板2次,置于冰上,每孔加入1×上样缓冲液200μL,10min后刮下细胞,吸取细胞裂解液,水浴煮沸20min,冷却后作为细胞裂解样品。取蛋白样品20μL进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF膜上,10％脱脂奶室温封闭0.5h后,分别加入pro-IL-1β、caspase-1、IL-1β、ASC、NLRP3、GAPDH的一抗溶液4℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗溶液室温孵育1h后,用Carestream公司的化学发光液显色,X光片显影，结果如图9
3.BMDMs的获取同实施例1的步骤1，取上述分离培养好的BMDMs，胰酶与EDTA联合消化后接种8.5×105个细胞/孔至24孔板中,用DMEM高糖培养基细胞培养箱12h后,培养基替换成浓度为50ng·mL-1脂多糖(LPS)的DMEM培养基,预处理4h后,撤除LPS刺激,用40μmol浓度的刺甘草查尔酮处理1h后,再分别用不同的NLRP3炎症小体激活剂(ATP、nigericin、poly(I:C)、MSU(单钠尿酸结晶))刺激，刺激时间结束后收取细胞上清液，采用IL-1βELSIA检测试剂盒检测，结果如图10。
结论：由图8-10可知，40μmol浓度的刺甘草查尔酮能抑制NLRC4、NLRP3炎症小体caspase-1p20的剪切和IL-1β的分泌，刺甘草查尔酮还能够很好的抑制多种NLRP3炎症小体激动剂(如ATP、尼日尼亚菌素(nigericin)、MSU、poly(I:C))所引起的IL-1β的分泌。综上结果进一步表明，刺甘草查尔酮能够抑制NLRP3、NLRC4炎症小体的活化，另外其还能抑制NLRP3炎症小体的非经典活化通路；同时也暗示着刺甘草查尔酮还对NLRC4炎症小体相关疾病也有治疗作用，具有广谱抑制炎症小体的作用。
实施例5
本实施例中用于说明刺甘草查尔酮可以治疗LPS诱导的感染性休克，并显著降低革兰氏阴性菌感染引起的死亡：
1.选取C57BL/6小鼠，7-8周，雌性，40只，购自北京斯贝福生物技术有限公司提供，随机分为6组，分别为空白对照组8只、LPS模型组8只、刺甘草查尔酮治疗组1(20mg/kg)6只和刺甘草查尔酮组治疗2(40mg/kg)6只、阳性药MCC950治疗组1(20mg/kg)6只和阳性药MCC950组治疗2(40mg/kg)6只；空白对照组、模型组腹腔注射等量的5％DMSO的玉米油混合液，其余组别分别腹腔注射溶解于5％DMSO的玉米油混合液的刺甘草查尔酮和阳性药MCC950；1小时后，除空白对照组腹腔注射等量的PBS溶液，其余组别注射质量浓度为20mg/kg LPS的PBS溶液，6小时后摘眼球取血，4℃离心取血清ELISA检测IL-1β、TNF-α因子指标，结果表明刺甘草查尔酮可以抑制IL-1β、TNF-α因子的分泌，如图所示11。
2.小鼠生存率曲线：选取C57BL/6小鼠，7-8周，雌性24只，购自京斯贝福生物技术有限公司提供，在实验室适应性饲养一周后，随机分为2组，分别为模型组、刺甘草查尔酮治疗组1(40mg/kg)。模型组腹腔注射等量的5％DMSO的玉米油混合液，其余组分别腹腔注射溶解于5％DMSO的玉米油混合液的刺甘草查尔酮；1小时后，各组别注射20mg/kg LPS的PBS溶液，接下来的80小时内，每6小时观察记录小鼠存活情况，并绘制小鼠生存曲线分析存活率；如图所示12。
结论：小鼠经腹腔注射刺甘草查尔酮给药后，可明显降低LPS致敏的炎症反应和感染引起的死亡，意味着刺甘草查尔酮对革兰氏阴性菌诱导的感染有显著治疗效果。
实施例6
本实施例中用于说明刺甘草查尔酮基于NLRP3炎症小体通路治疗DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎
1.右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)融于高压灭菌水，浓度为2.5％(v/w)，小鼠自由饮水。每天检测小鼠体重、粪便变化。给药处理：选取C57BL/6小鼠，7-8周，雌性32只，分为空白对照组、单独给药对照组、模型组、刺甘草查尔酮治疗组(40mg/kg)4组；除空白对照组、单独给药对照组自由饮用高压灭菌水外，其余两组小鼠均自由饮用2.5％DSS诱导急性溃疡性结肠炎模型。依据剂量每日腹腔注射，单独给药对照组和刺甘草查尔酮治疗组腹腔注射溶解于5％DMSO的玉米油混合液的刺甘草查尔酮，其余两组均腹腔注射等量的5％DMSO的玉米油混合液。根据小鼠生活状态，在第9天后处死小鼠，急性结肠炎动物模型建立示意图，如图13。
2.每日监测小鼠体重、便血及粪便形状，The disease activity index(DAI)score用来评估结肠炎活动程度，如下表；DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎后，小鼠出现体重下降、稀粪便、便血等急性溃疡性结肠炎临床症状，提示DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型成功。给药后，可以观察到刺甘草查尔酮可以显著改善小鼠上述临床症状，结果如图14。
(一)肠炎活动指数评分(DIA)
评分标准 体重减轻％ 粪便性状 便血程度
0 正常 正常 便潜血阴性
1 0-5％ 粪便成形略软 便潜血阳性
2 5-10％ 粪便非常软 便中有可见血
3 10-15％ 腹泻 可见直肠出血
4 ＞15％ 痢疾样便
体质量变化率＝(当日体质量-初始体质量)/初始体质量
3.刺甘草查尔酮明显改善结肠炎小鼠结肠损伤；2.5％DSS饲养小鼠后，结肠炎损伤可导致小鼠结肠长度变短，作为评估结肠损伤程度指标；如图所示，本实验中，发现DSS模型组结肠长度显著缩短，给药组的结肠长度显著高于DSS模型组，结果如图15。
4.刺甘草查尔酮减轻DSS诱导的小鼠结肠炎肠道组织损伤程度；我们通过结肠组织病理H&E染色评估小鼠结肠炎严重程度。DSS模型组小鼠，结肠组织病理可见结肠上皮损伤及黏膜损伤，给药治疗后，可显著改善小鼠结肠损伤程度，结果如图16。
5.刺甘草查尔酮减少结肠炎小鼠肠道NLRP3炎症小体相关蛋白的表达；DSS是通过NLRP3炎症小体通路激活caspase-1p20诱导结肠炎症，进一步通过Western blot技术检测小鼠结肠组织中NLRP3炎症小体ASC、pro-caspase-1、caspeas-1 p20相关蛋白的表达，结果显示DSS组中pro-caspase-1自我剪切成caspaes-1 p20程度显著高于DSS+刺甘草查尔酮组，从而，DSS+刺甘草查尔酮组小鼠结肠组织中caspaes-1p20表达明显低于DSS模型组，也表明刺甘草查尔酮明显抑制pro-caspase-1自我剪切成，最终抑制caspaes-1 p20的表达，介导NLRP3炎症小体改善结肠炎症，结果如图17。
结论:以上结果表明，小鼠经腹腔注射刺甘草查尔酮给药后，也可显著改善化学性DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状，刺甘草查尔酮可通过抑制炎症小体活化和caspaes-1p20的产生，治疗NLRP3炎症小体过度活化引起的相关疾病。
实施例7
本实施例中用于说明刺甘草查尔酮基于NLRP3炎症小体通路治疗蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline deficient diet,MCD)饲料诱导的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。
1.C57BL/6小鼠，8周，雄性30只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，在实验室适应性饲养一周后，随机分为5组(n＝6)，分为缺乏蛋氨酸和胆碱饮食组(喂MCD饲料)和不缺乏蛋氨酸和胆碱饮食组(喂MCS(methionine-choline sufficient diet)饲料)。MCS饲料组分为对照组、刺甘草查尔酮(40mg/kg)组，MCD饲料组分为对照组、刺甘草查尔酮(40mg/kg)给药组、MCC950(40mg/kg)给药组。喂食饲料一周，每日按上述计量给药一次，一周后，每天继续喂食饲料，隔天给药，5周后，小鼠眼球取血，检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)肝功能指标，结果如图18；解剖小鼠，取肝脏组织进行HE、天狼星红(Siriue red)和Masson染色，检测肝细胞损伤和组织纤维化程度，结果如图19；通过实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测肝脏组织中α-Sma、Collal、Il-1β、Tnf-α的mRNA的表达水平，结果如图20；通过免疫印迹(Western blot)技术分析caspase-1p45、caspase-1p20蛋白表达水平，结果如图21。
结论：以上结果表明，在非酒精性脂肪性肝炎模型中，腹腔注射给药刺甘草查尔酮，可显著降低ALT、AST水平，明显改善肝脏组织损伤和肝纤维化程度，并抑制α-Sma、Collal、Il-1β、Tnf-α的mRNA的表达和caspase-1p20蛋白表达，说明刺甘草查尔酮可在体内显著抑制炎症小体的激活，对非酒精性脂肪性肝炎有明显治疗效应。
通过以上实施例1-7的结果可以看出，在体外实验中，刺甘草查尔酮能够抑制ATP、尼日尼亚菌素、MSU等NLRP3炎症小体激动剂引起的活化，但是对其他炎症小体活化没有影响。进一步发现，在体内实验中，刺甘草查尔酮明显降低LPS感染休克症状和感染引起的死亡；显著改善化学性DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状；明显治疗非酒精性脂肪性肝炎。由此可见，刺甘草查尔酮可作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (1)

1.刺甘草查尔酮在制备治疗炎症小体异常活化相关疾病的药物中的用途，这里，所述相关疾病为：非酒精性脂肪性肝炎。
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