KR20140071262A - 코엔자임 ｑ１０을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코엔자임 Q10을 유효성 분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 효과가 우수하여, 이식거부질환과 같은 면역 거부 질환 또 는 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.
또한 본 발명은 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및 FK-506 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및 FK-506 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 종래 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)의 불용성 문제 및 안정성 문제를 해결하여 코엔자임 Q10이 가지고 있는 약리학적 효과를 극대화시킬 수 있고, FK-506 화합물과 병용처리함으로써 상기 FK-506 화합물이 갖는 부작용을 최소화 시킬 수 있으므로, 이식거부질환과 같은 면역 거부 질환을 매우 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 세포독성을 유발시키지 않아 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

코엔자임 Ｑ１０을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating inflammatory disease or immunological rejection comprising coenzyme Q10 as an effective component}

본 발명은 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환, 노인성 골관절염 또는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

면역거부반응이란 이식된 조직을 숙주가 비자기(nonself)로 인식하고 이를 제거하고자 하는 반응으로 MHC(major histocompatibility complex) 혹은 minor histocompatibility complex가 관여하는 것으로 알려져 있다. 거부반응은 세포매개면역과 체액면역 모두가 관련하나 이들의 상대적인 기여도는 이식반응의 종류에 따라 다르다.

T세포매개 반응의 경우, 모든 세포에 광범위하게 표현되어 있는 MHC가 동종항원(alloantigen)으로서 역할을 하며, CD4 T세포(MHC typeⅡ인식)와 CD8 T세포(MHC typeⅠ인식)가 모두 관여한다. T세포매개반응은 수용자의 림프구가 공여자의 MHC를 만났을 때 개시되는데, 즉, 숙주 T세포가 이식장기내의 가지세포를 만나거나 공여자의 가지세포가 수용자의 림프절로 유입된 후 면역작용이 시작되며, 활성화된 CD4 T세포는 지연과민반응에서 나타나는 cytokine을 분비하여 혈관투과성을 증가시키고, 림프구, 대식구와 같은 단핵세포의 국소 침윤을 일으키며, 침윤된 대식구에 의해 미세혈관 손상, 조직허혈 및 이식조직 파괴가 일어나게 된다.

또한, 동종 항원에 대한 항체매개 반응으로도 면역 이식거부가 일어날 수 있는데, 초급성 거부는 이미 형성된 항공여자 항체가 존재하거나, 신장이식, 임신(태아에서 기원한 nonself MHC), MHC가 일치되지 않은 사람에게서 수혈을 받은 경우(혈소판, 백혈구)에 일어나게 되고, 이식 항원에 노출된 적이 없으나 나중에 항체가 형성되어 거부반응이 나타나는 경우에는, B세포가 T세포의 도움을 받아 공여자의 항원에 대한 항체를 분비하고, 항체의 최초 표적은 이식 조직의 혈관이다.

일반적인 장기이식에서는 수혜자가 이식 장기를 거부하지만, 골수이식이나 면역세포를 이식할 경우는 이식해준 면역세포들이 수혜자의 면역계를 거부하는데, 이를 이식편 대 숙주 거부반응(graft-versus-host rejection)이라고 한다.

이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GvHD)은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 면역 거부 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환으로 심한 경우 환자가 사망할 수 있다.

이식편대숙주질환은 크게 급성 이식편대숙주질환(acute Graft-versus-Host Disease, aGvHD)과 만성 이식편대숙주질환(chronic Graft-versus-Host Disease, cGvHD)으로 구분된다.

만성 이식편대숙주질환은 동종이식의 경우 이식 후 보통 4~6개월이 지나서 발생하며, 이식 80일 이전이나 1년 이후 발생하는 경우는 드물다. 따라서 동종반응이 만성 이식편대숙주질환을 일으키는 주요한 전제조건이며, 만성 이식편대숙주질환의 발명과정은 긴 잠복기를 거치거나, 표적 장기에 미치는 영향이 느리게 나타난다는 것을 알 수 있다.

또한 급성 이식편대숙주질환은 동종조혈세포이식의 중요한 합병증으로, 동종조혈모세포 이식 후 대게 30~40일 이내에 발생하게 되며, 피부, 간 그리고 위장관을 침범하게 된다. 이러한 급성 이식편대숙주질환은 3단계로 발생하게 되는데, 1단계에서는 골수를 이식하기 이전에 발생하는 것으로 환자의 조직이 손상되고 경우에 따라서는 박테리아 감염 등에 의해 항원제시세포(antigen presenting cell)가 활성화되는 단계이며, 2단계에서는 이식되는 골수세포 중의 T 세포가 활성화되는 단계이다. 이미 활성화된 환자의 항원제시세포가 T 세포를 Th1 세포로 분화시키며, 궁극적으로 IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인 분비를 증가시킨다. 3단계에서는 환자의 장기가 파괴된다. 활성화된 Th1 세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 사이토톡식 T 세포 (cytotoxic T cell) 및 자연살해세포 (naturall killer cell)등이 활성화되면 이들 세포는 환자의 장기를 공격하게 되어 이식편대숙주질환이 발생하게 된다.

이러한 이식편대숙주질환을 치료하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되고 있다. 이식되는 골수세포 중에서 T 세포를 제거하는 방법, T 세포와 항원제시세포의 반응을 억제하기 위해 CD80, CD86 등에 대한 항체를 투여하는 방법, IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인에 대한 항체를 투여하는 방법 등이 제시되고 있다. 이와 더불어 사이클로스포린 에이, 라파마이신, FK-506 스테로이드제제 등의 화합물 면역거부 억제제를 투여하는 방법도 사용되고 있다. 이들 방법 중에서 T 세포의 활성화를 억제하는 화합물 면역거부 억제제 투여법이 가장 널리 사용되고 있다.

현재까지 많은 화합물 면역억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며 급성 이식편대숙주병을 포함하여 장기이식거부반응 등에 널리 쓰이고 있다. 그러나 사이클로스포린에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나 신장독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 문제점이 있다.

관절에 나타나는 염증성 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균 감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 변형성 관절염, 결합조직의 퇴행성 변화로 인하여 가용성 대사 산물이 관절 주변의 결합 조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.

퇴행성 관절염, 즉 골관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여, 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형II 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨-1β(interleukin-1β) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라, 관절기질을 분해하는 기질 금속단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.

또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과, 생성된 일산화질소에 의한 자가증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에서의 염증반응을 유발시킨다.

따라서 부작용이 없고 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환의 치료제 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제656571호 한국등록특허 제585562호 미국등록특허 5,365,948호

따라서 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro )내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 Th17 세포에 처리하여 Treg 세포로 재분화 시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)과 FK-506을 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 마지막 목적은 시험관(in vi tro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및/또는 FK506을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나 또는 TH17, RORr T, CCL20의 발현을 감소시키거나 또는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.001uM 내지 5uM의 농도로 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 면역 질환의 예방 또는 치료 효과는 체액성 면역반응(humoral response)을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 체액성 면역반응은 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 염증성 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 강직성 척추염, 건선관절염, 세균성 관절염, 소아기 류마티스 관절염, 재발류마티스, 류마티스 다발근육통증, 라임 관절염, 유착 관절낭염 또는 염증성 장질환인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 염증성 장질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장궤양 및 회장낭염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 면역 질환은 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemiareperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graftversus-host disease) 및 미토콘드리아 관련 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a 또는 VEGF 발현 감소 효과, 파골세포의 분화 억제 효과 또는 골(연골)보호 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 골보호 효과는 TRAP(tartrate-resistant acid-phosphatase), RANK(Receptor activator of nuclear factor kappa-B) 또는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor k appa-B ligand)의 발현 감소를 통한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro )내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T ce ll: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 조절 T 세포를 활성화시키는 방법은 조절 T 세포에서 Foxp3의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 Th17 세포에 처리하여 Treg 세포로 재분화 시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 지질분산액이 들어있는 용액 속에 직접 담그고 고주파를 조사하여 제조된 것

본 발명의 일실시예에 있어서, 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 INOS 또는 MMP13의 생성을 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-1 bata의 발현을 감소 또는 억제시키는 것

또한, 본 발명은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)과 FK-506을 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키며, FK-506에 의한 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 감소를 억제시키는 것

본 발명의 일실시예에 있어서, 면역거부 질환은 기관 또는 조직의 이식편거부반응; 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응; 또는 동종이식 거부반응인 것

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.1uM 내지 10uM의 농도로 포함되어 있고, FK-506은 1ug/ml 내지 10ug/ml의 농도로 포함되어 있는 것

또한, 본 발명은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관(in vi tro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및/또는 FK506을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 효과가 우수하여, 이식거부질환과 같은 면역 거부 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

또한 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및 FK-506 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 종래 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)의 불용성 문제 및 안정성 문제를 해결하여 코엔자임 Q10이 가지고 있는 약리학적 효과를 극대화시킬 수 있고, FK-506 화합물과 병용처리함으로써 상기 FK-506 화합물이 갖는 부작용을 최소화 시킬 수 있으므로, 이식거부질환과 같은 면역 거부 질환을 매우 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 세포독성을 유발시키지 않아 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)에 세포독성이 있는 지 유무를 알아보기 위하여 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 농도별로 처리하고, MTT 어세이 분석을 한 결과이다.
도 2는 Th17/IL-17 세포와 Foxp3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 Th0 조건으로 Th17을 유도한 뒤 코엔자임 Q10을 농도별로 처리하였을 때의 그래프이다.
도 4는 인간 말초 단핵세포에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg의 발현 FACS로 관찰한 결과이다.
도 5a와 5b는 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg의 발현 Realtime PCR로 관찰한 결과이다.
도 6은 코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성 확인 실험 결과이다.
도 7은 류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인 결과이다.
도 8은 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현 확인 결과이다.
도 9는 코엔자임 Q10에 의한 류마티스 관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응 (humoral response)을 확인한 결과이다.
도 10은 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 골파괴 억제 기전 확인 결과이다.
도 11은 SKG 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절을 확인한 결과이다.
도 12는 코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과 확인 결과이다.
도 13은 골관절염 동물모델에서 코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 14는 코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 15는 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, IL-15의 발현 확인 결과이다.
도 16은 골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현 확인 결과이다.
도 17는 야생형(Wild type) B6 마우스의 비장세포에 coQ10을 처리하여 신호전달 분자의 분석을 Western blot 을 이용하여 Protein level 에서 관찰한 것이다.
도 18은 류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염을 유발 후 36일 지난 후 마우스를 치사시켜 비장세포를 얻어 Th17, Treg, IFN-r의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석한 것이다.
도 19는 coQ10이 주입된 마우스의 비장조직을 공초점현미경을 (Confocal microscopy) 통해서 분석한 것으로서 Th17, 조절 Treg 세포 및 염증관련 STAT3, mTOR, AMPK, STAT5, p53의 활성을 관찰한 것이다.
도 20은 코엔자임 Q10이 주입된 마우스의 비장조직에서 신호전달 분자의 분석을 confocal을 이용해서 확인한 것으로서 병인세포인 Th17의 활성과 관련 있는 STAT3 727, 705 및 염증관련 분자인 pERK의 활성이 감소하였고, Treg의 신호전달 분자인 STAT5의 활성은 증가한 것을 나타낸다.
도 21은 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 소장의 조직 절편을 얻어 H&E 염색을 진행하여 염증세포의 증가와 융모의 모양을 관찰한 결과이다.
도 22는 코엔자임 Q10이 주입된 마우스의 대장에서 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, IL-17, TNF-a, IL-1b의 발현을 분석한 것이다.
도 23은 코엔자임 Q10이 주입된 마우스의 비장조직에서 Th17, 조절 Treg 세포를 공초점현미경을 통해 Foxp3, STAT3, mTOR, AMPK, STAT5, p53의 발현을 관찰한 것이다.
도 24는 코엔자임 Q10이 주입된 마우스의 장간막림프절(mesenteric lymph nodes: mLN)에서 Th17, 조절 Treg 세포를 공초점현미경을 통해 Foxp3, STAT3, mTOR, AMPK, STAT5, p53의 발현을 관찰한 것이다.
도 25는 퇴행성 골관절염을 유도한 실험동물군에 L-코엔자임 Q10을 처리하였을 때의 통증정도를 측정한 결과이다.
도 26은 퇴행성 골관절염을 유도한 실험동물군에 L-코엔자임 Q10을 처리하였을 때와 대조군으로 처리하지 않은 군의 연골 파괴 및 염증세포의 침윤을 확인하기 위하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색 및 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색으로 확인한 결과이다.
도 27은 coQ10이 이식 후 거부반응을 억제 할 수 있는지를 확인하기위해 시험관내(in vitro)에서 T세포 증식반응과 ELISA분석을 통하여 IL-17 발현양을 측정한 것이다.
도 28은 리포좀 코엔자임 Q10이 이식 후 거부반응을 억제할 수 있는지를 확인하기위해 T세포 증식반응과 ELISA 분석을 통해 IL-17과 IFN-r 발현양을 측정한 것이다.
도 29는 리포좀 코엔자임 Q10이 이식편대숙주질환을 억제할 수 있는지를 확인하기위해 이식편대숙주질환 동물모델에서 효과를 분석한 것이다.
도 30a는 코엔자임 Q10과 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 각각 농도별로 처리하였을 경우, alloreative T 세포 증식 반응 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30b는 코엔자임 Q10과 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 각각 농도별로 처리하였을 경우, 세포 내에서 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 코엔자임 Q10과 리포좀 형태의 코엔자임 Q10의 세포독성 여부를 확인하기 위해 농도별 처리에 따른 MTT 어세이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 32a는 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK 506 화합물을 각각 농도별로 단독 처리시 Treg 세포의 증식 여부를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 32b는 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK 506 화합물을 병용 처리할 경우, Treg 세포의 증식 여부를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 코엔자임 Q10과 FK506 병용투여에의 한 파골세포 분화 조절능을 보기 위해서 B6 마우스 골수세포에서 TRAP 양성인 세포를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 연골파괴와 관련 있는 Catabolic 관련 분자인 MMP1, MMP3, MMP13의 발현을 조사한 것으로서 MMP1, MMP3, MMP13 의 발현을 real time PCR로 관찰한 것이다.
도 35는 코엔자임 Q10의 이식편대숙주질환에 대한 효과를 분석하기 위해 이식편대숙주질환 동물모델에서 임상 점수 및 이식편대숙주질환의 생존률을 측정한 것이다.

본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.

코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 체내에서 합성되는 지용성 비타민류 물질로 영양소의 대사에 관여하며 항산화력이 비타민 E보다 우수한 것으로 알려져 있고, 비타민 Q(vitamin Q)라고도 한다. 화학식은 C₅₉H₉0O₄이고, 고등어, 꽁치, 정어리 등의 등푸른 생선과 현미, 계란, 두류, 시금치, 땅콩 등의 견과류에도 포함되어 있다 . 코엔자임 Q10은 육류 등의 음식을 통해 소량을 얻을 수 있으나 대부분은 체내에서 만들어지며, 코엔자임 Q10은 당질을 에너지로 바꾸어 혈당을 감소시키며 비타민 E와 같이 항산화 작용을 하여 세포막의 산화를 막고 산소 이용율을 높이는 작용도 한다. 또한 정자를 활성화 시키고 면역세포나 백혁구의 작용을 높이는 작용을 한다. 활성산소의 생성을 억제하는 항산화능이 우수하여 동맥경화나 고혈압과 같은 심혈관계질환, 암, 뇌출혈, 알츠하이머병, 당뇨병 등의 질병을 예방해 주는 효과도 있다고 알려져 있다.

한편, 면역 거부 반응이란 공여체에서 수용체에 접종 또는 이식된 이질적인 세포 또는 조직의 특이적인 면역반응에 의한 붕괴현상으로써, 이식항원을 달리하는 공여자로부터 이식한 이식편은 수용자의 면역학적 기작으로는 생착(生着)할 수 없으며, 이러한 거부반응은 세포성 면역 및 체액성 면역에 의해 야기된다. 피부나 고형종양의 이식에서는 거부반응의 주체가 세포성 면역인데, 즉, 이식 피부 편을 거부한 동물의 혈청의 이입은 수용하는 동물과 같은 이식편의 거부는 촉진하지 않지만 림프계 세포의 이입은 이식편의 생착일수를 단축한다. 또한, 신생아기에 흉선을 절제한 동물은 피부거부반응을 나타내지 않는데, 반면, 신장거부반응에는 거부반응의 주체로 액성항체도 작용하며, 특히 수용자가 이미 공여자 림프구에 대한 항체를 갖고 있는 경우에는 사구체에 미소혈전을 만들어 초급성 거부반응을 일으키게 된다. 이식 후 7~21일 사이에는 급성거부반응이 일어나게 되며 이때는 세포성 면역과 체액성 항체의 양자가 모두 관여한다. 또한, 이식 후 수 개월~수 년 후에는 만성거부반응이 일어나는데 이는 사구체 기저막에서의 면역글로불린과 C3의 침착에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다.

한편, 본 발명자들은 이러한 면역거부반응을 치료할 수 있는 새로운 치료제를 찾기 위해 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 면역거부반응에 의한 질환을 치료할 수 있는 효과가 있는지를 MTT 어세이 분석을 통해 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따라, 사람의 단핵구 세포에 코엔자임 Q10을 0.01uM 내지 30uM의 농도별로 처리하여 세포에 독성효과가 있는지를 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 코엔자임 Q10을 30uM 까지 처리한 군에서 차이가 없어 본 발명의 코엔자임 Q10에 세포독성이 일어나지 않았음을 알 수 있었다(도 1 참조).

나아가 본 발명은 코엔자임 Q10에 의한 Th17 세포 억제 및 Treg 세포 증가 효과를 알아보기 위하여, Th17/IL-17 세포와 Foxp3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과, 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 Th17 세포를 억제하고 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 증가시키는 것으로 나타났고(도 2 참조), Th0 조건으로 Th17을 유도한 뒤 코엔자임 Q10을 농도별로 처리하였을 때, Th17 세포를 억제하는 농도가 0.5uM 미만으로는 차이가 없어, 본 발명의 코엔자임 Q10을 0.5uM 미만으로 처리하였을 때 가장 효과적임을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한, 본 발명은 코엔자임 Q10에 의한 면역염증 반응 조절 효과를 알아보기 위하여, 본 발명의 일실시예에 따라 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰한 결과 Th17세포의 발현은 감소된 동시에 Treg의 발현은 증가된 것을 확인할 수 있었고(도 4 참조), 코엔자임 Q10에 의한 Th17과 Treg의 molecule을 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석한 결과, Th17 조건에 코엔자임 Q10을 처리한 세포에서 얻은 mRNA level의 IL-17, RORr T, CCL20은 발현은 감소되었고, Treg세포의 대표적인 마커인 Foxp3의 발현은 증가된 것을 관찰(도 5참조)할 수 있었다.

또한, 코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성(plasticity)를 확인하는 실험을 하여 FACS로 확인하였는데 그 결과 Th17 세포의 발현은 감소시키고 Treg의 발현양을 증가 시켰음을 관찰할 수 있었다. 이는 코엔자임 Q10이 Th17 세포를 Treg 세포로의 재분화 시킬 수 있음을 보여주는 결과(도 6참조)이다.

또한 Wild type의 B6 마우스의 비장세포에 coQ10을 처리하여 신호전달 분자의 분석을 Western blot 을 이용하여 Protein level 에서 관찰하였으며, 도 17에 나타난 것과 같이 코엔자임 Q10(coQ10)이 처리된 동물 마우스의 비장세포에서 coQ10에 의해서 조절되는 신호전달 분자를 조사하고자 western blot을 진행하였으며, coQ10이 처리된 비장세포에서 병인세포인 Th17의 활성과 관련 있는 STAT3 727, 705의 활성이 현저히 억제 되었으며, 또한 염증관련 분자인 pERK 또한 감소되었음을 확인 하였다. 염증 조절과 관련 있는 Treg의 신호전달 분자인 STAT5의 활성은 증가되어 있음을 확인 하였다.

나아가 본 발명은 코엔자임 Q10이 류마티스 관절염에 관한 치료 효과를 확인하는 실험을 하였다. 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과를 확인한 결과 코엔자임 Q10을 투여한 쥐의 관절과 연골의 파괴 정도는 정상적인 쥐와 유사하게 유지됨을 알 수 있었다(도 7 참조). 또한 류마티스 관절염 동물의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF 발현을 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따라 관절염 유발 후 36일이 지난 쥐의 관절에서 면역 조직화학 염색을 진행 한 후 발현의 정도를 확인한 결과 코엔자임 Q10을 투여한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF 발현이 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 8 참조). 또한, 류마티스 관절염 동물 모델에서의 체액성 면역반응 (humoral response)을 확인하기 위해 쥐의 비장에서 공초점형 (confocal) 염색으로 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 관찰한 결과 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소됨을 알 수 있었다(도 9참조). 또한 류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염을 유발 후 36일 지난 후 마우스를 치사시켜 비장세포를 얻어 Th17, Treg, IFN-r의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석하였다. 실험결과 도 18에 나타난 것과 같이 코엔자임 Q10을 처리한 경우 IFN-gamma 및 IL-17은 감소하였으며, 이와 반대로 Treg는 증가한 것을 확인하였다.

나아가 본 발명자들은 coQ10이 주입된 마우스의 비장조직에서 Th17, 조절 Treg 세포 분석을 confocal 현미경을 이용해서 확인하였으며, 도 19에 나타난 것처럼 coQ10이 주입된 동물의 비장조직에서 Th17 세포의 발현이 현저하게 억제 되었으며, Foxp3를 발현하는 조절 T 세포는 현저히 증가한 것을 확인하였다.

나아가 본 발명자들은 coQ10이 주입된 마우스의 비장조직에서 신호전달 분자의 분석을 confocal을 이용해서 확인하였으며, 도 20에 나타난 것처럼 coQ10이 주입된 마우스의 비장조직에서 병인세포인 Th17의 활성과 관련 있는 STAT3, 727,705의 활성이 현저히 억제되었으며, 또한 염증관련 분자인 pERK 또한 감소되었음을 확인하였고, 염증 조절과 관련 있는 Treg의 신호전달 분자인 STAT5의 활성은 증가되어 있음을 확인하였다

나아가 본 발명은 도 10과 같이 코엔자임 Q10을 투여한 본 발명의 일실시예에 따른 SKG 쥐의 관절에서 골파괴 기전과 관련 있는 TRAP, RANK, RANKL의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 관찰하였고, 코엔자임 Q10의 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclasto-genesis 분화 실험에서는 TRAP 양성인 세포가 코엔자임 Q10의 농도에 의존적으로 감소되고 있음을 관찰할 수 있었다. 또한, 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절을 확인하기 위하여 본 발명의 일실시예에 따라 코엔자임 Q10을 처리하여 3일간 배양 후 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석한 결과, 코엔자임 Q10을 투여한 마우스의 비장세포에서 Th17 조건과 비교하여 IL-17은 감소시키고 Treg의 발현은 증가시키는 것을 확인하였다(도 11 (A) 및 (B)참조). 또한 B6 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절 확인하기 위해 B6상기 실시예 4의 B6 쥐의 비장세포를 Th17 분화조건에 코엔자임 Q10을 처리하여 3일간 배양 후 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석하였고, 세포 배양 sup에서 Th17 관련 사이토카인인 IL-21과 TNF-a 를 측정한 결과 코엔자임 Q10을 처리한 경우 IL-21과 TNF-a이 감소한 것을 확인하였다(도 11 (C)참조).

나아가 본 발명은 코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과를 알아보기 위하여 본 발명의 일실시예에 따라 정상 쥐에 염증성 장 질환을 유도하고 코엔자임 Q10을 투여하여 몸무게 변화를 측정한 결과 코엔자임 Q10에 의해서 염증성 장 질환이 현저하게 억제되었고 따라서 코엔자임 Q10은 염증성 장 질환 동물 모델의 생체 내에서 질환 억제 효력이 뛰어남을 확인할 수 있었다(도 12(A) 및 (B)참조). 또한 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 코엔자임 Q10을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 소장의 두께 및 대장의 길이를 측정한 결과이다. 조직적 소견에서 대조군인 염증성 장 질환 유도 동물 모델의 소장은 coQ10 처리군보다 가늘어 진 것을 관찰할 수 있었고, 특히 대장의 경우 그 길이가 짧아진 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 결과로부터 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상상태와 같이 유지시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 12 (C) 및 (D)참조).

한편, 본 발명은 코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과를 알아보기 위하여 본 발명의 일실시예에 따른 Wistar rat의 관절 내에 골관절염을 유도한 후 아무것도 처리하지 않은 군과 코엔자임 Q10을 처리한 군의 Paw withdrawal latency와 역치(threshold)를 측정한 결과 코엔자임 Q10을 경구 투여한 군은 투여하지 않은 군에 비해 paw withdrawal latency 및 threshold가 높게 나왔는데(도 13참조) 이는 코엔자임 Q10을 경구투여한 군은 투여하지 않은 군에 비해 강한 자극에 대해서도 오래 견디는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따른 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, Toluidine blue, Sagranin O, H&E염색을 통한 조직학적 분석을 한 결과 코엔자임 Q10을 투여하지 않은 군에서는 연골의 파괴가 더 심하게 일어나 그 부위가 확인 되지 않을 뿐 아니라 뼈가 과형성되어 비정상적인 모습을 띠고 있음에 반해, 코엔자임 Q10을 경구투여한 군에서는 여전히 연골이 잘 유지되어 있음을 확인하였고 따라서 코엔자임 Q10이 연골의 파괴를 억제함으로써 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 알 수 있었다(도 14참조).

나아가 본 발명은 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, IL-15의 발현을 확인하기 위해 Matrix degrading enzyme matrix metalloproteinase-13과 염증성 cytokine의 발현을 확인한 결과 관절파괴 관련 분자인 MMP13의 발현과 pro-inflammatory cytokine인 IL-1b, IL-6, IL-15의 발현이 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 15참조). 또한, 골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따른 Wistar rat에 MIA주입 후 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과, 코엔자임 Q10이 catabolic factor인 INOS, Nitrotyrosine의 생성을 억제하고, glvcation end product인 RAGE의 발현을 억제함을 알 수 있었다(도 16참조).

이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 작용이 있음을 입증하였다.

그러므로 본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

또한, 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 병인세포인 Th17 세포를 효과적으로 억제(차단)하는 역할을 하고, 조절 T 세포(Treg)를 촉진 또는 증가시키는 역할을 할 수 있으므로, 코엔자임 Q10( coenzyme Q10) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하고 있는 조성물은 면역조절 이상으로 유발될 수 있는 면역 거부 질환의 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.001uM 내지 5uM일 수 있으며, 바람직하게는 0.01uM 내지 0.5 uM일 수 있다.

본 발명에서 상기 FK-506(Tacrolimus)은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.

FK-506(Tacrolimus : C44H69NO12)은 일본 북부지방 Tsukuba 지역에서 채취된 흙 시료로부터 얻은 미생물, Streptomyces tsukubaensis의 발효액에서 발견되었으며 면역 억제 효과를 가지고 있는 macrolide antibiotic이다. 현재 가장 널리 사용되는 면역억제제인 cyclosporin A (CsA)와 구조적으로는 다르지만, 그 작용 기전은 유사한 것으로 알려져 있는데, 즉 작용 세포의 유전자 발현을 억제하여 그 효과를 나타내며 세포 내에서 tacrolimus는 우선 FK506 결합 단백질 (FKBP: FK binding protein)이라고 불리는 일종의 immunophilin에 결합하여 calcineurin이라는 phosphatase (phosphatase 2B)의 활성을 억제한다.

이러한 calcineurin의 활성억제는 calcium 의존적인 경로들을 저해하는데 IL-2 유전자의 전사, nitric oxide synthase 활성화, 세포의 degranulation, apoptosis를 막게된다. 또한 Tacrolimus는 glucocorticoid 나 progesterone 같은 호르몬의 작용을 증가시켜 호르몬 수용체 complex 안의 FKBP들에 결합하여 세포의 degranulation을 방해한다. 한편 tacrolimus는 CsA와 마찬가지로 TGF-beta1 유전자 발현을 증가시킨다.

또한, 본 발명의 조성물에 함유된 상기 코엔자임 Q10 및 FK-506 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 코엔자임 Q10 및 FK-506 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 "면역 거부 질환"은 인체에 자신의 조직이 아닌 외부 이물질이 들어올 때 면역시스템이 이를 식별하여 제거하거나 공격하는 반응으로 다른 사람 또 는 다른 동물의 장기를 이식할 때 나타나는 질환을 의미한다.

이러한 면역 거부 질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 초급성 거부반응(hyperacute rejection), 급성 거부반응(acute rejection), 만성 거부반응(chronic rejection), 이식편대숙주질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 이식을 받는 측에 미리 혈청항체가 존재하고 있으면, 이식된 장기 또는 조직은 항원항체반응의 결과, 수 시간 내에 혈전이 형성되어 괴사에 빠지고 만다. 이것을 초급성 거부반응이라고 하며, 수혈이 행하여진 경우나 2회째의 이식 수술 시에 생긴다.

본 발명에서 급성거부반응이란 면역체계의 구성 요소 중 T세포에 의해 일어나는 반응으로 T세포는 외부 물질 중 단백질을 인지하고 그에 대한 항체를 만들 어 내는 기능을 한다. 이식된 기관을 구성하는 단백질 중 일부를 T세포가 항원으로 인지하고 항체를 만들며 만들어진 항체가 이식된 기관을 공격하는 과정에 의해 일어나는 질환을 말한다.

본 발명 에서 만성 거부반응이란 이식장기로부터의 숙주와는 다른 조직적 합성 항원에 대한 액성면역반응이 원인으로, 이식장기세포에 대한 항체(면역 글로불린)가 보체 등과 협동해서 상해를 준다. 신장이식의 경우에는 단백뇨, 혈압상승, BUN이나 혈청 크레아티닌의 상승이 서서히 일어나며, 수개월에서 수년에 걸쳐 신기능이 저하되는 질환을 말한다. 또한, 급성거절반응과 달리 부신피질호르몬 등의 면역억제제의 대량투여는 거의 무효 하며 일반적으로 비가역성이라는 점이 특징이다.

본 발명에서 "이식편대숙주질환(graft -versus-host disease, GVHD)"은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환을 말한다.

골관절염은(osteoarthritis)은 퇴행성 관절염으로 칭해지기도 하는 관절염의 일종으로서, 윤활 관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절염을 말한다. 즉, 골관절염은 관절 연골의 점차적인 소실과 더불어 연골 하방에 위치한 뼈의 비대, 관절 가장자리 부위의 골 생성, 및 비특이적인 활막 염증을 특징으로 하는 질환이다. 따라서, 골관절염은 체중을 많이 받는 관절, 즉 무릎(슬)관절, 엉덩이 (고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하게 된다.

퇴행성 관절염인 골관절염은 비만이거나 가족내력이 있을 경우 그 발병위험도가 높으며, 관절에 외상을 입었거나 감염, 무혈성 괴사 등의 질환을 앓았을 경우에도 발생할 수 있다. 또 남자보다는 여성의 발병률이 높은 편이다.

또한 골관절염은 대부분 고령의 환자에게 나타나며 노화와 연관된 다른 신체 변화가 퇴행성 관절염의 발생 위험을 높이기는 해도 노화 자체를 퇴행성 관절염의 원인으로 보기는 힘들다.

본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 모든 원인의 골관절염을 예방 또는 치료할 수 있으나, 보다 바람직하게는 노화와 연관된 노인성 골관절염의 예방 또는 치료에 효과적이다.

일반적으로 리포좀은 레시토이드(lecithoid) 이중 분자층으로 구성된 친수성의 포낭 방울로 이루어져 있으며, 캡슐화된 약물의 안정성을 개선시키고, 약물의 경피 흡수를 촉진시키고, 약물 작용 시간을 연장시키고, 신체의 병리학적 국소 변성 부위로의 약물 표적화를 조절하고, 약물의 부작용을 감소시키는 특징을 가지고 있다. 따라서, 리포좀은 약물 운반체로서, 약학 및 화장품 산업에서 널리 사용되고 있다.

그러므로 코엔자임 Q10을 리포좀화 시키면 약물 안정성을 개선시키고, 약물의 경피 흡수를 촉진시키고, 약물의 수용성을 증가시킬 수 있다. 그러나, 통상 리포좀 현탁액 유형인 CoQ10은 안정성이 매우 부족한 문제점이 있는데, 이는 리포좀은 콜로이드 미립자로서, 열역학적으로 불안정한 시스템의 한 유형이므로, 응집, 융합 및 침전되기 쉬우며, 레시토이드의 산화 분해, 수중에서의 캡슐화된 약물의 누출 등은 리포좀의 불안정성을 초래하며, 화학적 구조상 코엔자임 Q10은 수중에서 약물을 더 불안정하게 하는 문제점이 있다.

따라서 코엔자임 Q10의 약학적 효과를 극대화시키고 안정성을 유지할 수 있는 새로운 리포좀화 방법의 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 코엔자임 Q10의 리포좀화 방법으로서, 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및 인지질과 스테롤이 함유된 지질 용액을 유기용매에 용해하고, 상기 유기용매 용액에 고주파를 조사하여 리포좀 용액을 형성시키는 단계를 포함하는, 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법으로 제조한 리포좀 형태의 코엔자임 Q10은 리포좀의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 코엔자임 Q10의 약학적 효과를 극대화시킬 수 있고, 나아가 FK 506 화합물의 부작용을 최소화시킬 수 있는 장점이 있다.

특히 본 발명의 일실시예에 따르면, 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 코엔자임 Q10과 FK 506 화합물의 병용 처리 방법을 규명하였는데, FK 506 화합물은 종래 사용되고 있는 면역억제 용도의 화합물이나 체내 각종 부작용을 유발시키는 문제점이 있고, 본 발명의 일실시예를 통해서도 확인한 바 있는, Treg 세포의 활성 및 증식을 억제시키는 문제점이 있다.

특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.

또한, T 세포는 Treg 세포 이 외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

또한 Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.

앞서 기술한 본 발명의 일실시예에서는 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK 506의 면역 조절 효과 분석에 대해 면역 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성화 정도를 확인하기 위해, Foxp3 유전자의 발현정도 및 CD25+ 표지 항원을 가진 세포수를 측정하였는데, 이러한 이유는 Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지 시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3을 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다.

따라서 본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 일실시예의 결과를 통해, 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK 506 병용처리가 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에서 Foxp3의 발현이 증가됨을 확인함으로써, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 활성 또는 증폭시켜 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 본 발명은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)과 FK-506을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이때 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.1uM 내지 10uM의 농도로 포함되어 있고, FK-506은 1ug/ml 내지 10ug/ml의 농도로 포함되어 있는 것이 바람직하며, 상기 범위를 초과하거나 이에 미치지 못하는 경우 본 발명의 목적하는 효과를 얻지 못한다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법 "은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역 거부 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역 거부 질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역 거부 질환을 경감시킴.

(4) 면역 거부 질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역 거부 질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명의 약제학적 조성물은 유효 성분인 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 이외에, 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여 될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다.

상기 제형들은 약제학적 조성물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제, 충전물, 결합제, 습윤제, 분해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충액, 방부제, 용해보조제, 소독제, 감미료, 향신료, 진통제, 안정화제, 등장액제 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조 될 수 있다.

상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 카복시비닐 중합체, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 나트륨 녹말, 펙틴, 잔탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸글리콜, 바셀 린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소비톨 및 젖산 등이 있다. 한개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다. 더 나아가, 세포치료제 투여방법으로는, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에 표적세포로의 국소적 투여가 행해질 수 있으며, 카테터 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.

본 발명 의 조성물은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"이란, 치료하고자 하는 면역 거부 질환에 대해 완화, 억제, 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 유효성분의 양을 말한다. 본 발명의 코엔 자임 Q10(coenzyme Q10)의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통 한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 당 분야에서 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 상기 약제학적으로 유효한 양과 동일한 개념이다 .

나아가 본 발명은 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법 및 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시 키는 방법을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

코엔자임 Q10 의 세포독성 확인

본 발명자들은 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)에 세포독성이 있는 지 유무를 알아보기 위하여 MTT 어세이 시험방법을 수행하였다. 이를 위해 먼저, 사람의 단핵구 세포를 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신 (100㎍/㎖), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecos Modified Eagles Medium) 배지에 넣고 , 5% CO2 조건에서 37℃로 배양하였다. MTT 어세이를 위해, 상기 사람단핵구 세포는 96웰 플레이트(96 well plate)에 각 웰당 2×105개로 맞추어 분주하고 코엔자임 Q10을 농도별 처리(0 .01uM, 0.1uM, 0.5uM, 1uM, 5uM, 10uM, 30uM)하여 72시간 동안 배양한 다음, 이 후, MTT 용액(0.5% 3-4,5- dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 배양한 후 ELISA(enzyme -linked immunospecific assay) 측정기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 , 아무 것도 처리하지 않은 대조군과 코엔자임 Q10을 농도별로 처리한 군에서 큰 차이가 없는 것으로 보아 본 발명의 코엔자임 Q10에 세포 독성이 없음을 알 수 있었다(도 1 참조).

< 실시예 2>

코엔자임 Q10 에 의한 Th17 세포 억제 및 Treg 세포 증가 효과

사람의 단핵구 세포에서 분리한 CD4+ T cells 1×10 을 Th17 세포 분화 조건으로 자극하기 위해 48 웰 플레이트에 5X105씩 분주하고, anti-IL-4 2ug/ml, anti-IFNr 2ug/ml와 상기 세 포에 동시에 코엔자임 Q10을 농도별(0.01uM, 0.1uM, 0.5uM, 1uM, 5uM, 10uM) 두 시간 동안 전처리 배양하였다. anti-CD3 항체가 0.5μg/Ml 로 코팅(coating) 처리된 플레이트에 두 시간 전처리 배양한 세포를 옮기고 Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/mL, IL-1β 20ng/ml, IL-6 20ng/ml를 자극하고 72시간 동안 배양한다. 수집한 세포는 PerCP-anti-mouse CD4항체와 APC-anti-mouse-CD25 항체를 넣고 4℃에서 30분간 암시야에서 반응시킨 뒤 FACs buffer (0.002% sodium azide, 0.2% BSA/PBS)로 세척하고, 이 세포들을 Permwash buffer로 4℃에서 30분 암시야에 반응시킨 뒤 세척한 후 PE-anti-mouse-IL-17 항체와 FITC-anti- mouse-Foxp3로 4℃에서 30분 암시야에 반응 후 세척한다. FACs buffer에 재부유하여 Th17/IL-17 세포와 Foxp 3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 코엔자임 Q10(co enzyme Q10)이 Th17 세포를 억제하고 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 증가시킴을 알 수 있었고(도 2 참조), anti-CD3 0.5ug/ml항체를 두시간 전처리 하고 anti-CD28 1ug/ml로 자극한 Th0 조건에서 코엔자임 Q10을 농도별로 처리하였을 때, Th17 세포를 억제하는 농도가 0.5uM 미만으로는 차이가 없어, 본 발명의 코엔자임 Q10을 0.5uM 미만으로 처리하였을 때 가장 효과적임을 알 수 있었다(도 3 참조).

< 실시예 3>

인간말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10 을 이용한 Th17 / Treg 동 시 조절 및 면역염증 반응 조절 효과 확인

인간 말초혈액 세포에서 코엔자임 Q1 0을 이용한 Th17/Treg 조절 및 면역 염증 반응 조절 효과를 확인하기 위해 FACS, Real time PCR로 분석하였다.

<3-1> 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10 에 의한 Th17 세포와 Treg 의 발현 FACS 로 관찰

인간 말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10을 이용한 Th17/Treg 조절 및 면역염증 반응 조절 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다. 인간 말초단핵구 세포로 Th17세포로 분화를 유도하고 동시에 코엔자임 Q10으로 자극하여 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence -Activated Cell Sorter)를 사용하여 관찰하였다.

그 결과 도 4와 같이 Th17 조건에 코 엔자임 Q10을 처리 한 결과 코엔자임 Q10이 용량 의존적으로 Th17 세포의 발현은 감소된 동시에 Treg의 발현은 증가된 것을 확인할 수 있었다.

<3-2> 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q1 0에 의한 Th17 세포와 Treg 의 발현 Realtime PCR 로 관찰

인간 말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10을 이용한 Th17과 Treg 조절 및 면역염증 반응 조절 효과를 확인하기 위해, 인간 말초단핵구 세포로 Th17 세포로 분화를 유도하고 동시에 코엔자임 Q10으로 자극하여 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 T reg관련 분자(molecule)을 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석을 하였다.

그 결과 도 5와 같이 Th17 조건에 코엔자임 Q10을 처리한 세포에서 얻은 mRNA level의 IL-17, RORr T, CCL 20은 발현이 감소된 것으로 관찰되었고, Treg 세포의 대표적인 마커인 Foxp3의 발현은 코엔자임 Q10 10μM 에서 통계적으로 유의하게 증가 된 것을 관찰할 수 있었다.

<3-3> 코엔자임 Q1 0에 의한 Treg 의 가소성 확인 실험

코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성을 확인하기 위하여 인간 말초단핵구 세포에서 Treg 분화 유도후 3일 후에 다시 Th17 세포로 분화를 유도하고 동시에 코엔자임 Q10으로 자극하여 코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성(Plasticity)를 FACS(Fluorescence-Activ ated Cell Sorter)를 사용하여 관찰하였다.

그 결과 도 6과 같이 인간 말초단핵구 세포에서 Treg 분화를 유도한 후 상기 Treg 분화를 유도한 세포에 다시 Th17 세포로의 유도 조건과 이 조건에 코엔자임 Q10을 처리하였을 때 Th17세포의 발현은 감소시키고 Treg의 발현양을 증가 시켰음을 확인 할 수 있었다. 이는 코엔자임 Q10이 Th17세포를 Treg 세포로의 재분화 시킬 수 있는 능력을 보여주는 결과이다.

< 실시예 4>

코엔자임 Q10 을 이용한 류마티스 관절염 동 물모델 치료 효과 및 Th17 / Treg 동시 조절 및 면역염증 반응 조절 효과 확인

코엔자임 Q10을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과 및 Th17/Treg 동시 조절 및 면역염증 반응 조절 효과 확인을 위한 실험을 진행하기 위해 8주령의 SKG 쥐에 Zymosan 2mg/kg으로 I.P.에 주입하여 관절염을 유발시켰다. 상기 관절염을 유발시킨 8주령의 SKG 쥐에 코엔자임을 주 3회 경구 섭취하여 관절염을 유발 시켜 실험을 진행하였다.

<4-1> 류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q1 0에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인

류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염을 유발 후 36일 지난 후 마우스를 치사시켜 관절에서 연골의 파괴정도와 염증 세포의 침윤 정도를 관찰하기 위해서 H&E, Safranin o, Toluidine blue 염색을 진행하였다.

그 결과 도 7과 같이 관절염 평가는 마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 쥐 1 마리당 최고의 관절염 지수는 16점이 된다. 코엔자임 Q 10이 10mg/kg을 경구투여한 마우스는 관절염 지수가 억제됨으로써 류마티스 관절염의 치료활성을 나타내었으며 관절염 7일차부터는 관절염 지수가 유의성 있게 증가함을 관찰 할 수 있었다. 조직학적 검사 결과 관절염 관절에서 많은 염증 세포들의 침윤이 확인되었으며, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되는 반면, 코엔자임 Q 10을 투여한 마우스는 관절과 연골의 파괴정도가 정상 마우스와 유사하게 유지됨을 확인할 수 있었다. 또한 세포의 증식 정도를 각군의 비장세포에서 아무것도 자극하지 않은 Nil 조건과 anti-CD3 0.5㎍/㎖ 모두에서 코엔자임 Q10을 투여한 마우스에서 감소 되어있음을 확인할 수 있었다.

<4-2> 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10 에 의한 IL -21, IL -1b, IL -17, TNF -a, VEGF의 발현 확인

류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 IL-21, IL-1b, IL -17, TNF-a, VEGF의 발현을 확인하기 위해 상기 실시예 4의 쥐에 관절염 유발 후 36일이 지난 SKG 쥐를 치사하여 쥐의 관절에서 면역 조직화학 염색을 진행하였다.

그 결과, 도 8과 같이 염증성 Cytokine의 발현을 관찰하기 위해서 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현을 각 군의 관절에서 조사한 결과 proinflammatory cytokine인 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현이 코엔자임Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다.

<4-3> 코엔자임 Q10 에 의한 류마티스 관절 염 동물 모델에서 체액성 면역반응 ( humoral response ) 관찰

코엔자임 Q10에 의한 류마티스 관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응 (humoral response) 관찰하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염 유발 후 36일이 지난 SKG 쥐를 치사하여 쥐의 비장에서 공초점형 (confocal) 염색으로 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 관찰하였다.

관절염의 완화 기전에 코엔자임 Q10의 체액성 면역반응에 의한 영향을 관찰하기 위해서 마우스의 비장에서 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 조사한 결과, 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 9 참조)

<4-4> 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10 에 의한 골파괴 억제 기전 확인

류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 골파괴 억제 기전 조사하기 위해 상기 실시 예 4의 SKG 쥐에 관절염 유발 후 36일이 지난 SKG 쥐를 치사하여 골파괴 분화 조절과 관련 있는 TRAP, RANK , RANKL의 발현을 조사하였다. 또한, 코엔자임 Q10의 파골세포 분화 조절능을 보기 위해서 B6 마우스 골수세 포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 코엔자임 Q10을 처리하여 TRAP 양성 세포를 조사하였다.

그 결과, 도 10과 같이 코엔자임 Q10을 투여한 SKG 쥐의 관절에서 골파괴 기전과 관련 있는 TRAP, RANK , RANKL의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 관찰 하였다. 또한, 코엔자임 Q10의 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclasto-genesis 분화 실험에서는 TRAP 양성인 세포가 코엔자임 Q10의 농도에 의존적으로 감소되고 있음을 관찰할 수 있었다.

<4-5> B6 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10 에 의한 Th17 / Treg 조절 확인

B6 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔 자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절 확인하기 위해 B6상기 실시예 4의 B6 쥐의 비장세포를 Th17 분화조건에 코엔자임 Q10을 처리하여 3일간 배양 후 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석하였다.

그 결과 도 11(A) 및 (B)와 같이 코엔자임 Q10을 투여한 마우스의 비장세포에서 Th17 조건과 비교하여 IL-17은 감소시키고 Treg의 발현은 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 이 세포의 RNA를 얻어 mRNA 수준에서 Th17 관련 분자를 분석 한 결과 Th17 관련 분자가 코엔자임 Q10을 처리한 조건에서 모두 감소되어있음을 관찰하였다.

또한 B6 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절 확인하기 위해 B6상기 실시예 4의 B6 쥐의 비장세포를 Th17 분화조건에 코엔자임 Q10을 처리하여 3일간 배양 후 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석하였고, 세포 배양 sup에서 Th17 관련 사이토카인인 IL-21과 TNF-a 를 측정한 결과 도 11 (C)에 나타난 것과 같이 코엔자임 Q10을 처리한 경우 IL-21과 TNF-a이 감소한 것을 확인하였다

< 실시예 5>

코엔자임 Q10 을 이용한 염증성 장질환 치료 효과 확인

<6-1> 염증성 장질환 동물모델

코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과 확인을 확인하기 위하여 7주령의 C57/BL6 정상마우스에 2.5% DSS(dextran sulfate sodium)을 5일간 먹여 염증성 잘 질환 을 유도하고, 약물은 유도 0일부터 20mg/kg로 경구 투여하여 각 군의 몸무게 변화를 측정하였다.

그 결과 도 12 (A) 및 (B)와 같이 코엔자임 Q10에 의해서 염증성 장질환이 현저하게 억제되었으며, 함께 병용 투여한 군에서는 10% 이상의 질환 경감효력을 보였다. 따라서 코엔자임 Q10은 염증성 장질환 동물모델의 생체 내에서 질환 억제 효력이 뛰어남을 확인할 수 있었다.

또한 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 코엔자임 Q10을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 소장의 두께 및 대장의 길이를 측정하였으며, 도 12 (C) 및 (D)에 나타난 것과 같이 조직적 소견에서 대조군인 염증성 장질환 유도 동물 모델의 소장은 coQ10 처리군보다 가늘어 진 것을 관찰할 수 있었고, 특히 대장의 경우 그 길이가 짧아진 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 결과로부터 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상상태와 같이 유지시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 coQ10을 투여한 군에서 소장의 조직 절편을 얻어 H&E 염색을 진행하여 염증세포의 증가와 융모의 모양을 조직학적으로 관찰하였으며, 실험결과 도 21에 나타난 것처럼 염증세포가 억제되며, 소장의 융모가 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 coQ10이 주입된 마우스의 대장에서 염증성 사이토카인 발현을 조직학적으로 분석하였으며, 실험결과 도 22에 나타난 것처럼 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, IL-17, TNF-a, IL-1b의 발현이 현저히 감소함을 확인하였다.

<6-2> coQ10 이 주입된 마우스의 비장조직에서 Th17 , 조절 Treg 세포 분석

본 발명자들은 coQ10이 주입된 동물 마우스의 비장조직에서 Th17 세포와 조절 Treg 세포의 발현을 조직 컨포칼 분석을 이용하여 조사하였으며, 도 23에 나타난 것과 같이 coQ10이 주입된 동물의 비장조직에서 Th17 세포의 발현이 현저하게 억제 되었으며, Foxp3를 발현하는 조절 T 세포는 현저히 증가하였다.

또한 coQ10이 주입된 마우스의 비장조직에서 신호전달 분자의 분석하 기위해 coQ10이 주입된 동물 마우스의 비장조직에서 coQ10에 의해서 조절되는 신호전달 분자를 조사하고자 조직 컨포칼을 진행하였으며, 도 23에 나타난 것과 같이 coQ10주입된 비장 조직에서 염증관련 STAT3, mTOR의 활성이 현저히 억제되었으며, AMPK, STAT5,p53의 활성된 세포가 증가됨을 확인하였다.

나아가 본 발명자들은 coQ10이 주입된 마우스의 mLN에서 Th17, 조절 Treg 세포 분석을 위해 coQ10이 주입된 동물 마우스의 mLN에서 Th17 세포와 조절 Treg 세포의 발현을 조직 컨포칼 분석을 이용하여 조사하였으며, 도 24에 나타난 것과 같이 coQ10이 주입된 동물의 비장조직에서 Th17 세포의 발현이 현저하게 억제되었으며, Foxp3를 발현하는 조절 T 세포는 현저히 증가하였다. 또한 coQ10이 주입된 동물 마우스의 비장조직에서 coQ10에 의해서 조절되는 신호전달 분자를 조사하기 위해 조직 컨포칼을 진행하였으며, 도 24에 나타난 것과 같이 coQ10주입된 비장조직에서 염증관련 STAT3, mTOR의 활성이 현저히 억제 되었으며, AMPK, STAT5,p53의 활성된 세포가 증가됨을 확인하였다.

< 실시예 6>

코엔자임 Q10 을 이용한 골관절염 치료 효과 조사 및 염증 면역조절 효과 조사

코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과를 확인하기 위한 실험과 코엔자임 Q10이 골관절 염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하는 실험 및 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, Il-6, Il-15, INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 관찰 비교 분석하는 실험을 진행하였다.

<6-1> 골관절염 동물모델에서 코엔자임 Q10 에 의한 골관절염 치료 효과 확인

골관절염 동물모델에서 코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과 확인하기 위해서 6주령의 Wistar rat 의 오른쪽 무릎의 관절 내에 (intra-articular) 3mg/50㎕의 용량으로 MIA(Monosodium Iodoacetate)를 투여하여 골관절염을 유도하였다. 상기 MIA는 생리식염수에 용해시켜 투여하였다. 골관절염이 유도된 rat을 각각 6마리씩 2군으로 나누고, 아무것도 처리하지 않은 군(MIA만 처리)으로 하고, 두번째 군(MIA-코엔자임 Q10 군)은 코엔자임 Q10 100 mg/kg의 용량으로 면실유(cotton seed oil)에 용해시켜 매일 경구투여하였다. 행동력 측정은 Dynamic plantar aesthesiometer를 이용하여 rat의 뒷발에 자극을 주고 그에 대한 반응을 관찰하였다. Dynamic plantar aesthesiometer에 장착되어 있는 0.5mm의 직경의 침으로 20초 동안 50g의 힘으로 ra t의 발바닥에 직각방향으로 자극을 주어 rat이 해당되는 무게의 힘을 느끼고 발을 뗄 때의 초와 무게값을 얻어 Paw withdrawal latency와 역치(threshold)를 측정하였다.

그 결과 도 13과 같이 코엔자임 Q10 100mg/kg를 경구 투여한 군은 투여하지 않은 군에 비하여 paw withdrawal latency 및 threshold가 유의성 있게 높았다. 이러한 결과는 코엔자임 Q10을 경구투여한 군은 투여하지 않은 군에 비하여 강한 자극에 대해서도 오래 견디는 것을 나타낸다.

<6-2> 코엔자임 Q10 이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향 확인

코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향 확인하기 위하여 6주령의 Wistar rat에 MIA 주입 7일 후에 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, Toluidine blue, Sagranin O, H&E염색을 통한 조직학적 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 도 14와 같이 코엔자임 Q10을 투여하지 않은 군에서는 연골의 파괴가 더 심하게 일어나 그 부위가 확인되지 않을 뿐 아니라 뼈가 과형성되어 비정상적인 모습을 띠고 있음에 반해, 코엔자임 Q10을 경구투여한 군에서는 여전히 연골이 잘 유지되어 있음을 확인하였다. 따라서 상기 실험을 통해 코엔자임 Q10이 연골의 파괴를 억제함으로써 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.

<6-3> 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP -13, IL -1b, IL -6, IL -15의 발현 확인

골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, IL-6, IL-15의 발현을 확인하기 위해 6주령의 Wistar rat에 MIA 주입 7일 후에 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, 면역조직화학 염색법으로 MMP-13, IL-1b, IL- 6, IL-15의 발현을 관찰 비교 분석하였다.

그 결과 도 15에 나타난 바와 같이 코엔자임 Q10의 관절보호 및 치료 효과 메커니즘을 조사하기 위해서 Matrix degrading enzyme matrix metalloprotei nase-13과 염증성 cytokine의 발현을 각 군의 관절에서 확인한 결과 관절파괴 관련 분자인 MMP13의 발현과 pro-inflammatory cytokine인 IL-1b, IL-6, IL-15의 발현이 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다.

<6-4> 골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS , Nitrotyrosine , RAGE 의 발현 확인

골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 확인하기 위한 실험을 하였다. 6주령의 Wistar rat에 MIA 주입 7일 후에 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, 면역조직화학 염색법으로 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 비교 분석 하였다.

그 결과 도 16과 같이 코엔자임 Q10이 catabolic factor인 INOS, Nitrotyrosine의 생성을 억제하고, glycation end product인 RAGE의 발현을 억제함을 나타내었다.

따라서, 코엔자임 Q 10이 골관절염 치료 효과가 우수하므로 노인성 골관절염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

리포좀 형태의 코엔자임 Q10 제조

단일이중층의 리포좀은 고주파 조사(sonication)를 이용하여 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 제조하였다. 탐침을 코엔자임 Q10을 함께 지질분산액이 들어있는 용액속에 직접 담그고 고주파를 조사하면 커다란 에너지 유입이 일어나고 분자들의 운동에 제약을 받으므로 구조적인 결합을 가진 리포좀이 만들어진다. 일정한 고주파 조사에 따라 탁도와 점도가 감소하여 리포좀은 투명해지면서 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 제조하였다.

< 실시예 8>

퇴행성 골관절염동물 모델 제작

본 발명자들은 리포좀 형태의 코엔자임 Q10이 퇴행성 골관절염의 예방 및 치료에 효과가 있는지를 알아보기 위하여 먼저 퇴행성 골관절염 모델을 제작하였다. 200 ~ 250g인 5주령 수컷 Wistar rat(중앙실험동물)으로 각 군당 3마리씩 배정하여 하기 실험을 진행하였으며, 실험동물은 21 ~ 22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 해주었고 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 또한, 램덤으로 각 군에 들어갈 동물을 배정하였다.

퇴행성 골관절염 유도를 위해 3mg의 monosodium iodoacdtate(Sigma, ST. Louis, MO)를 오른쪽 무릎의 관절내에(intra-articular) 26.5G 주사기를 사용하여 50ul씩 주입하여 퇴행성 골관절염 유도된 실험동물을 제작하였다.

< 실시예 9>

코엔자임 Q10 처리에 따른 퇴행성 골관절염 개선 정도

본 발명자들은 실시예 2에서 제작된 퇴행성 골관절염 유도된 실험동물에 실시예 7에서 제조한 리포좀 형태의 L-코엔자임 Q10을 100mg/kg 투여하였으며, 대조군으로는 L-코엔자임 Q10을 녹일 때 사용하는 컨트롤 오일(control oil)을 매일 200ul씩 경구 투여하였다.

퇴행성 골관절염의 정도를 파악하기 위한 방법으로 Dynamic plantar aesthesiometer (Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 통증측정을 진행하였는데 본 기계의 통증측정 방법은 측정 기계 위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물 고정틀 안에 측정할 실험동물을 넣은 후 측정기계로 약물이 주입된 오른발에 찔러주었다. 찌른 후에 기계가 자동적으로 발을 떼는데 걸리는 시간(초)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(g)를 측정하여 나타내게 되는데 그 때 나오는 시간과 무게를 기입하여 통증측정 그래프를 그렸다.

퇴행성 골관절염 동물모델을 대상으로 통증 측정을 한 결과, 본 발명의 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 주입한 군에서는 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 주입하지 않은 대조군에 비해 통증정도가 현저히 감소됨을 알 수 있었다(도 25 참조).

< 실시예 10>

조직학적 검사

퇴행성 골관절염을 유발시킨 후, 7일 후에 실험동물을 치사시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀으로 블록을 만들었다. 관절 절편(7um)을 준비하고 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 관절 절편을 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시하였다.

그 결과, 다른 군의 실험동물군보다 본 발명의 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 주입한 군에서 연골의 파괴 및 염증세포의 침윤이 현저히 감소됨을 알 수 있었다(도 26 참조).

< 실시예 11>

<11-1> 이식 후 거부반응에 대한 억제 활성 분석

coQ10이 이식 후 거부반응을 억제 할 수 있는지를 확인하기 위해 시험관내(in vitro)에서 96well roundbottom plate 내 각 웰당 2x10⁵개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T 세포와 2x10⁵개의 방사선으로 조사시킨 수여자 (동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래 T 세포 제거 비장세 포를 넣고 혼합 배양시켰다. 이때 동종이형반응에 메트포민(coQ10) 처리하지 않거나 처리한 후 함께 4일간 배양한 후 배양된 세포에서 T 세포 증식 반응과 그 배양액에서 ELISA로 IL-17 발현을 조사하였다.

그 결과 도 27에 나타난 것처럼 coQ10의 농도 의존적으로 T 세포의 이식 후 거부반응을 억제 하였으며, IL-17의 발현을 현저하게 억제하였다. 따라서 coQ10은 T 세포의 이식 후 거부반응을 효과적으로 억제 할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

나아가 Lipo coQ10이 이식 후 거부반응을 억제 할 수 있는지를 확인하기위해 시험관내(in vitro)에서 96well roundbottom plate내 각 웰당 2x10에 5승개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T 세포와 2x10⁵개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래 T 세포 제거 비장세 포를 넣고 혼합 배양시켰다. 이때 동종이형반응에 메트포민(Lipo coQ10) 처리하지 않거나 처리한 후 함께 4일간 배양한 후 배양된 세포에서 T 세포 증식 반응과 그 배양액에서 ELISA로 IL-17과 IFN-r 발현을 조사하였다.

그 결과 도 28에 나타난 것처럼 리포좀 코엔자임 Q10의 농도 의존적으로 T 세포의 이식 후 거부반응 을 억제 하였으며, IL-17과 IFN-r의 발현을 현저하게 억제시킴을 알 수 있었다. 따라서 Lipo coQ10은 T 세포의 이식 후 거부반응을 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

따라서, 리포좀 코엔자임 Q10은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemiareperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graftversus-host disease) 등의 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

<11-2> 리포좀 코엔자임 Q10 ( Lipo - CoQ10 )의 이식편대숙주질환 동물모델에 대한 효과 분석

본 발명자들은 이식편대숙주질환과 같이 면역거부반응에 의한 질환에 있어서 Lipo-CoQ10기존의 CoQ10과 비교하여 이러한 질환들의 치료효과를 확인하기 위해, 이식 편대숙주질환 동물모델에서 Lipo-CoQ10에 의한 임상 점수 및 이식편대숙주질환의 생존률을 측정하였다. 이를 위해 우선 이식편대숙주질환(Graft-versus-Host Disease; GvHD) 모델을 제작하였는데, 수여자로써 BALB/c (H-2k/d) 마우스를 사용하고, 공여자로써 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하여, 골수이식 당일 날 호스트에 골수박멸형 전처치로 전신방사선조사(Total body irradiation; TBI)을 800cGy

조사 하고, 공여마우스 C57BL/6 (H-2k/b)에서 분리 한 골수 세포(5X106)와 비장세포(8x106)를 꼬리 정맥에 주사하여 골수이식을 수행하였으며, 이식 전 비장세포는 Lipo-CoQ10기존의 CoQ10을 2시간동안 처리하였다.

그 결과, 도 29에 나타난 것처럼, 시간이 경과할수록 Lipo-CoQ10을 주입받은 마우스는 대조군인 이식편대숙주질환 모델에 비해 임상 평가 점수가 낮아지는 것을 관찰할 수 있었고, Lipo-CoQ10이 기존의 coQ10보다 이식편대숙주질환에 대한 생존을 증가시켰다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 Lipo-CoQ10이 이식편대숙주질환의 증상을 조절하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 활성을 통해 면역거부 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 리포좀 형태의 코엔자임 Q10은 관절염 및 이식편대숙주질환의 예방 및 치료에 효과적이며 특히 퇴행성 골관절염의 치료에 효과가 있음을 확인하여 노인들을 대상으로 한 관절염의 치료에 더욱 효과가 있을 것으로 판단된다.

< 실시예 12>

<12-1> 리포좀 형태의 코엔자임 Q10 이 동종반응성 T 세포 반응에 미치는 영향분석

본 발명자들은 림프구 혼합배양 방법을 통해, 상기 실시예 1에서 제조한 리포좀 형태의 코엔자임 Q10이 동종반응성 T 세포에 미치는 영향을 조사하였다.

즉, 림프구 혼합배양을 위해, 먼저 In vitro에서 96웰 둥근 바닥 플레이트 내에 각 웰 당 2x105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T 세포와 2x105개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래 T 세포 제거 비장세포를 각각 넣고 혼합 배양시켰다. 이때 동종이형반응에는 코엔자임 Q10과 리포좀 형태의 CoQ10(Lipo-CoQ10)을 농도별로 각각 처리한 후 4일 동안 배양시켰다.

배양 후 , 배양액 내의 사이토카인 수준(IL-17)을 ELISA 측정방법을 통해 분석하였으며, CD4+T 세포나 사이토카인의 발현은 유세포기를 통하여 분석하였다. 또한 배양 마지막날 [3H]-thymidine을 첨가하여 18시간 추가 배양한 뒤 세포를 모은 다음 T세포 증식반응을 관찰하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 실시예 7에서 제조한 본 발명의 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 세포독성이 있는지 유무를 알아보기 위하여 MTT 어세이 실험을 수행하였다. MTT 어세이 분석은, 상기 실험에 사용되 세포들을 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) 배지에 넣고, 5% CO2 조건에서 37℃로 배양한 다음, 상기 세포를 96웰 플레이트(96 well plate)에 각 웰당 2×105개로 맞추어 분주하고 코엔자임 Q10 및 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 농도별 처리(0.2uM, 0.1uM, 1uM, 5uM)하여 72시간 동안 배양한 다음, 이후, MTT 용액(0.5% 3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 배양한 후 ELISA(enzyme-linked immunospecific assay) 측정기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 30a에 나타낸 바와 같이, 동종동형의 배양과 달리 동종이형의 반응이 유도되었을 때 CD4+ T세포가 현저히 증가되는 것으로 나타났으며, 이때 코엔자임 Q10 및 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 처리한 결과, 코엔자임 Q10 처리 시에는 Alloreactive T 세포 증식반응이 억제되지 않았으나, 리포좀 형태의 CoQ10을 처리한 경우에는 처리 농도 의존적으로 T 세포 증식반응이 억제되는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, 배양액 내에서 생성된 염증성 사이토카인인 IL-17의 수준 또한 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 처리하였을 경우가 코엔자임 Q10을 처리하였을 경우에 비해 유의하게 감소되는 것으로 나타났다(도 30b 참조).

나아가, MTT 분석을 통한 세포 독성 테스트 결과, 코엔자임 Q10 및 리포좀 형태의 코엔자임 Q10 모두 세포에 특별한 독성을 유발시키지 않는 것으로 나타났다(도 31 참조).

<12-2> 코엔자임 Q10 과 FK506 복합투여에의한 파골세포 분화 조절능을

코엔자임 Q10과 FK506 복합투여에 의한 파골세포 분화 조절능을 확인하기 위해서 B6 마우스 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 코엔자임 Q10 또는 코엔자임 Q10과 FK506을 동시에 처리하여 TRAP 양성 세포를 조사하였다.

실험결과 도 33에 나타난 것처럼 코엔자임 Q10과 FK506(단위 Nm)의 병용 처리에 의한 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclastogenesis 분화 실험에서는 TRAP 양성인 세포가 코엔자임 Q10과 FK506의 농도에 의존적으로 감소되고 있음을 관찰할 수 있었다.

나아가 연골파괴와 관련 있는 Catabolic 관련 분자인 MMP1, MMP3, MMP13의 발현을 조사하였으며, 시험관내 실험으로 인간 유래 chondrocyte를 전처리 24시간으로 세포 안정화를 시킨 후에 IL-1b를 자극하여 세포의 활성을 촉진시킴과 동시에 코엔자임 Q10 단독과 또는 FK506 병용처리한 후 24시간 배양 후에 세포에서 RNA를 얻어 MMP1, MMP3, MMP13 의 발현을 real time PCR로 관찰 하였다.

실험결과 도 34에 나타난 것처럼 coQ10 단독보다 FK506 병용처리에 의해서 MMP1, MMP3, MMP13의 발현이 감소된 것을 확인하였다.

< 실시예 13>

<13-1> 리포좀 형태의 코엔자임 Q10 에 의한 Treg 세포 증가 및 활성 증대 효과

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK506을 병용 처리할 경우, 조절 T 세포(Treg)의 증식 또는 활성을 더 향상시킬 수 있는 지 확인하기 위해, DBA1/J 정상 마우스군으로부터 CD4 T 세포를 분리하였고, 분리된 세포를 Treg 세포로 3일 동안 분화시켰으며, 분화된 세포인 Treg에서 분비되는 Foxp3를 유세포기(FACs)로 관찰하였다. 또한, 이때 리포좀 코엔자임 Q10과 FK506은 각각 다른 농도로 처리하여 처리 농도에 따른 Treg 활성 여부를 조사하였으며, 대조군으로 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK506을 각각 단독 처리한 군을 사용하였다.

그 결과, 도 32a에 나타낸 바와 같이, Alloresponse 유도시 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 단독 처리한 결과, 처리 농도 의존적으로 Foxp3+ Treg이 증가되는 것을 관찰하였다. 반면에 면역억제제로 사용되는 FK-506(Tacrolimus)는 Alloreactive T 세포 증식뿐만 아니라 Treg의 수도 농도 의존적으로 감소시키는 부작용이 발생하는 것으로 나타났다.

한편, 이러한 FK-506의 부작용을 보완할 수 있는지 확인하기 위해 본 발명의 리포좀 형태의 코엔자임 Q10과 FK-506을 함께 처리한 군의 경우, 이들을 각각 단독처리한 군에 비해 Treg가 월등하게 증가되는 것으로 나타났다(도 32b 참조).

<13-2> CoQ10 이 이식편대숙주질환 동물모델에서 대한 효과

나아가 본 발명자들은 이식편대숙주질환과 같이 면역거부반응에 의한 질환에 있어서 CoQ10이 이러한 질환들의 치료효과를 확인하기 위해, 이식 편대숙주질환 동물모델에서 CoQ10에 의한 임상 점수 및 이식편대숙주질환의 생존률을 측정하였다. 이를 위해 우선 이식편대숙주질환(Graft-versus-Host Disease; GvHD) 모델을 제작하였는데, 수여자로써 BALB/c (H-2k/d) 마우스를 사용하고, 공여자로써 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하여, 골수이식 당일 날 호스트에 골수박멸형 전처치로 전신방사선조사(Total body irradiation; TBI)을 800cGy 조사 하고, 공여마우스 C57BL/6 (H-2k/b)에서 분리 한 골수 세포(5X106)와 비장세포(8x106)를 꼬리 정맥에 주사하여 골수이식을 수행하였으며, 이식 전 비장세포는 Lipo-CoQ10기존의 CoQ10을 2시간동안 처리하였다.

그 결과 도 35에 나타난 것처럼 시간이 경과할수록 CoQ10을 주입 받은 마우스는 대조군인 이식편대숙주질환 모델에 비해 임상평가점수가 낮아지는 것을 관찰할 수 있었고, coQ10이 이식편대숙주질환에 대한 생존을 증가시켰다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 CoQ10이 이식편대숙주질환의 증상을 조절하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 활성을 통해 면역거부 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 본 발명에서 제조한 리포좀 형태의 코엔자임 Q10을 FK-506과 함께 병용 처리한다면, FK-506의 의한 부작용을 최소할 수 있을 뿐만 아니라, 이들 단독 처리에 비해 Treg의 수도 월등히 증가시킬 수 있어 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (23)

1. 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나 또는 TH17, RORr T, CCL20의 발현을 감소시키거나 또는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.001uM 내지 5uM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 면역 질환의 예방 또는 치료 효과는 체액성 면역반응(humoral response)을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 체액성 면역반응은 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 염증성 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 강직성 척추염, 건선관절염, 세균성 관절염, 소아기 류마티스 관절염, 재발류마티스, 류마티스 다발근육통증, 라임 관절염, 유착 관절낭염 또는 염증성 장질환인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 염증성 장질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장궤양 및 회장낭염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 면역 질환은 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemiareperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graftversus-host disease) 및 미토콘드리아 관련 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a 또는 VEGF 발현 감소 효과, 파골세포의 분화 억제 효과 또는 골(연골)보호 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 골보호 효과는 TRAP(tartrate-resistant acid-phosphatase), RANK(Receptor activator of nuclear factor kappa-B) 또는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor k appa-B ligand)의 발현 감소를 통한 것임을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
11. 시험관(in vitro )내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T ce ll: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 조절 T 세포를 활성화시키는 방법은 조절 T 세포에서 Foxp3의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조절 T 세포를 활성화 시키는 방법.
13. 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 Th17 세포에 처리하여 Treg 세포로 재분화 시키는 방법.
14. 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
15. 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
16. 제15항에 있어서,
    상기 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 지질분산액이 들어있는 용액 속에 직접 담그고 고주파를 조사하여 제조된 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
17. 제15항에 있어서,
    상기 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 INOS 또는 MMP13의 생성을 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-1 bata의 발현을 감소 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
18. 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)과 FK-506을 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
19. 제18항에 있어서,
    상기 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키며, FK-506에 의한 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 감소를 억제시키는 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
20. 제18항에 있어서,
    상기 면역거부 질환은 기관 또는 조직의 이식편거부반응; 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응; 또는 동종이식 거부반응인 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
21. 제15항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.1uM 내지 10uM의 농도로 포함되어 있고, FK-506은 1ug/ml 내지 10ug/ml의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
22. 리포좀 형태의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 노인성 골관절염 질환 및 면역거부 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
23. 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및/또는 FK506을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.

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