JPWO2002056911A1 - 移植拒絶反応抑制剤 - Google Patents

Abstract

ヒトから分離、採取した体液／細胞試料を用いて、マクロファージ細胞内の酸化型及び／又は還元型グルタチオン含量を検定することにより、マクロファージをそれぞれ異なった機能を有する酸化型マクロファージと還元型マクロファージとに分類し、その存在割合を、特定の低分子化合物で酸化型マクロファージに人為的に偏位させたり、還元型マクロファージを人為的に除去することで、ヒトの臓器移植拒絶反応の抑制治療に有効な医薬品として使用可能な臓器拒絶反応抑制剤を提供し、またそのための前記活性成分の使用や移植拒絶反応抑制方法を提供する。

Description

技術分野
本発明は、マクロファージ（以下、「Ｍφ」と記すことがある。）、単球や樹状細胞の機能の斬新な制御方法に関し、特に、ヒトの臓器移植に随伴する急性、慢性の拒絶反応を抑制することを目的とした経口摂取できる移植拒絶反応抑制剤及びそれを利用した医薬品（経口用薬剤、点眼薬、輸液等）並びにその活性作用を有する飲食品、栄養剤等に関する。更に、本発明は移植拒絶反応抑制方法やその特定活性成分の移植拒絶反応抑制剤への使用等にも関する。
背景技術
免疫系は、ウイルス、細菌等の外部からの感染、又は自己由来細胞が異常を来たすことで生成する細胞（癌細胞等）による生体侵襲から自己を防衛するためのシステムである。しかしながら、この免疫系が異常を来たし、過剰に働いたり、自己成分を排除する方向に免疫系が働いたりすると共に、逆に、排除機能が不全状態に陥ることがある。このような状態を惹起する疾患は総称して免疫性疾患と呼ばれる。例えば、アトピー性皮膚炎、花粉症、喘息、ザルコイドーシス等の急性並びに慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、慢性関節リウマチ、糖尿病（ＩＤＤＭ）、ＳＬＥ、慢性疲労性症候群等の自己免疫疾患や、肝炎、肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病等消化管炎症（ＩＢＤ）、癌悪液質状態等、数多くの疾患が含まれる。これら免疫性疾患の原因は様々であるが、サイトカインや、炎症性メディエーターの局所での産生を介して、特定の細胞の増殖、分化、壊死を伴う炎症を引き起こすことを発端として全身性の免疫不全、機能不全状態に到る。一方、腎臓、肝臓、心臓、肺臓、皮膚、角膜等種々の臓器移植反応に際しては生体の有する免疫応答反応により移植片が拒絶され、脱落することがよく知られている。
免疫を担当する細胞としてはＴリンパ球、Ｂリンパ球がよく知られ、各々細胞性免疫、液性免疫の担い手として多彩な機能を発揮する。一方、マクロファージ／単球（樹状細胞、ランゲルハンス細胞を含む。）は細胞性免疫及び液性免疫に深く関与する細胞で、アレルギー、リウマチ等の免疫性疾患、癌、細菌感染、移植組織等の非自己である異物排除に深く関わっている。マクロファージ／単球の機能は、分泌機能、抗原呈示を中心とした免疫調節機能、異物、老廃物の処理、貪食機能、標的細胞の障害処理機能の４種に大別され、ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、ＩＬ−１８等のサイトカイン、ネオプテリン（ＮＰＴ）、ジハイドロキシエピアンドロステン（ＤＨＥＡ）等のホルモン様分子、ＰＧＥ２やＬＴＢ４等のアラキドン酸代謝産物、Ｃ５ａ、Ｃ３等の補体系分子、活性酸素、活性窒素等、炎症像を規定する種々の分子を産生することが知られている。これらの多彩な機能が単一のマクロファージ／単球によって担われているのか、機能を異にするマクロファージ／単球集団によって担われているのかは不明であり、リンパ球がその細胞表面マーカーによって分類され、その機能との対応が明確になっているのに対し、マクロファージ／単球の機能の多様性と細胞亜集団の対応については全く不明である。このため、上述のような炎症性、アレルギー性、免疫性疾患の発症や臓器移植後の拒絶反応の病態進展に、マクロファージ／単球は極めて重要な役割を有しているにも拘らず、マクロファージ／単球細胞亜集団の存在を想定しての機能分類によるヒトの疾患の治療、改善、予防や、特に移植分野への応用は全くなされておらず、想定されたことすらなかった。
近年、末梢血中のヘルパーＴ細胞亜集団のタイプの片寄りが疾患と対応づけられつつあり、Ｔリンパ球中の亜集団であるヘルパーＴリンパ球が更に二つの亜集団Ｔｈ１とＴｈ２に分類され、その２種の存在比が生体の免疫機能の重要な指標になることが立証されつつある。本指標を基に疾患の病態を診断したり、その存在比を改善することにより、より適切な治療法を樹立しようとの試みがなされつつある。即ち、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を引き起こすＴｈ２がＴｈ１より多い場合（Ｔｈ１＜Ｔｈ２）、アレルギー性疾患が悪化することが分かってきており、Ｔｈ１／Ｔｈ２を測定することにより、免疫の状態を検定したり、Ｔｈ１＞Ｔｈ２にすることによりアレルギーを抑制しようとする試みがなされつつある。逆に、Ｔｈ１が支配的な状況で引き起こされる疾患、生体反応の存在も慢性関節リウマチや移植拒絶反応を始め、次々に指摘されつつある。
発明の目的
生物材料を用いてＴｈ１とＴｈ２のバランスを測定し、Ｔリンパ球を標的にこの２つの亜集団の機能を調節しようとしても、局所慢性炎症やアレルギー性疾患の検定、診断に利用することには、現在のところ、成功していない。最近、Ｔｈ１病やＴｈ２病という用語も用いられるが、必ずしも二者に明確に区別できないのが実態である。
Ｔｈ１／Ｔｈ２の存在比は、リンパ球亜集団の指標でしかなく、リンパ球亜集団の生体内での動態は本発明で取り扱うマクロファージ、単球を初めとするアクセソリー細胞と呼ばれる樹状細胞やランゲルハンス細胞等の細胞群の機能と実際には複雑に関わっているため、Ｔｈ１／Ｔｈ２の存在比だけで疾患の病態を適切に診断し、その情報を基に治療することは困難である。後述するが、マクロファージ／単球の機能状態によってＴｈ１／Ｔｈ２のバランスは制御されているのである。治療のためにＴｈ１＞Ｔｈ２に傾斜させることを意図しても、それだけでは複雑なサイトカインネットワークにおいては効果が得難く、新たな診断、治療のための指標が待ち望まれている。
炎症反応、拒絶反応に深く関与しているマクロファージにおいて、酸化ストレス、サイトカイン刺激、ウイルス、細菌感染等の環境因子により細胞の機能が変化することが判明しているが、その機能とマクロファージの細胞亜集団分類の対応については全く不明である。それら機能、分類において新たな知見が必要であり、それらの知見が得られることにより、飛躍的に有用な新たな治療方法の開発に繋がる。
発明の開示
本発明者等は、前記課題解決に向けて鋭意検討した結果、次のような各種の知見を得た。即ち、組織傷害作用の強いマクロファージ／単球／樹状細胞と、組織修復に関わるマクロファージ／単球／樹状細胞との区別を、マクロファージ／単球／樹状細胞のレドックス状態の相違から試み、それを可能とした。その指標としてはマクロファージ／単球／樹状細胞内の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）含量を採用する。
グルタチオンは、ほ乳類のあらゆる細胞に存在し、内因性の抗酸化物質としてよく知られ、細胞内においてラジカルや過酸化物の除去、プロスタグランジン等のエイコサノイドの代謝、生体異物の解毒、アミノ酸輸送等多様な機能を有しているトリペプチドである。還元型（ＧＳＨ）と酸化型（ＧＳＳＧ）が存在し、両者間で共役サイクルを形成する。通常の細胞では、ＧＳＨの濃度は還元状態の方が圧倒的に多く、酸化ストレス、特にＨ_２Ｏ_２に対して防御的に作用する。
既に、Ｒｕｄｅ等は、ＧＭ−ＣＳＦにより分化したマクロファージと、Ｍ−ＣＳＦにより分化したマクロファージでは、細胞内ＧＳＨ濃度は前者の方が高濃度であることから、細胞内ＧＳＨ濃度の相違がマクロファージの機能に関与している可能性を報告（Ｇｅｒｍａｎｎ，Ｔ．，Ｍａｔｔｎｅｒ，Ｆ．，Ｐａｒｔｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＴＨ１　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｒ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：７５５，１９９２；Ｆｒｏｓｃｈ，Ｓ．，Ｂｏｎｉｆａｓ，Ｕ．，Ｅｃｋ，Ｈ．−Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｂｏｖｉｎｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｒｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｉｏｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：４３０，１９９３）しているが、本発明者等は、マクロファージ／単球中の還元型ＧＳＨ含量を測定すると共に、ＧＳＨ含量を異にするマクロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のあることや、この測定法で生体の免疫能を検定しその酸化還元状態を経口投与可能な特定の低分子化合物で人為的に調整できることを見出し、更に本法を臓器移植に随伴する急性並びに慢性の拒絶反応の抑制という治療行為に活用することができ、また、特にそのために使用する物質（前記特定の低分子化合物）を特定の薬剤、例えば医薬品として広範に応用できること並びにそのような活性を示すものとして飲食品や栄養剤中に含めて使用できることを見出した。
本発明者等は、更に上記知見に基づき、更に研究を重ねた結果、炎症反応に重要な役割を果たしているマクロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロファージ集団が二つのタイプ、即ち酸化型マクロファージと還元型マクロファージとに分類することができ、還元型マクロファージが免疫疾患に伴う局所組織炎症や臓器拒絶反応反応を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバランスに関与するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファージの酸化還元状態によって制御されていること、当該マクロファージの酸化還元状態が臓器拒絶反応の病態に重要な役割を果たしており、当該酸化還元状態を検定し、その状態を人為的に制御、修飾することにより、当該病態の診断及び、治療に役立つこと、しかもその制御が、前記の如く経口摂取可能な低分子化合物によって簡便に行えることを見出した。
現在、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＩＬ−６、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−４とＩＬ−１２が生体内でどのような割合で産生されるかによって規定されると考えられている。前３者によって液性免疫に関与するＴｈ２が、ＩＬ−１２によって細胞性免疫に関与するＴｈ１が誘導されることが既に知られている。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２はマクロファージから産生されることは判明しているが、同一のマクロファージ細胞がＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２の全てを産生するとすると、Ｔｈ１誘導にもＴｈ２誘導にも関与する１種のマクロファージが存在することとなり、生体の免疫応答を考えるに当り大きな矛盾にぶつかる。本発明者等はＧＳＨ含量の高い還元型マクロファージによってのみＩＬ−１２が産生され、Ｔｈ１偏位が起こり、酸化型マクロファージによってはＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生が亢進し、Ｔｈ２偏位が誘導されることを見出した。また、Ｔｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγが産生されてもマクロファージが酸化型に傾斜していると、ＩＦＮγの作用でＴｈ２を誘導するＩＬ−６が大量に産生されることも見出された。
逆に、還元型マクロファージが存在するとＴｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγによってマクロファージの還元型形質が一層増強されることも判明した。酸化型マクロファージが誘導されているところにＴｈ２サイトカインの代表であるＩＬ−４が作用すると酸化型マクロファージの形質が益々増強される。これらの知見は液性免疫と細胞性免疫という対局にある免疫応答がマクロファージの酸化還元状態によって一義的に規定されていることを示すもので、免疫学の根幹に関わる重要な知見である。この知見を臓器移植拒絶反応の抑制に応用し、拒絶反応抑制という臨床上頗る重要な治療法について、従来の混沌とした抗原非特異的免疫抑制法に代わる有用で独創的な発明を完成するに到ったものである。
本発明は、このように以上の多くの各種知見に基づいて完成されるに到った。
即ち、本発明は次の通りである。
マクロファージ内、単球細胞内、樹状細胞内何れかの還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質を有効成分として含有することに特徴を有する移植拒絶反応抑制剤、特に好ましくは臓器移植拒絶反応抑制剤に存する。
当該還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質は、マクロファージと１〜２４時間試験管中で培養したときに、マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を少なくとも３０％程度低下又は減少させる化合物を１種又は２種以上使用することができる。
このようなマクロファージ、単球細胞、及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質として好ましくは、Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチン（ジアセチル体等）や、同エステル体（例えば、モノエチルエステル、ジメチルエステル、ジイソプロピルエステル等）等のシスチン誘導体、ブサルファン（ＢＣＮＵ）、Ｌ−Ｓ，Ｒ−ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、同誘導体、マレイン酸ジエステル（ジメチルエステル、ジエチルエステル等）等の低分子化合物を挙げることができる。これらの低分子化合物は有効成分として１種又は複数の混合物を使用することができる。
本発明において移植される臓器の代表例として、肝臓、肺臓、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、角膜、角膜上皮等を挙げることができる。移植される臓器の範囲については、臓器全体の移植及びその一部の移植を含む。
また、それら組織の幹細胞移植に対する拒絶反応に対しても適用することができる。
拒絶反応の代表例として、マイナー抗原に対する拒絶反応及びその反応主として含むものを挙げることができる。
特に好ましい移植される臓器としては、角膜、角膜上皮細胞等を挙げることができ、そのマイナー抗原に対する拒絶反応用に本発明の有効成分を好ましいものとして使用することができる。
本発明の移植拒絶反応抑制剤は医薬品の形態で使用することができる。その場合、経口用薬剤や非経口用薬剤（点眼薬、輸液製剤等）の何れかの形態で使用することができる。
点眼薬は角膜移植における拒絶反応の抑制に特に有効である。
本発明の戦記移植拒絶反応抑制剤は飲食品又は栄養剤中に含めて使用することもできる。
より具体的な形態として、本発明においてはヒトから分離、採取した体液／細胞試料を用いて、マクロファージ細胞内の酸化型及び／又は還元型グルタチオン量（グルタチオン含量）を検定することにより、マクロファージをそれぞれ異なった機能を有する酸化型マクロファージと還元型マクロファージとに分類し（特開平１１−２４６４３５号公報参照。）、その存在割合を前記のような低分子化合物で酸化型マクロファージに人為的に偏位させたり、還元型マクロファージを人為的に除去することで、ヒトの臓器移植拒絶反応の抑制治療に有用な医薬品（輸液を含む。）に使用可能な移植拒絶反応抑制剤や拒絶反応抑制に役に立つ飲食品、栄養剤等を提供することができる。ヒトから分離、採取した体液／細胞試料とは、例えば末梢血や腹腔、胸腔、局所組織、関節腔、各種臓器より分離した細胞である。
以下に、臓器移植拒絶反応抑制における本発明の移植拒絶反応抑制剤が、従来に無い極めて優れた薬剤であることについて説明する。
上述の様々な免疫性疾患と異なり、特に臓器移植においては移植術を行う時点がドナー抗原に対する最初の暴露であり、免疫学的操作が簡単に行える。臓器移植を行う場合には、拒絶反応抑制のために、免疫抑制剤を使用しているのが臨床における現状であるが、この治療では抗原非特異的に全ての免疫系が抑制されることや、易感染性等の副作用の問題がある。従って、ドナー抗原に対する免疫反応のみを選択的に抑制する方法の確立が重要であり、最も理想的な治療である。本発明者等は、ドナー抗原に対する免疫寛容の誘導を目的とし、自己移植と同様の恒久的な生着が得られ、免疫抑制剤を必要としない治療方法の開発を鋭意検討しここに本発明を完成した。この方法の開発は、２１世紀の治療と呼ぶに相応しいと確信する。本発明を使用した治療のメリットは、移植臓器抗原に対する反応のみを抑制し（抗原特異性）、この細胞が出現した後には、抗原に暴露される程抑制機構も強くなり（ドナー抗原に対するＴｈ２細胞の誘導）、腎臓、肺臓、心臓、肝臓等の臓器移植のみならず、抗原提示が敏速に行われ拒絶反応の非常に生じ易いハイリスク眼への角膜移植においても応用可能なことである。
本発明者等は新しい拒絶反応抑制法の開発に取り組み、マクロファージのレドックス状態を人為的に制御することでＴヘルパー２型（Ｔｈ２）反応への偏位を惹起させ、このことにより抗原特異的な臓器移植拒絶反応を抑制する治療法を完成した。現在までにマウス角膜移植モデル、皮膚移植モデルにおいて抗原特異的なＴｈ２ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することや、拒絶反応を効率的に抑制することに成功した。その方法は、臓器移植を施行すると同時に、Ｔｈ２偏位反応を局所に誘導し、ドナー移植抗原に対する反応をＴｈ１型からＴｈ２型にシフトさせることにある。臓器移植の拒絶反応はＴｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導する遅延型過敏反応によって主に生じるため、これに拮抗するＴｈ２型Ｔ細胞を誘導することによって拒絶反応を選択的に抑制できたものである。
現在までのＴｈ２偏位によるドナー抗原特異的拒絶反応抑制に関しては、ＩＬ−４やＩＬ−１０を大量投与したり、遺伝子導入したりする試みが多々なされているが、実際に抗原提示される場である局所リンパ節での反応に影響し難い。何故なら、サイトカイン自体は体内においてエンドクリン作用は持たず、細胞同士の近傍においてのパラクリン若しくはオートクリン作用が主だからである。しかも、長期継続投与には大量の費用と労力が必要である。本発明は、移植臓器を移植されたレシピエントが局所リンパ節でＴｈ２サイトカインを放出する方法であり、全身性の副作用が少ない。更に、ドナーに対する反応が拒絶反応を抑制する反応に偏位するため、拒絶反応を常に上回る抑制が生じる。現在のところ、臓器移植においてこの方法を確立しているのは本発明者等のみである。この方法の最大のメリットは、生体内の免疫バランスを壊すことなく、また、生体内に存在する反応を利用して行うことができるため、安価、簡便、かつ安全に実現できることも特徴的である。
特に、角膜移植は他の臓器移植と比較して生着率が高く、安全な移植であり、アメリカで年間５０，０００件、日本で年間２，０００件の手術が行われているのが現状である。更に、近年、角膜上皮細胞幹細胞（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）の存在部位が明らかになり、細胞生物学的な立場から新しい術式が確立され、これまで適応とならなかった疾患群に対して外科的治療を行うことが可能となった。こうした中で、現在最大の問題となっているのは移植片に対する拒絶反応であり、これらに対する臨床的な対応として大量のステロイドやサイクロスポリンの局所及び全身投与が行われているに過ぎず、これらの副作用が問題となっている。
また、適応疾患の拡大としてハイリスク眼への移植技術の確立が大きな課題とされる。新生血管が侵入している角膜への移植は抗原感作が早くなされ、また、エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ）がドナー角膜へ到達し易い。炎症後にランゲルハンス細胞が遊走している角膜への移植は抗原感作が早期に行われる。
更に、術式の拡大における課題として、角膜輪部移植や上皮移植がある。角膜輪部移植はドナーのランゲルハンス細胞を持ち込むため、抗原提示され易い。また、輪部移植、上皮移植共に、移植部位が角膜輪部であり、血管組織が豊富であるため、拒絶され易い。また、角膜上皮は抗原性が高い。従来用いられている抗原非特異的免疫抑制法には、全身的副作用の問題として易感染性、糖尿病、消化管潰瘍、神経症状、肥満、腎機能不全が、局所的副作用の問題としてステロイド緑内障、ステロイド白内障、易感染性等が指摘されており本課題も本発明を実施することで解決される。
レシピエントの角膜に新生血管の存在するハイリスク眼は移植拒絶反応が生じやすく、ステロイドや免疫抑制剤が用いられるが、未だ問題点が多い。角膜移植拒絶における報告では、ＭＨＣ（主要組織適合性抗原）適合は拒絶反応の低下には効果なく、ＭＨＣ以外のマイナー（ｍｉｎｏｒ）抗原の適合が拒絶反応を有意に減少させることが知られている。これは角膜がＩｍｍｕｎｅ　ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ　ｓｉｔｅと呼ばれる免疫的に特殊な環境を有するためであり、（１）角膜組織においてはＭＨＣの発現が低いこと、（２）血管やリンパ管が存在しないこと、（３）角膜組織には抗原提示細胞が存在しないこと等が関与している。これらの特殊環境により、角膜移植におけるドナー抗原は、主にレシピエントの抗原提示細胞によって、レシピエントのＴ細胞に抗原提示されると考えられる（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）。この機序でレシピエントは感作され、抗原提示を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞がドナー抗原に対する遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を生じて拒絶反応を惹起する。角膜移植においては、角膜がｉｍｍｕｎｅ　ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ　ｓｉｔｅであるという点で、これらの操作をより簡単にしていると考えられる。
角膜移植は臓器移植の中で最も生着率のよい安全な移植であり、従来から世界で多数行われてきた。しかし近年、移植に対するコンセプトが発達し、移植術を施行する適応症や移植方法が拡大したため、拒絶反応の生じ易い角膜移植が増加している。
本発明の意義について角膜移植を例に述べる。強いＴｈ２反応の誘導と、適切な時期における抗原の再暴露を組み合わせることにより、（１）角膜移植抗原に対する反応のみを抑制できる（抗原特異性）、（２）ドナー抗原に対してＴｈ２に反応する細胞が誘導されているため、拒絶反応を常に上回る抑制反応を生じさせることができる、（３）抗原提示が敏速で拒絶反応を高率に生じるハイリスク眼においても応用可能である等である。
臓器移植においては、臓器の機能的な役割を保つことも考慮に入れなければならない。角膜移植は、移植片の形状や機能がシンプルであり、また、ドナーの抗原提示細胞が存在しないため、マイナー抗原に対する拒絶反応のモデルとして最も適した移植である。従って、角膜移植で樹立した拒絶抑制方法は他の臓器移植に十分応用可能であり、将来的に臓器移植の拒絶反応の抑制に対しても画期的な転機をもたらすものと期待される。本発明において得られる優れた効果、特にその代表例である角膜移植拒絶反応抑制と移植片定着に関わる新規な点として、（１）抗原提示細胞を操作し、免疫反応を変化させるというこれまで全く見られなかった治療法における有効な効果であること、（２）従来からの方法としては抗原非特異的な免疫抑制以外になかった点を打破した、（３）研究レベルでは抗体等によるトレランスの誘導が用いられていたが、実用にならない点を打破した点が挙げられる。また、より優れた点としては（１）従来の非特異的な免疫抑制法から抗原特異的な免疫抑制が行える可能性があること、（２）免疫抑制剤の使用を制限できる点が挙げられ、実用上有利な点としては、（１）抗原特異的に抑制できる点、（２）安価で達成できる点、（３）本発明になる治療の後には抗原に暴露される程抑制機構も強くなる点（ドナー抗原に対するＴｈ２細胞の誘導）、（４）抗原提示が敏速に行われ拒絶反応を生じ易いハイリスク眼においても応用可能な点、等が挙げられる。
前記グルタチオンの測定方法としては、直接的に酵素リサイクリング法で生化学的に酸化型又は還元型グルタチオン含量を測定する（活性酸素実験プロトコール（細胞工学別冊）、秀潤社、頁８４−８８、１９９４年、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．１０６，ＰＰ２０７−２１２，１９８０，ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１６４，ＰＰ７３−８０，１９９５参照。）のみならず、間接的な測定、例えば酸化型又は還元型マクロファージに対する特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いて測定したり、モノクロロバイメインのようにＧＳＨに特異的に反応し、錯体を形成し、レーザー光励起により蛍光を発するような試薬を用いればよい。
本発明は、別の形態として、マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質を生体内に摂取又は投与することに特徴を有する移植拒絶反応抑制方法に存する。
当該摂取又は投与する形態には前記移植拒絶反応抑制剤を採用することができる。特に、その医薬品の形態や、飲食品及び栄養剤に使用された形態で、好ましく摂取又は投与することができる。
本発明は、更に別の形態として、マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質（活性成分）の移植拒絶反応抑制剤への使用にも存する。
当該移植拒絶反応抑制剤については前記説明の通りであり、また前記の如くその医薬品の形態、又は飲食品及び栄養剤の何れかに使用された形態を好ましい例として挙げることができる。
実施の形態
本発明の実施の形態について説明する。
本発明におけるグルタチオンとは、別名５−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンであり、生体内に最も多く存在するＳＨ化合物で、一般にＧＳＨと記述される。グルタチオンには、その分子の酸化状態により還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンに分類される。還元型グルタチオンとは、前記のグルタチオン（ＧＳＨ）のことであり、酸化型グルタチオンは、別名グルタチオンジスルフィドと呼ばれるもので、ＧＳＳＧと記述される。
本発明におけるマクロファージの分類方法とは、前記、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの量の検定に基づく方法である。マクロファージは、様々なサイトカインや炎症性メディエーター等の情報伝達物質をその細胞から遊離、放出することが知られているが、その活性化状態、分化状態により、放出されるか否か、また放出される量が異なること、従ってその機能が異なってくることを本発明で始めて見出したものである。本発明の分類方法では、マクロファージ細胞内の酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの含量に着目し、酸化型マクロファージと還元型マクロファージに分類した。
還元型マクロファージでは、細胞内の還元型グルタチオンが酸化型マクロファージより相対的に多いのに対して、酸化型マクロファージでは、還元型グルタチオンが還元型より相対的に少ない。また、還元型マクロファージと酸化型マクロファージでは、還元型ＧＳＨ含量の違いのために転写制御因子の活性化に違いが生じ、サイトカインや炎症伝達因子の遺伝子発現に違いが起こり、産生される炎症性サイトカインや炎症性メディエーターの種類や量が変化し、炎症の質が変化する。
酸化型マクロファージでは、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、過酸化水素、スーパーオキシド、ＰＧＥ２、ＰＤＧＦ等の炎症性サイトカイン及びメディエータが産生されるのに対して、還元型マクロファージでは、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＬＴＢ４等が産生され組織傷害を引き起こす。更に、酸化型マクロファージ及び還元型マクロファージは、刺激等により変換する。例えば、炎症や敗血症性シヨックを誘導するＬＰＳ（リポポリサッカライド）、ＰＭＡ（ホルボールエステル）や、ＩＬ−４、ＴＧＦβ等のサイトカンイにより人為的に刺激することにより、還元型マクロファージは酸化型に変換され、逆に、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、抗腫瘍性多糖であるレンチナン（ＬＮＴ）やリポ酸等の抗酸化剤を添加することにより、酸化型マクロファージを還元型に変換することができる。
本発明に従えば、マクロファージ及び単球細胞内の還元型グルタチオン含量を、例えば上記方法で測定した後に、マクロファージ及び単球細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質、特に低分子化合物で経口摂取でも活性が保持されるものを、好ましくは医薬品として通常の製剤化を行い、病態をモニターしつつ連日若しくは一定の期間を開けて患者に摂取させればよい。慢性期においては長期間の服用継続により効果が著明となる。
本発明においてマクロファージ、単球細胞或いは樹状細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質として、好ましくはＮ，Ｎ’−ジアシルシスチン、同エステル体、ＢＣＮＵ、ＢＳＯ、マレイン酸ジエステル等の低分子化合物の中から選択することができるが、これらに限定されることなく、試験管内でマクロファージと数時間（１〜２４時間程度）培養して細胞内の還元型グルタチオン含量を低下させる作用を有する化合物であればよく、このような化合物全て本発明に使用する前記有効成分の中に含まれる。これらの有効成分を本発明において使用する場合、１種のみ或いは複数（混合物）用いることができる。その効果は摂取若しくは投与後炎症局所や末梢血から単核球を採取し、前述の方法で細胞内還元型グルタチオン量（含量）の治療前に対する変化を検定することで判定することができる。このことで移植拒絶反応抑制剤としての有効性は明確に判定され、本発明の対象病態に対して効果を有する。
対象として用いることのできる病態としては、心臓、肺臓、腎臓、肝臓、皮膚移植やマイナー抗原の適合性が問題になる角膜移植更には角膜上皮、角膜幹細胞移植等Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ１に偏位しているために引き起こされる拒絶反応に随伴する病態であれば広範に本発明を適用することができる。
本発明で取り扱う移植拒絶反応抑制剤は実際の医療現場では単独で投与することもできるが、本発明に含まれる経口摂取可能な移植拒絶反応抑制剤同士、若しくは、経口摂取不可能であるが異なる作用機転でマクロファージ、単球細胞、及び樹状細胞何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を低下させる他の物質、例えば、ステロイド性化合物や、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを代表とするサイトカイン等生体外由来並びに生体内由来の物質と混合若しくは併用することもできる。これらサイトカインには其れ自体がマクロファージ、単球細胞、樹状細胞内の還元型グルタチオン含量を低下させることも本発明の過程で見出され、本発明の有効性とその範囲を補強するものである。また、本発明で取り扱う移植拒絶反応抑制剤は単独若しくは眼科領域で扱われる薬剤との併用で点摘剤として用いることも可能である。
細胞内の還元型グルタチオン量に差のある場合には、即ち還元型ＧＳＨ含量の高いマクロファージ、単球及び樹状細胞（還元型マクロファージ）と還元型ＧＳＨ含量の低いマクロファージ、単球及び樹状細胞（酸化型マクロファージ）が混在する場合、還元型ＧＳＨ含量の高いマクロファージ、単球、或いは樹状細胞（還元型マクロファージ）を選択的に除去することも本発明に含まれる。その際に用いられる物質は低分子化合物、高分子化合物の何れでもよく、なかんずく抗体及びその誘導体は効率的である。
既に述べた通り、マクロファージ／単球（樹状細胞を含む。）の機能の多様性と細胞亜集団の対応については今まで全く不明であった。このため、移植拒絶反応における病態進展に、マクロファージ／単球／樹状細胞の抗原提示機能並びにアクセッソリー機能は極めて重要な役割を有しているにも拘らず、マクロファージ／単球細胞亜集団の存在を想定しての機能分類の移植拒絶反応抑制への応用は全くなされておらず、想定されたことすら無かった。本発明において、例えば臓器拒絶反応において重要な役割を果たしているマクロファージ、単球、樹状細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファージと還元型マクロファージとに分類され、還元型マクロファージが細胞性免疫に関与するＴｈ１偏位に関与すること、当該マクロファージの酸化還元状態が臓器移植拒絶反応の病態に重要な役割を果たしていることを見出した。この２種のマクロファージの存在割合を人為的に制御するには前述の低分子化合物を医薬品として用いる以外に、何れか片方のマクロファージを選択的に除去することも頗る有効な方法である。片方のマクロファージにのみ若しくは多量に発現されているマーカーに対する抗体を用いればよいことは当該業者には容易に想定できるところである。
臓器移植モデル実験は広く行われているので本発明の実施態様の骨子を角膜移植、並びに皮膚移植について述べる。
同種異型角膜移植における角膜生着の誘導を判定するには、８〜１０週令のマウスを使用しレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用する。
高率に、そして早期に拒絶反応が生じ易いハイリスク眼である角膜新生血管をレシピエントに誘導するには１１−０のナイロン糸を３糸、角膜実質に縫着し、１４日間留置し、本ナイロン糸は角膜移植時に抜去する角膜移植はは以下のように行う。レシピエントマウスに３ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行う。ドナーマウスの角膜中央部を円状に直径２ｍｍ切除し、移植片を作成する。ホストマウスの角膜中央部を直径２ｍｍ切除し、ドナー角膜を、１１−０ナイロンを使用して８糸端々縫合する。術後は抗生剤の軟膏を塗布し、８−０ナイロンを使用して眼瞼縫合を行う。眼瞼縫合は術後７２時間後に抜去し、角膜縫合は移植後７日に抜去する。
角膜拒絶反応の判定にはスリットランプ顕微鏡を用い、週に２回観察する。角膜混濁を６段階にスコア化することにより拒絶反応を判定する。判定可能時期は移植後１４日以降で、スコア３以上、２１日以降でスコア２以上を拒絶反応と判定する。（０：透明生着、１：軽度角膜表層混濁及び虹彩血管・虹彩紋理明瞭透見可、２：軽度角膜実質混濁及び虹彩血管・虹彩紋理透見可、３：中等度角膜実質混濁及び虹彩血管・虹彩紋理透見不可、４：高度角膜実質混濁及び虹彩縁透見不可、５：完全角膜混濁及び前房透見不可）。
薬剤（本発明に使用する有効成分）の投与方法については、例えば次の方法から理解される。
一回の投与法は、薬剤を生理食塩水に所定濃度に溶解若しくは懸濁させた後、０．５ｍｌをマウス腹腔内に注入する。注入時期は角膜移植を行う７日前、４日前、及び１時間前の３回である。対照マウスには同時期にとして腹腔内に０．５ｍｌの生理食塩水を注入する。角膜移植の生着率の有意差検定にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓを用い、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　ｔｅｓｔによって比較した。Ｐ値が０．０５未満を有意とする。
角膜上皮移植の意義は次の通りである。
角膜は５層からなり、外側から、角膜上皮、ボウマン膜、角膜実質、Ｄｅｓｃｅｍｅｔ膜、角膜内皮である。角膜上皮は増殖能が高く、角膜輪部にあるｓｔｅｍ　ｃｅｌｌから、細胞が供給されている。従って、角膜中央部の移植である全層角膜移植や表層角膜移植術を用いても角膜上皮は数ヶ月でホストの角膜上皮に置き換わる。また、この５層構造のうち、角膜上皮が最も抗原性が高く、移植後早期の拒絶反応のターゲットとなり易い。最後に、角膜上皮は炎症や拒絶反応によって非常に脱落し易い層で、ドナー上皮の維持は非常に難しい。現在、健常組織に置き換える、若しくは欠損した組織を補う意味で角膜移植術が用いられている。角膜移植を行う意義としては（１）混濁した角膜を透明にすることにより視力改善を図る、（主に角膜全層移植・角膜表層移植によって治療）（２）増殖しない角膜内皮細胞が、手術侵襲や疾患によって減少し、水疱性角膜症を生じた角膜に対し、内皮細胞を補う目的で視力改善や疼痛解除を図る。（主に角膜全層移植によって治療）（３）角膜上皮がｓｔｅｍ　ｃｅｌｌを含めて障害を受けた角膜に対し、結膜上皮細胞の侵入を阻止し、透明な角膜上皮細胞で被覆させる等、がある。角膜上皮移植は主に（３）の目的で使用されるが、角膜混濁を伴う症例が多く、（１）の意味合いを持つことが多い。
角膜上皮が欠損し、結膜上皮で覆われ、混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療とし、角膜上皮移植術が行われている。角膜上皮移植術とは、ドナー角膜から角膜輪部上皮と浅層実質のみを切除し、ホスト輪部に移植する方法であり、移植片の角膜上皮が恒常的に増殖を繰り返し、ホスト角膜上皮を維持することを目的としているものである。しかし、その中でも、スティーブンス−ジョンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食等、強い炎症を伴った難治性角結膜疾患においては、その予後は極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（アロ）の角膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。また、移植部位が血管組織やランゲルハンス細胞の多い角膜輪部であるため、ドナー抗原に対する抗原感作や拒絶反応が生じ易いことが挙げられる。更に、拒絶反応の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身、及び局所投与することによって生じる合併症もその予後不良の大きな要因となっている。ステロイドの副作用としては全身性に、易感染性、糖尿病、消化管潰瘍、神経症状、肥満があり、眼局所的にもステロイド緑内障、ステロイド白内障、易感染性等がある。従って、ドナー抗原に対する免疫反応のみを選択的に抑制させる本発明になる方法が理想と考えられる。このことは、現在積極的に治療を行われていない難治性角結膜疾患に対し、新しい安全な治療法を提供できることとなり、その社会的貢献度は極めて高いと考えられる。角膜上皮移植は以下のように実施する。ドナーマウスの眼球をバナス（Ｖａｎａｓ）剪刀を用いて角膜輪部で切除し、全層角膜片を作成する。更に、１．０ｍｍ　Ｘ　２．５ｍｍの角膜片に分割する。分割したドナー角膜片は移植術まで、一時、ＲＰＭＩ培地（ｍｅｄｉｕｍ）に保管する。ホストマウスを麻酔し、角膜上皮を角膜中央から角膜輪部まで丁寧に、強膜剪刀を用いて剥離する。角膜輪部・結膜移行部の強膜を約１．０〜１．５ｍｍの幅で半層切除する。強膜切除部位にドナー角膜片を３片、それぞれ１１−０ナイロン２糸を用いて縫着する。尚、ホスト眼球は右眼のみを使用する。
角膜幹細胞（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）移植について記す。Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食等の疾患ではＳｔｅｍ　ｃｅｌｌを含めた角膜上皮が脱落し、血管を伴った不透明な結膜上皮の侵入を来たす。また、膠様滴状角膜変性症等は角膜上皮に遺伝的に異常がある疾患ではＳｔｅｍ　ｃｅｌｌ自体に異常がある。これらを治療する方法としては正常眼の輪部にある健全な角膜上皮Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌを移植し、正常角膜細胞を常に供給させる以外に方法が無い。しかし、異系角膜上皮移植は拒絶され易く、維持が難しい。従って、本発明の移植拒絶反応抑制剤を用いて拒絶反応を抑制することがこれらの疾患の治療に転機を生むと期待される。
本発明の効果を確認するために構成する皮膚移植のモデル系は以下の通りであり、その著しい効果が容易に理解される。
８〜１０週令のマウスを使用し移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用する。マウスを３ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行う。ドナーマウスの体幹（ｂｏｄｙ　ｗａｌｌ）の皮膚を（８ｘ８ｍｍ）胸部背面（ｔｈｏｒａｃｉｃ　ｗａｌｌ）に移植する。移植片より大きいガーゼをかぶせ、抗生剤の軟膏を塗布する。ギブス包帯で固定して術式を終了する。ギブス包帯は７日後に除去し、その後は拒絶反応を毎日観察する。
本発明に含まれる臓器移植拒絶反応抑制剤は汎く広範な移植に適用できることは、マクロファージからの炎症性伝達因子の分泌を基本的なところで制御する点より明白である。例えば、非ステロイド性酸性抗炎症剤（アスピリン等）は、プロスタグランジン産生、遊離を抑制することでその薬効を発揮すると言われる。一方、ビタミンＥ等の抗酸化剤は活性酸素の産生を抑制することで薬効を発揮する等、その作用がマクロファージの多彩な機能の一局面を制御するのみである。そのためその効果も著明ではなく、特に慢性拒絶反応には効果は殆ど認められない。其れに対して、本発明に含まれる臓器移植拒絶反応抑制剤はマクロファージの酸化／還元状態を制御することを基本とするもので、一度に有害な炎症伝達因子の産生を多数抑制できるものである。従来の薬物の概念を基本から変革するものと言うことができる。
以上のように本発明の移植拒絶反応抑制剤、好ましくは本発明に含まれる臓器移植拒絶反応抑制剤の医療現場における有用な効能は、その斬新な作用機序からして自明であり、疾拒絶反応の急性期、慢性期の何れにも有効である。中でも肺臓、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、角膜等のＴｈ１偏位による拒絶反応が主流の臓器移植に関わる病態であれば本発明の移植拒絶反応抑制剤を広範に適用することができる。
以上、本発明の移植拒絶反応抑制剤を、例えば臓器移植に際して医薬品として使用したときに極めて有効で、優れているかを説明した。本発明の移植拒絶反応抑制剤は経口摂取可能な物質を有効成分として含有するため、その用途は、医療現場における医薬品（内服薬、輸液、点滴薬等）に限られない。即ち、ヒトマクロファージ及び単球細胞内の還元型グルタチオン量（含量）を減少させる作用を有する物質を単独若しくはその複数混合物として含有し、移植拒絶反応抑制作用を有する栄養剤や飲食品を、例えば医療用食品、健康食品、特定保健食品の形態で提供することも可能であり、これらも本発明に含まれる。
製品の形態としては、液体成分に含有させることも、固形の食品の形をとることも可能である。
対象病態としては医薬品として提供する場合と同じである。
次に、医薬品として使用する場合の製剤化について若干説明する。
本発明で使用する有効成分（１種又は複数）に加えて、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質（補助剤等として）を含むことができる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を挙げることができる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、及び溶剤、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロールを挙げることができる。
本発明の移植拒絶反応抑制剤は、公知の又は将来開発される様々な医薬製剤の形態、例えば、経口投与（内服薬）や、腹腔内投与、経皮的投与、吸入投与、目薬の形態等各種の投与形態に調製することができる。本発明の移植拒絶反応抑制剤をこれら様々な医薬製剤の形態に調製するためには公知の又は将来開発される方法を適宜採用することができる。
これら様々な医薬製剤の形態として、例えば適当な固形又は液状の製剤形態、例えば顆粒、粉剤、被覆錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳濁液、滴下剤、注射用溶液、活性物質の放出を延長する製剤等を挙げることができる。
以上に例示した製剤形態にある本発明の移植拒絶反応抑制剤には、薬効を奏するに有効な量の前記有効成分を含有すべきことは当然のことである。
本発明の移植拒絶反応抑制剤の投与量については、使用する有効成分の種類、拒絶反応の種類、そのの症状の程度、製剤の形態、副作用の有無やその程度等に応じて適当に選択される。例えば、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルを有効成分とする製剤の場合には、経口投与で患者１日当たり、当該有効成分の正味重量で表して好ましくは１ｍｇ〜１０ｇ程度、より好ましくは３ｍｇ〜１ｇ程度、更に好ましくは９〜２７０ｍｇ程度投与することができる。また、重篤な場合には更に増量することもできる。投与の回数、時期については、数日に１回でも、また１日１回でも可能であるが、通常は１日当たり数回、例えば２〜４回に分けて、投与される。また、静脈投与の場合には上記経口投与に比べて十〜二十分の一程度の投与量でもよい。
それ以外の成分を使用する場合でも、これらに基づき或いは知られている製剤技術を利用して、また各種の剤型に応じて必要な製剤を調製することができる。
本発明の移植拒絶反応抑制剤を飲食品、栄養剤に含めて使用する場合の使用量については、前記医薬品に使用する場合に説明した１日当たりの経口投与量が参考になる。製品（医薬品、飲食品、栄養剤）中に占める有効成分の含量については、任意に選択することができるが、好ましくは０．１〜５０重量％程度、より好ましくは０．２〜４０重量％程度、更に好ましくは１〜５重量％程度のものを使用することができる。
前記の通り本発明は、別の形態として、マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質を生体内に摂取又は投与することに特徴を有する移植拒絶反応抑制方法や、更に別の形態として、マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質（活性成分）の移植拒絶反応抑制剤への使用にも存する。
これらの発明については、何れも前記本発明の移植拒絶反応抑制剤についての説明や後述の実施例等に基いて、また必要により従来の公知技術を参考にすることにより、容易に実施をすることができる。
好適な実施の形態
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
（実施例１）酸化型マクロファージ及び還元型マクロファージの機能の検定
（方法）
酸化型マクロファージはＬＰＳ（リポポリサッカライド）２０μｇをマウス腹腔内に投与して誘導されること、還元型マクロファージはＬＮＴ１００μｇを同じく腹腔内に１日おきに３回投与することにより誘導されていることが、腹腔浸出細胞をプラスチック表面に付着させた後、モノクロロバイメイン１０μＭと３７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡＳで解析することで判明した。酸化型の増量は反応産物が殆ど認められないこと、即ちネズミ色や青色の画像になること、還元型の増量は赤色や黄色の画像が得られることから肉眼的に容易に検定できる。
そこで、腹腔浸出付着細胞を以下のようにして酸化型及び還元型に誘導して産生されるＮＯ、ＩＬ−６及びＰＧＥ２を測定した。
（１）材料
細胞：上記のように刺激して得られた腹腔浸出付着細胞、即ちマクロファージを９６穴マイクロプレートに１Ｘ１０^５細胞／２００μｌ宛添加
培地：フエノールレッドフリーのＲＰＭＩ１６４０　２００μｌ／穴
ＬＰＳ：リポポリサッカライド（シグマ社製）（由来：Ｅ．ｃｏｌｉ）１００ｎｇ／ｍｌ
ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ
（２）培養方法
５％ＣＯ_２インキュバーター中３７℃で、４８時間培養。
（３）測定方法
上記培養終了後、培養上清を回収し、ＩＬ−６はＩＬ−６依存性の細胞株のＭＨ６０を用いて増殖反応で、ＰＧＥ２はエライザキットを用いて、ＮＯはグリースロイミン試薬を用いて、何れも当該業者が日常に行う方法で各々の産生量を測定した。
（結果）
酸化型マクロファージと還元型マクロファージとでは、産生する炎症性サイトカインＩＬ−６、炎症性メディエーターＰＧＥ２、ＮＯの産生強度及び種類が異なることが明らかである。即ち、酸化型マクロファージではＴｈ２サイトカインであるＩＬ−６の産生と免疫抑制性でＴｈ１誘導を抑制するＰＧＥ２産生が上昇し、組織傷害に働くＮＯ産生は低下する。これと対照的に還元型マクロファージからはＮＯの産生が上昇し、ＰＧＥ２産生やＩＬ−６産生は抑制される。両マクロファージの間に機能的な差異の存在することが明確である。
（実施例２）遺伝子をノックアウトして免疫不全状態にした病態動物を用いての検定
酸化型Ｍφと還元型Ｍφにおいて、何故炎症メディエーターやサイトカインの産生に違いが生じるのかを物質レベルで解析することは、拒絶反応のメカニズムを解明するために重要である。一般に、外からの刺激（リガンド等）は、細胞表面上に存在する受容体（レセプター）を介して細胞内に伝達する。レセプターからの信号により、種々のキナーゼが活性化され、更に転写因子が活性化され、転写因子が核内に移行し、標的となる遺伝子に結合して新形質が発現する。最近の研究により、細胞内の酸化還元系は、転写因子の活性化、核内への移行、遺伝子との結合に関与していることが明らかとなりつつある（ＡＮＮＵＡＬ　ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．８，ＰＰ４５３−４７５，１９９０，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１０，２２４７−２２５１（１９９１）参照。）。Ｍφにおけるレセプターを介した遺伝子発現系に、細胞内の酸化還元系がどのように関与しているかは現在のところ明らかではない。明らかにする一つの手段として、レセプターからの信号伝達系に関与する分子を欠損しているノックアウトマウスよりＭφを調製し、酸化還元系の機能を解析した。具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、及びＩＬ−１５のレセプター構成分子として共通に用いられているコモンガンマ（ｃｏｍｍｏｎγ鎖）（γｃ）、及びその下流に存在し、γｃからの信号を伝達する分子であるＪａｋ３を標的分子とした。
（サイトカイン、刺激剤）
マウスＩＦＮγは、ゲンザイム社製のリコンビナント体を用いた。ヒトＩＬ−２、及びヒトＩＬ−６は、味の素（株）の作成したリコンビナント体を用いた。ヒトＩＬ−１２は、ファーミンジェン社製のリコンビナント体を用いた。
ＬＰＳは、ディフコ社製のＥ．Ｃｏｌｉ．０５５；Ｂ５由来のものを用いた。ＬＮＴは、味の素（株）で製造した製剤品を用いた。
（使用したマウス）
γｃノックアウトマウスは、東北大医学部・菅村教授より、Ｊａｋ３ノックアウトマウスは、千葉大医学部・斉藤教授よりそれぞれ導入したものを用いた。
交配、及び対照として用いた野生型マウスは、ＣＲＪ社より購入したＣ５７ＢＬ／６を用いた。
（腹腔Ｍφの採取）
腹腔細胞の採取は、エーテルにより犠牲死させたマウスの腹腔内に、氷冷した５ｍｌのフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研生物社製）を２２ゲージの針を着けた注射筒により注入し、しごいた後、培地を抜き取ることにより行った。
（ＩＬ−６の定量）
１Ｘ１０^６個のＭφに刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。
ＩＬ−６の定量は、ＩＬ−６に依存的に増殖するマウスハイブリドーマＭＨ６０細胞を用いて行った（Ｊ．ＥＵＲ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．１８，ＰＰ　９５１，１９８８参照。）。１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で１Ｘ１０^５個／ｍｌに調製したＭＨ６０細胞液１００μｌに、培養上清１００μｌを添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターにて、２日間培養した。その後、同培地にて５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＭＴＴ（シグマ社製）を１０μｌ加え、３７℃にて５時間反応させた。反応終了後遠心し、上清を１６０μｌ取り除き、塩酸−プロパノールを１００μｌ加えて、ピペットマンで懸濁することにより細胞を溶解した。溶解後直ちに５７０ｎｍの吸光度をイムノメーター（バイオラッド社製）により測定した。
（ＮＯ_２ ⁻濃度の測定）
１Ｘ１０^６個のＭφに刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。
１００μｌの培養上清に、５０ｍｇ／ｍｌの濃度に蒸留水で調製したグリースロイミン試薬（和光純薬社製）を１００μｌ加えて室温で１５分間反応させた。反応終了後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。尚、スタンダードとして、ＮａＮＯ_２を用いた。
（ＡＣＡＳによる細胞内ＧＳＨの検出）
Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ社製、＃１３６４３９）に、ＲＰＭＩ１６４０培地（フェノールレッドフリー）にて調製した３ｘ１０^５個／ｍｌの細胞懸濁液を３００μｌ入れ、３７℃のＣＯ_２インキュベーターにて２時間培養した。同培地にて洗浄後、同培地にて調製した１０μＭのｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｍａｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｌｏｂｅ社製）を３００μｌ添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターに入れ、３０分反応させた後、ＡＣＡＳにて蛍光強度を測定した。尚、ＡＣＡＳではＵＶレーザーを用いた。
（ＩＬ−１２の定量）
ＩＬ−１２定量は、ヒトＴ細胞株２Ｄ６細胞を用いたバイオアッセイで行った（Ｊ．ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ　ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ　６１，ＰＰ３４６，１９９７参照。）。
５００ｐｇ／ｍｌのリコンビナントヒトＩＬ−１２、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養しておいた２Ｄ６細胞をチューブに移し、ＩＬ−１２を除いた同培地にて３回遠心洗浄し、細胞濃度を１ｘ１０^５／ｍｌに調製した。予め、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により系列希釈したサンプルを１００μｌづつ入れた９６穴平底プレートに、細胞懸濁液を１００μｌづつ加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに入れ、４８時間培養した。最後の６時間で、^３Ｈ−ＴｄＲをパルスした（５０μＭの２−メルカプトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により、３７０ｋＢｑ／ｍｌに調製したものを５０μｌづつ添加）。細胞をハーベストし、βカウンター（マトリックス９６；パッカード社製）で放射活性を測定した。
（ノックアウトマウスより調製したＭφのＧＳＨ濃度の測定）
それぞれのノックアウトマウスの腹腔細胞を調製し、ＭＣＢ試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を解析した。対照のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に比べ、何れのマウスにおいても、還元型グルタチオンの含量は著明に減少した。
（ノックアウトマウスより調製したＭφの機能）
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、それぞれのノックアウトマウスより腹腔細胞を調製し、ＬＰＳ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、及びその組み合わせにより刺激し、ＮＯ産生、ＩＬ−６産生、及びＩＬ−１２産生能を測定した。ＮＯ産生に関しては、無刺激では何れのマウスでも殆ど産生が観られれないが、ＬＰＳとＩＦＮγ刺激組み合わせにおいて、γｃノックアウトマウスでは、ＩＬ−２の併用添加効果が殆ど観られず、対照マウスに比較してＮＯ産生は半分以下に低下した。Ｊａｋ３ノックアウトマウスについてもγｃと同様の結果であった。次に、ＩＬ−６の産生能について解析した。ＬＰＳ刺激では、γｃノックアウトマウスで亢進がみられ（対照８１ｐｇ／ｍｌに対し９６２ｐｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ刺激では、γｃノックアウトマウスで亢進が観られた。この結果は、ＮＯ産生の抑制パターンと同様であった。次に、ＬＰＳ、及びＩＦＮγ刺激によるＩＬ−１２産生能を検討した。しかし、何れのマウスにおいても産生は全く観られなかった。このことは、此処に用いた遺伝子ノックアウトマウス病態動物は酸化型マクロファージが増量しＴｈ２主流の液性免疫が亢進し、Ｔｈ１によって担われる細胞性免疫が低下していることを示す。病態動物モデルにおいても本発明が免疫系疾患の病態診断に独創的で、有意義であることを明確に示す例である。
（実施例３）酸化型マクロファージ誘導による、角膜移植片生着誘導
８〜１０週令のマウスを使用し、移植のホレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。
高率に、そして早期に拒絶反応が生じ易いハイリスク眼である角膜新生血管をレシピエントに誘導する。角膜新生血管の誘導には１１−０のナイロン糸を３糸、角膜実質に縫着し、１４日間留置し、本ナイロン糸は角膜移植時に抜去する。マウスに３ｍｇのケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）と０．００７５ｍｇのザイラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）を腹腔内に投与して麻酔し移植を行った。ドナーマウスの角膜中央部を円状に直径２ｍｍ切除し、移植片を作成し、レシピエントマウスの角膜中央部を直径２ｍｍ切除し、ドナー角膜を１１−０ナイロンを使用して８糸端々縫合した。術後は抗生剤の軟膏を塗布し、８−０ナイロンを使用して眼瞼縫合を行う。眼瞼縫合は術後７２時間後に抜去し、角膜縫合は移植後７日に抜去した。角膜拒絶反応の判定にはスリットランプ顕微鏡を用い、週に２回観察した。角膜混濁を６段階にスコア化することにより拒絶反応を判定する。判定可能時期は移植後１４日以降で、スコア３以上、２１日以降でスコア２以上を拒絶反応と判定している。
（０：透明生着、１：軽度角膜表層混濁及び虹彩血管・虹彩紋理明瞭透見可、２：軽度角膜実質混濁及び虹彩血管・虹彩紋理透見可、３：中等度角膜実質混濁及び虹彩血管・虹彩紋理透見不可、４：高度角膜実質混濁及び虹彩縁透見不可、５：完全角膜混濁及び前房透見不可）。
薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルは、一回当たり４００μｇ／ｍｌ溶液を０．５ｍｌ宛腹腔内に注入した。注入は角膜移植を行う７日前、４日前、及び１時間前の３回実施した。コントロールとして腹腔内にＰＢＳを注入した。角膜移植の生着率の有意差検定にはカプラン−マイヤー生存曲線（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓ）を用い、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　ｔｅｓｔによって比較した。Ｐ値が０．０５未満を有意とした。ＮＡＣ（ＯＭｅ）_２投与群（Ｎ＝１５）はＰＢＳ投与コントロール群（Ｎ＝１０）に比べ、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．０００１）。ハイリスク眼においては移植片がおよそ３週間で１００％拒絶されるのに対し、３週の時点では拒絶反応は０％であり、レシピエントの角膜は炎症から落ち着き、透明性を取り戻し、更に、最終的に７７％が生着した。
実施プロトコールのタイムテーブルは以下の通りである。
−ｄａｙ　１４：新生血管誘導のためのナイロン糸角膜実質縫着；
−ｄａｙ　７：薬剤腹腔内投与（４００μｇ／ｍｌを０．５ｍｌ）；
−ｄａｙ　４：薬剤腹腔内投与（４００μｇ／ｍｌを０．５ｍｌ）；
ｄａｙ　０：薬剤腹腔内投与腹腔内投与（４００μｇ／ｍｌを０．５ｍｌ）及び、角膜移植；
ｄａｙ　３：眼瞼縫合糸抜去（開瞼）；及び
ｄａｙ　７：角膜縫合糸抜去。
拒絶反応を２回／週で観察（８週まで）した。
（実施例４）皮膚移植拒絶反応抑制
８〜１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。レシピエントマウスに３ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行った。ドナーマウスの体幹（ｂｏｄｙ　ｗａｌｌ）の皮膚を（８ｘ８ｍｍ）胸部背面（ｔｈｏｒａｃｉｃ　ｗａｌｌ）に移植し、移植片より大きいガーゼをかぶせ、抗生剤の軟膏を塗布する。ギブス包帯で固定して術式を終了する。ギブス包帯は７日後に除去し、その後は拒絶反応を毎日観察した。
薬剤Ｎ，Ｎ’ジアセチルシスチンジエチルエステルは、一回当たり４００μｇ／ｍｌ溶液を０．５ｍｌ宛Ｂ１０．Ｄ２ドナーとＢＡＬＢ／ｃレシピエントの双方共に、腹腔内及び、皮膚移植予定部位の皮下へ注入した。注入は皮膚移植を行う７日前、４日前、及び１時間前の３回実施した。コントロールとして腹腔内にＰＢＳを注入した。皮膚移植後はＢＡＬＢ／ｃレシピエントの腹腔内、及び移植片の皮下にそれぞれ一回当たり４００μｇ／ｍｌ溶液を０．５ｍｌ宛注入した。注入時期は、皮膚移植後３、７、１０、１４、１７及び２１日後である。コントロールとしてＰＢＳを使用した。皮膚移植の生着率の有意差検定にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓを用い、ブレスロー・ゲーハン・ウイルコクソン試験（Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　ｔｅｓｔ）によって比較した。Ｐ値が０．０５未満を有意とした。
薬剤投与群（Ｎ＝８，ＭＳＴ＝２８．３±１．８日）はＰＢＳ投与コントロール群（Ｎ＝１０，ＭＳＴ＝１４．１４±０．４７日）に比べ、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．０１３）。
（実施例５）還元型マクファージからのＴｈ１誘導性サイトカインＩＬ−１２の産生
レセプターからの信号伝達系に関与する分子を欠損しているノックアウトマウスよりＭφを調製し、酸化還元系の機能を解析した。具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、及びＩＬ−１５のレセプター構成分子として共通に用いられているｃｏｍｍｏｎγ鎖（γｃ）、及びその下流に存在し、γｃからの信号を伝達する分子であるＪａｋ３を標的分子とした。実施例２同様の方法で実施した。ＪＡＫ３ノックアウトマウスを３群に分類し対照群としては通常の水道水の自由摂取群、ＮＡＣ群としては１ｍｇ／ｍｌのＮＡＣを溶解した水道水の自由摂取群、ＧＳＨ−ＯＥｔ群としては１ｍｇ／ｍｌのＧＳＨ−ＯＥｔを溶解した水道水の自由摂取群とし、ＳＰＦ条件下での飼育を２４日間継続し、そこで腹腔浸出付着細胞即ちマクロファージを同様に得た。
（サイトカイン、刺激剤）
マウスＩＦＮγは、ゲンザイム社製のリコンビナント体を用いた。ヒトＩＬ−２、及びヒトＩＬ−６は、味の素（株）の作成したリコンビナント体を用いた。ヒトＩＬ−１２は、ファーミンジェン社製のリコンビナント体を用いた。
ＬＰＳは、ディフコ社製のＥ．Ｃｏｌｉ．０５５；Ｂ５由来のものを用いた。ＬＮＴは、味の素（株）で製造した製剤品を用いた。
（ＩＬ−６の定量）
（ＮＯ_２ ⁻濃度の測定）
（ＡＣＡＳによる細胞内ＧＳＨの検出）
（ＩＬ−１２の定量）
これらは全て実施例２に準じて実施した。
（ノックアウトマウスより調製したＭφのＧＳＨ濃度の測定）
それぞれの処置を受けたノックアウトマウスの腹腔細胞を調製し、ＭＣＢ試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を解析した。対照のマウス（水道水自由飲水群）に比べ、ＮＡＣ及びＧＳＨ−ＯＥｔ溶解水道水自由飲水群の何れのマウスにおいても、還元型グルタチオンの含量は著明に増加し、正常マウスにＮＡＣ腹腔内投与で誘導される還元型Ｍφの画像を示した。
（ノックアウトマウス処置の各群より調製したＭφの機能）
３群、それぞれのノックアウトマウスより腹腔細胞を調製し、ＬＰＳ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、及びその組み合わせにより刺激し、ＮＯ産生、ＩＬ−６産生、及びＩＬ−１２産生能を測定した。ＮＯ産生に関しては、無刺激では何れのマウスでも殆ど産生が観られない。次に、ＩＬ−６の産生能について解析した。ＬＰＳ刺激では、ノックアウトマウスで９６２ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ群で１２２ｐｇ／ｍｌ、ＧＳＨ−ＯＥｔ群で８２ｐｇ／ｍｌとなり、還元型に変換できることが機能面からも確認された。ＩＬ−６がＴｈ２を誘導する主たるサイトカインであることを考慮すると、これらの物質の経口摂取で生体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスの制御できることを明確に示す。この結果は、ＮＯ産生の抑制と薬物による回復パターンと逆相関した。次に、ＬＰＳ、及びＩＦＮγ刺激によるＩＬ−１２産生能を検討した。対照群においては産生は全く観られなかった。このことは、ここに用いたＪＡＫ３遺伝子ノックアウトマウス病態動物は酸化型マクロファージが増量しＴｈ２主流の液性免疫やアレルギー反応が亢進し、Ｔｈ１によって担われる細胞性免疫が低下していることを示す。一方、ＮＡＣ、ＧＳＨ−ＯＥｔ投与群では各々、４２０ｐｇ／ｍｌ及び６１０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２産生が認められた。病態動物モデルにおいても本発明が病態改善に独創的で、有意義であることを明確に示す例である。
（実施例６）還元型、酸化型マクロファージからのＩＬ−１２産生の差異
Ｔ細胞の分化過程、選択過程、及び機能発現過程に異常があると、生体の免疫系が破綻することから、免疫系の中心的役割は、Ｔ細胞により担われていると考えられる。Ｔ細胞の亜集団の一つであるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、リンホカインを産生することにより、免疫担当細胞や炎症性細胞を制御している細胞であるが、最近、Ｔｈは、産生するリンホカインの種類により、更にＴｈ１とＴｈ２の２種類に分けられ、それぞれが異なった免疫機能を担っているとの考えが提唱されている（Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．１３６，ＰＰ２３４８，１９８６参照。）。即ち、Ｔｈ１は、ＩＬ−２やＩＦＮγを産生し、細胞性免疫の調節の主体であり、Ｔｈ２はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６やＩＬ−１０を産生し、液性免疫の調節の主体であり、生体内の免疫調節の恒常性は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスにより保たれているとする考えである。通常は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがどちらかに傾くと、それを是正することにより恒常性が維持されるが、何らかの原因によりバランスが是正されない状態が持続すると免疫病が発症すると考えられている。Ｔｈ１とＴｈ２は、Ｔｈ０という段階からそれぞれに分化するが、Ｔｈ０からＴｈ１への分化にはＭφの産生するＩＬ−１２が重要であり（ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ＴＯＤＡＹ，ＶＯＬ．３３５，ＰＰ１４，１９９３参照。）、Ｔｈ０からＴｈ２への分化にはＮＫＴ細胞が産生するＩＬ−４が重要である（Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬ．１７９，ＰＰ１２８５，１９９４参照。）。
前術の実施例でＭφのレドックス状態の相違によりＭφ機能が異なることが明らかである。Ｍφには、ＧＳＨ量の相違から酸化型Ｍφと還元型Ｍφの２種類のＭφが存在し、ＮＯやＩＬ−６産生パターンが異なる。Ｔｈ０からＴｈ１への分化を誘導し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス制御の鍵の分子であるＩＬ−１２の主な産生細胞はＭφと考えられる。本発明者等は、ＩＬ−１２が還元型Ｍφからのみ産生することを見出した。本発明で得られた知見を基に、Ｍφのレドックス状態が、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを制御していることを示し、本発明が移植拒絶反応の病態診断に如何に有用かを説明する。
（ＩＬ−１２は還元型Ｍφから産生される）
ＬＮＴを腹腔内注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量の高い還元型であり、ＬＰＳを腹腔内注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量の低い酸化型である。ＬＮＴ誘導ＭφとＬＰＳ誘導Ｍφにおいて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否かを検討した。ＬＰＳとＩＦＮγの刺激により、ＬＮＴ誘導Ｍφでは著明なＩＬ−１２産生（１３１２ｐｇ／ｍｌ）が観られたが、ＬＰＳ誘導Ｍφ、及び対照のレジデントＭφでは産生が観られなかった。次に、細胞内ＧＳＨ量を変化させる物質を腹腔内注射して調製したＭφを用いて同様の解析を行った。細胞内ＧＳＨ量を増加させる物質であるＧＳＨ−ＯＥｔ、低下させる物質であるＢＳＯ、ＤＥＭをそれぞれ投与し調製したＭφでは、ＧＳＨ−ＯＥｔ投与マウス由来Ｍφでのみ、ＬＰＳとＩＦＮγ刺激によりＩＬ−１２が産生された（３５７０ｐｇ／ｍｌ）。これらの結果は、細胞内のＧＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産生されることを示す。
（還元型ＭφからのＩＬ−１２産生は、細胞内ＧＳＨ量を低下させることにより抑制される）
細胞内のＧＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産生されることを示したが、この産生は、Ｍφを酸化型にすることにより抑制されるのか否かを検討した。即ち、ＬＮＴ誘導Ｍφを、ＤＥＭや、ＢＣＮＵ刺激することにより、ＩＬ−１２の産生が抑制されるかを解析した。その結果、ＬＮＴ誘導ＭφからのＩＬ−１２産生（８２８ｐｇ／ｍｌ）は、ＤＥＭ或いはＢＣＮＵを添加することにより、完全に抑制される（０ｐｇ／ｍｌ）ことが明らかとなった。即ち、細胞内の還元型グルタチオンを枯渇させ、還元型Ｍφを酸化型Ｍφへと変換することにより、ＩＬ−１２産生は抑制されることが示唆された。
発明の効果
本発明により、ヒトの肝臓、心臓、肺臓、腎臓、皮膚、角膜、角膜内皮（角膜上皮細胞等）等、ヒトの臓器移植（その一部の移植を含む。）及び各組織の幹細胞移植における拒絶反応に随伴する病態の治療、改善、及び／又は予防が可能となり（移植拒絶反応抑制方法）、またそのために極めて有効な移植拒絶反応抑制剤や、そのため（移植拒絶反応抑制剤製造等のため）の前記活性成分（有効成分）の使用を提供する。更に、このような移植拒絶反応抑制剤を医薬品（経口用製剤、輸液、点眼薬等を含む。）の形態で提供、使用し、或いはこの移植拒絶反応抑制剤を含む食品、栄養剤等を提供することができる。
従って、本発明は、産業上、特に医療、医薬品、食品等の多くの分野において極めて有用である。

Claims (16)

1. マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする移植拒絶反応抑制剤。
2. 当該還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質が、マクロファージと１〜２４時間試験管中で培養したときに、当該マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン含量を少なくとも３０％低下させる化合物の１種以上である請求の範囲１に記載の移植拒絶反応抑制剤。
3. マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質が、Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチン、同エステル体、ブサルファン（ＢＣＮＵ）、Ｌ−Ｓ，Ｒ−ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、同誘導体、マレイン酸ジエステル等の低分子化合物の少なくとも１種である請求の範囲１又は２に記載の移植拒絶反応抑制剤。
4. 臓器移植拒絶反応抑制剤である請求の範囲１又は２に記載の移植拒絶反応抑制剤。
5. 当該臓器が、肝臓、肺臓、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、角膜、角膜上皮等の何れかである請求の範囲４に記載の移植拒絶反応抑制剤。
   移植される臓器はその一部でもよい。
6. 拒絶反応が、マイナー抗原に対する拒絶反応を主たるものとする請求の範囲１に記載の移植拒絶反応抑制剤。
7. 当該臓器が、角膜、角膜上皮細胞等であり、拒絶反応がマイナー抗原に対する拒絶反応を主たるものとする請求の範囲４又は５に記載の移植拒絶反応抑制剤。
8. 医薬品の形態にある請求の範囲１〜７何れかに記載の移植拒絶反応抑制剤。
9. 医薬品が、経口用薬剤、点眼薬、及び輸液製剤の何れかの形態にある請求の範囲８に記載の移植拒絶反応抑制剤。
10. 請求の範囲１〜７何れかに記載の移植拒絶反応抑制剤を含むことを特徴とする飲食品又は栄養剤。
11. マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質を生体内に摂取又は投与することを特徴とする移植拒絶反応抑制方法。
12. 当該摂取又は投与する形態が請求の範囲１〜７何れかに記載の移植拒絶反応抑制剤の形態にある請求の範囲１１に記載の方法。
13. 当該摂取又は投与する形態が医薬品、飲食品及び栄養剤の何れかの形態にある請求の範囲１１又は１２に記載の方法。
14. マクロファージ、単球及び樹状細胞の何れかの細胞内の還元型グルタチオン含量を減少させる作用を有する物質の移植拒絶反応抑制剤への使用。
15. 当該移植拒絶反応抑制剤が医薬品の形態、又は飲食品及び栄養剤の何れかに使用された形態にある請求の範囲１４に記載の使用。
16. 当該移植拒絶反応抑制剤が請求の範囲１〜７何れか記載のものである請求の範囲１４に記載の使用。