CN112642091B - 一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用，所述硫酸盐还原菌为硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridieiDSM 13257,由美国菌种保藏中心保藏，其保藏编号为ATCC NO.BAA‑275。本发明提供的硫酸盐还原菌，在厌氧条件下可以完成硝化纤维素的脱硝，并且菌株可以将生成的硝酸盐及亚硝酸盐作为营养物质利用，减少污染。该菌株与硝化纤维素共培养14d后，脱去一部分硝基，使原氮含量13.01%的硝化纤维素氮含量降至12.58%。

Description

一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用
技术领域
本发明属于环境工程、生物领域，具体涉及一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用。
背景技术
硝化纤维素作为一种优良材料，可应用于诸多领域。纤维素分子中羟基都被硝基取代后，每个单体C6H7O2(ONO2)3所包含的氮含量为14.1%。爆炸性硝化棉含氮量通常在12.0%～13.4%之间。氮含量过高的硝化纤维素，性能不稳定，极易爆炸，且其降解时会产生大量的硝酸盐与亚硝酸盐，污染环境，且有一定的毒性。因此，发现一种安全绿色降解硝化纤维素的方法是极其具有意义的。
化学法脱氮时，产生大量的亚硝酸盐与硝酸盐，这两者都具有毒性，且对环境的破坏力极大；且化学降氮的反应程度极难控制，可能会破坏硝化纤维素的主链结构或使其解聚，从而影响硝化纤维素本身的性能。
与化学脱氮相比，生物脱氮法作为一种新型无污染的处理技术而被越来越重视，生物处理技术具有无二次污染、绿色清洁、处理方式灵活等优点，开发生物脱氮技术，已成为近年来对硝化纤维素脱氮处理的新型热点。
人们在研究硝化纤维素的微生物降解性时，早期往往是用微生物混合培养物而不是单一的微生物系来处理的。例如，利用污泥中的微生物菌群，先将硝化纤维素进行化学预处理(碱水解)，生成一种水解产物，且在有其他碳源存在的条件下，能被去除硝基团，促进活性污泥微生物对硝化纤维素的降解。这一过程可以概括为：碱预处理—反硝化作用—活性污泥处理—进一步反硝化作用—产生预期的流出物。此法预处理时极难控制碱解的程度，且会破坏纤维素分子的结构，达不到预期的效果，并且产生的硝酸盐及亚硝酸盐会污染环境。结合以上分析，使用单一的微生物菌株进行硝化纤维素的脱氮处理，且若不需要化学碱解的预处理，不会破坏硝化纤维素碳主链的结构，这意味着能够更加简便、有效的控制硝化纤维素的脱氮，且微生物菌株会将脱氮生成的硝酸盐与亚硝酸盐作为氮源利用，实现能源清洁化处理。因此，急需寻找单一的微生物菌株满足生产需要，以及在此过程中实现绿色清洁的降氮方式。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用，该硫酸盐还原菌DSM13257可以在厌氧条件下具有反硝化性能，实现对硝化纤维素的应用，且该菌株可在厌氧条件下，将硝化纤维素上降解的硝酸盐与亚硝酸盐作为自身营养物质而利用，避免了硝酸盐与亚硝酸对环境的二次污染。
一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用，所述硫酸盐还原菌为硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257,保藏于美国菌种保藏中心，保藏编号为ATCCNO.BAA-275。
通过对所得菌株的培养，该菌株具有以下特征：
（1）菌落特征：菌落表面光滑，边缘整齐，呈淡黄色；短杆状，菌落单个；只在严格厌氧条件下生长；
（2）采用TIANGEN DNA KIT提取原始菌基因组DNA，该菌株的16S rDNA基因序列特征：其16S rDNA具有序列表所示的核苷酸序列，其16S rDNA具有的序列长度为1472 bp，将测得的序列用BLAST软件在GenBank数据库中与已知细菌16S rDNA序列进行比对，查出改进菌株为硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei DSM 13257；
（3）应用MEGA软件，采用Neighbor-Joining法构建16S rDNA系统发育树，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征。
作为改进的是，所述应用，包括以下步骤：
步骤1，配制厌氧菌培养基
按以下质量称取各组分葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.5g/L、蛋白胨7.5g/L、肉浸膏15.0g/L、酸水解酪素2.5g/L、NaCL 5.0g/L，并将各组分混合，再加入1 %刃天青作为氧气指示剂、 2.5 % L-半胱氨酸盐还原剂，搅拌均匀，115℃下高温高压蒸汽灭菌20min，即得厌氧菌培养基；
步骤2，无菌环境下，向厌氧瓶中加入培养液，密封后转入厌氧箱中，备用；培养液的接入量不超过厌氧瓶容量的一半；
步骤3，在厌氧箱中对厌氧瓶进行除氧，直至氧气指示剂刃天青变成无色，按照10%的接种量将菌株DSM 13257接种至厌氧瓶中；
步骤4，在厌氧箱中，将底物4g/L硝化棉加入培养液中与菌株共同培养；
步骤5，培养完成后，将培养液在8000rpm下离心，取沉淀，并用超纯水与1 M NacL溶液分别对沉淀进行洗涤，重复洗涤三次；洗涤完成后，8000rpml离心取沉淀，并按照1g沉淀物加入40mL丙酮的比例，向沉淀中加入丙酮溶液，40℃溶解2 h，离心取上清；再向上清中滴加由水与乙醇按照体积比为2：1进行混合的溶液，直至硝化纤维素不再析出；将析出的硝化纤维素烘干，称重，计算损失率，并进行N含量的分析。
作为改进的是，步骤2中共培养时，添加小分子氮源酸水解酪素。
作为改进的是，步骤2中共培养的温度为37℃，体系pH为7.0-7.5。
有益效果：
与现有技术相比，本发明公开了一种硫酸盐还原菌对硝化纤维素脱硝的应用，所用的硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257对硝化纤维素的脱硝、脱氮的初步实验表明，在37℃，严格厌氧条件下，该菌株可以有效的降低硝化纤维素的氮含量，并且将硝化纤维素脱下硝基所产生的硝态氮和亚硝态氮转化为碳源利用，使菌株生长更好，从而产生更好的脱硝、脱氮效果，循环往复，不产有害的硝酸盐及亚硝酸盐，实现绿色清洁。
具体优势如下：
（1）本发明提供的硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei（DSM）13257，脱硝前不需要碱解预处理，不损害纤维素主链；
（2）本发明提供的硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei（DSM）13257，对硝化纤维素脱氮、脱硝处理的过程中严格厌氧，不需要流加营养物质；可利用培养基中脱氮之后的硝态氮和亚硝态氮作为氮源，实现菌株的生长，以便更好地实现脱氮、脱硝且不会造成二次污染，14d后可将原氮含量13.01%的硝化纤维素氮含量降至12.58%；
（3）本发明提供的硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257，对硝化纤维素的脱硝处理、脱氮处理不产有害的硝酸盐及亚硝酸盐，不污染水质及土壤。
附图说明
图1为不同培养天数下硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257对硝化纤维素的脱氮结果比较图；
图2为不同培养天数下硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257对硝化纤维素脱氮后的FTIR比较图；
图3为硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei（DSM）13257对硝化纤维素脱氮流程图，A:试管接种、B:平板活化、C:底物添加、D:厌氧培养、E:丙酮溶解萃取、F:称重、G:元素分析。
具体实施方案
本发明所述的硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257，由美国菌种保藏中心保藏，其保藏编号是ATCC NO: DSM 13257 [NCIMB 13706, S10]，所述硫酸盐还原菌菌株由南京农业大学赠送，赠送日期为2020年9月9号。
实施例1：菌株的活化
首先，配制厌氧菌培养基
按以下质量称取各组分葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.5g/L、蛋白胨7.5g/L、肉浸膏15.0g/L、酸水解酪素2.5g/L、NaCL 5.0g/L，并将各组分混合，再加入1 %刃天青作为氧气指示剂、 2.5 % L-半胱氨酸盐还原剂，搅拌均匀，115℃下高温高压蒸汽灭菌20min，即得厌氧菌培养基；
其次，在超净工作台中，向容量为100mL的厌氧瓶中加入50mL灭菌完成的培养液，完成后，盖上厌氧瓶的塞子与盖子，转入厌氧箱；
紧接着，在厌氧箱中打开厌氧瓶的盖子与塞子，进行除氧，直至氧气指示剂刃天青变成无色，在厌氧箱中进行后续接种。
最后，在厌氧箱中，向排净氧气的培养液中，按照10 %的接种量将菌株DSM 13257接种至厌氧瓶中（因厌氧微生物生长初期一般难以利用大分子碳氮源，因此，通过增加初始接种量来缩短生物量达到OD600的时间）；
接种完成后，将接种完成的厌氧瓶放置于37℃培养箱培养；生长5天后，培养液中菌体浓度明显增加。在厌氧培养箱中吸取2mL，测得OD600为0.653。
实施例2：硫酸盐还原菌DSM 13257 对硝化纤维素的应用过程
菌株培养：详情见实施例1
底物转化：①4g/L硝化纤维素的配制：称取0.2g的硝化纤维素加入10mL的去离子水中，121℃，20min，高温高压蒸汽灭菌，灭菌完成后将硝化纤维素在无菌条件下烘干水分，得到无菌的硝化纤维素0.2g。②将无菌的硝化纤维素0.2g转入OD600为0.6的菌株培养液中，使厌氧瓶中硝化纤维素的终体系为4g/L，使菌株与底物共同培养。
底物重提取：将培养7d的反应液8000rpm,离心15min,得到的混合物，60℃烘干；将烘干的沉淀物烘干后，称重，加入丙酮（1g沉淀物加入40mL丙酮），40℃反应2h。反应完成后，8000rpm,离心15min，取上清，在上清中加入水与乙醇的混合物（水：乙醇=2：1），将硝化棉析出，直至硝化棉不在析出停止。将析出的硝化棉60℃烘干，称重，并使用元素分析仪进行N含量的测试。流程图见图3。
实施例3：培养基中添加小分子氮源与不添加小分子氮源对硫酸盐还原菌的影响
培养基A成分为：葡萄糖 1.0；酵母粉 2.5；蛋白胨 7.5；肉浸膏 15.0；NaCL 5.0,单位g/L。
培养基B成分为：葡萄糖 1.0；酵母粉 2.5；蛋白胨 7.5；肉浸膏 15.0；酸水解酪素2.5；NaCL 5.0, 单位g/L。
分别加入1 %刃天青作为氧气指示剂、 2.5 % L-半胱氨酸盐还原剂。培养基配制完成后，进行115℃，20min,高温高压蒸汽灭菌。将灭菌完成的培养基，在超净工作台中，向厌氧瓶中加入培养液，且培养液的接入量不超过厌氧瓶容量的一半，完成后，盖上厌氧瓶的塞子与盖子，转入厌氧箱。在厌氧箱中打开厌氧瓶的盖子与塞子，进行除氧，直至氧气指示剂刃天青变成无色，在厌氧箱中进行后续接种。
在厌氧箱中进行接种，37℃培养一周，期间不断测OD来看菌株生长情况，发现添加了小分子氮源（酸水解酪素）的菌株在32 h，即可达到OD6000.8，不添加小分子氮源的培养基，需要64h 才可达到OD6000.8。从数据中可以看出，添加了小分子氮源的菌株生长要快的多，由此可见培养基中添加小分子碳源可显著提高菌株的生长。
实施例4：不同天数下硫酸盐还原菌Desulfosporosinus meridiei DSM 13257对硝化纤维素的降氮的影响
首先，配制厌氧菌培养基
培养基的成分为：将葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.5g/L、蛋白胨7.5g/L、肉浸膏15.0g/L、酸水解酪素2.5g/L、NaCL 5.0g/L进行混合，再加入1 %刃天青作为氧气指示剂、 2.5 %L-半胱氨酸盐还原剂。培养基配制完成后，进行115℃，20min,高温高压蒸汽灭菌。
其次，将灭菌完成的培养基，在超净工作台中，向容量为100mL的厌氧瓶中加入50mL培养液，完成后，盖上厌氧瓶的塞子与盖子，转入厌氧箱。
紧接着，在厌氧箱中打开厌氧瓶的盖子与塞子，进行除氧，直至氧气指示剂刃天青变成无色，在厌氧箱中进行后续接种。
最后，在厌氧箱中，向排净氧气的培养液中，按照10 %的接种量将菌株DSM 13257接种至厌氧瓶中。
接种后的菌株OD600至0.6-0.8之间，对其添加4g/L的硝化纤维素作为底物，共培养7天，并将培养后的底物硝化纤维素用重提取的方法重提取，具体如实施例2，使用元素分析仪测得原药硝化纤维素和硫酸盐还原菌处理7天的硝化纤维素的含氮量的变化，发现有明显降低，而此前并没有文献报道过Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257有降氮效果，因此为了验证其是否有降氮效果，进行了重复实验，并且延长了培养时间，来看其是否会随着时间的延长而进一步降氮。完成7天与14天的培养后，将重提取的硝化纤维素进行元素分析，发现Desulfosporosinus meridiei （DSM）13257确实对硝化纤维素有降氮效果，且随着时间的增加，降氮效果更为明显。详情见图1。
将不同天数硫酸盐还原菌处理过的硝化纤维素与原硝化纤维素进行傅里叶红外图谱的对比。1635 cm-1处为-ONO2不对称伸缩振动，1274 cm-1处为-ONO2 对称伸缩振动，1061 cm-1处为C-O-C伸缩振动， 996 cm-1处为C-O-C 伸缩振动， 824 cm-1处为C-O-C伸缩振动。发现硝化纤维素的主要基团并没有消失，并且没有新基团的产生，硝基的吸收峰在硫酸盐还原菌的处理后有明显的降低，且时间越长降低越明显，具体可见图2。
本发明所述硫酸盐还原菌DSM 13257首次对硝化纤维素进行脱氮脱硝处理，发现其确实可以对硝化纤维素进行脱硝；所述硫酸盐还原菌加入了小分子碳源酸水解酪素后，相同时间达到相同生物量的时间缩短一倍；所述硫酸盐还原菌可以将硝化纤维素脱硝产生的硝酸盐与亚硝酸盐作为厌氧条件下的营养物质进行利用，降低了污染物的生成。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种硫酸盐还原菌在硝化纤维素脱硝上的应用，其特征在于，所述硫酸盐还原菌为硫酸盐还原菌（Desulfosporosinus meridiei）13257，保藏于美国菌种保藏中心，保藏编号为ATCC NO.BAA-275；所述应用包括以下步骤：
步骤1，配制厌氧菌培养基
按以下质量称取各组分葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.5g/L、蛋白胨7.5g/L、肉浸膏15.0g/L、酸水解酪素2.5g/L、NaCl 5.0g/L，并将各组分混合，再加入1 %刃天青作为氧气指示剂、2.5 % L-半胱氨酸盐还原剂，搅拌均匀，115℃下高温高压蒸汽灭菌20min，即得厌氧菌培养基；
步骤2，无菌环境下，向厌氧瓶中加入培养液，密封后转入厌氧箱中，备用；培养液的接入量不超过厌氧瓶容量的一半；
步骤3，在厌氧箱中对厌氧瓶进行除氧，直至氧气指示剂刃天青变成无色，按照10 %的接种量将菌株DSM 13257接种至厌氧瓶中，转入培养箱中培养至OD600为0.6-0.8时，备用；
步骤4，在厌氧箱中，将底物4g/L硝化棉加入培养液中与菌株共同培养；
步骤5，培养完成后，将培养液在8000rpm下离心，取沉淀，并用超纯水与1 M NaCl溶液分别对沉淀进行洗涤，重复洗涤三次；洗涤完成后，8000rpm离心取沉淀，并按照1g沉淀物加入40mL丙酮的比例，向沉淀中加入丙酮溶液，40℃溶解2 h，离心取上清；再向上清中滴加由水与乙醇按照体积比为2：1进行混合的溶液，直至硝化纤维素不再析出；将析出的硝化纤维素烘干，称重，计算损失率，并进行N含量的分析。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸盐还原菌在硝化纤维素脱硝上的应用，其特征在于，步骤4中共培养时，添加小分子氮源酸水解酪素。
3.根据权利要求1所述的一种硫酸盐还原菌在硝化纤维素脱硝上的应用，其特征在于，步骤4中共培养的温度为37℃，体系pH 为7.0-7.5。
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