CN112638476A

CN112638476A - 硬骨素拮抗剂的用途

Info

Publication number: CN112638476A
Application number: CN201980055878.6A
Authority: CN
Inventors: E·海塞; H·泰普林马基
Original assignee: Mereo Biopharma 3 Ltd
Current assignee: Mereo Biopharma 3 Ltd
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-04-09
Also published as: CA3104753A1; WO2020002673A1; JP2021529744A; GB201810746D0; US20210198350A1; EP3813945A1

Abstract

本发明涉及用于治疗个体的肌病的方法和组合物，其包含向所述个体给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂。所述肌病的特征可以在于骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。所述硬骨素拮抗剂可以是抗硬骨素抗体。

Description

硬骨素拮抗剂的用途

技术领域

本发明属于治疗肌病(myopathy)的领域，并且特别是特征在于骨骼肌质量、大小、肌力(strength)和/或功能的损失的肌病。

背景技术

肌病是骨骼肌组织或肌肉的疾病或病症。主要症状包括由肌肉纤维的功能异常引起的肌无力以及肌肉萎缩。痉挛、肌痛和运动性疲劳为其它常见主要症状。癌症相关肌病包括癌症恶病质，其引起进行性功能障碍、治疗相关并发症、生活质量不佳和癌症相关死亡。据估计，几乎三分之一的癌症死亡可归因于癌症恶病质。当前对肌病的治疗包括药物疗法和物理疗法。

仍需要对肌病的进一步且改进的治疗，并且本发明的目标是提供这些治疗。

发明内容

治疗方法

本发明提供一种治疗个体的肌病的方法，其包含向个体给予治疗有效量的硬骨素(sclerostin)拮抗剂。

肌病是一种骨骼肌组织或肌肉的疾病或病症。主要症状包括由肌肉纤维的功能异常引起的肌无力以及肌肉萎缩。痉挛、肌痛和运动性疲劳为其它常见主要症状。肌病的诊断对所属领域的技术人员来说是常规操作，并且可基于病史和身体检查测试，包括椅站起测试(chair rising test)、计时起立行走测试(timed up-and-go test)、前后脚站立测试(tandem stand test)和手抓握测试(hand grip test)。诊断测试可以包括测量钾含量和各种肌酶(例如肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸激酶(PK))和肌炎特异性抗体的含量的血液测试、测量肌肉中的电活动的肌电图(EMG)、肌肉活检、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、识别异常肌肉、肌肉损失和脂肪变性的超声或生物电分析，以及基因测试。

在本发明的一个实施例中，肌病的特征在于骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。如上文所指出，这些参数可由所属领域的技术人员常规地确定。骨骼肌质量和/或大小的损失可例如通过CT、MRI、超声波或活检中的一种或多种来确定。骨骼肌肌力和/或功能的损失可通过例如椅站起测试、前后脚站立测试、计时起立行走测试、手抓握测试、EMG和诊断血液测试中的一种或多种来确定。骨骼肌功能的损失也可通过例如椅站起测试、前后脚站立测试、计时起立行走测试、手抓握测试、EMG和诊断血液测试中的一种或多种来确定。在一个实施例中，肌病的特征在于骨骼肌质量的损失。在一个实施例中，肌病的特征在于骨骼肌大小的损失。在一个实施例中，肌病的特征在于骨骼肌肌力的损失。在一个实施例中，肌病的特征在于骨骼肌功能的损失。特征在于骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失的肌病的实例包括恶病质、肌肉减少症、肌营养不良(MD)，如杜氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)或贝氏肌营养不良(Becker muscular dystrophy，DMB)。因此，在一个实施例中，肌病为恶病质。在一个实施例中，肌病为肌肉减少症。在一个实施例中，肌病为肌营养不良(MD)，如DMD或BMD。骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失也可能归因于活动受限(immobilization)、失重或废用(disuse)。

在一个实施例中，肌病为癌症相关的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。癌症相关的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失的实例包括恶病质和癌症相关肌炎(CAM)、发炎性肌病和类固醇诱发的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。癌症相关的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失可归因于乳癌、肺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、胆管癌或肝细胞癌。在一个实施例中，癌症为乳癌。因此，在一个实施例中，本发明提供一种治疗个体的乳癌相关的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失的方法，其包含向个体给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂。

在一个实施例中，肌病的特征进一步在于硬骨素表达量增加。也就是说，罹患肌病的患者具有相对于未罹患肌病的患者增加的硬骨素表达量。用于测定生物样品中的硬骨素表达和浓度的方法对于所属领域的技术人员是常规的(参见例如Bezooijen等人，2004，《实验医学杂志(J Exp Med)》第199(6)卷:805-814，和McNulty等人，2011,JCEM第96(7)卷:E1159-E1162，所述方法以引用的方式明确地并入本文中)。

本发明人认为根据本发明使用硬骨素拮抗剂适用于增加罹患肌病的患者的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能，尤其是在罹患癌症相关的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失，如恶病质的患者的情形下。用硬骨素拮抗剂治疗还可以延长罹患肌病的患者的存活期/增加寿命。因此，在一个实施例中，给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂增加骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能。在一个实施例中，给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂增加骨骼肌质量。在一个实施例中，给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂增加骨骼肌大小。在一个实施例中，给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂增加骨骼肌肌力。在一个实施例中，给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂增加骨骼肌功能。

在一个实施例中，本发明的方法包含向个体给予治疗有效量的额外治疗剂，例如抗癌药物和/或用于治疗肌病的药剂。用于治疗肌病的抗癌药物和药剂为所属领域的技术人员所熟知。抗癌药物的非穷尽性实例包括化学治疗剂，如伊马替尼(imatinib)、来那度胺(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomib)、亮丙瑞林(leuprorelin)、阿比特龙(abiraterone)和培美曲塞(pemetrexed)；和单克隆抗体，如利妥昔单抗(rituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和西妥昔单抗(cetuximab)。用于治疗肌病的药剂的实例包括骨保护药(bone sparing drug)，如双膦酸盐(bisphosphonate)、唑来膦酸(zoledronic acid)、地诺单抗(denosumab)、阿仑膦酸盐(alendronate)、依替膦酸盐(etidronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、利塞膦酸盐(risedronate)和特立帕肽(teriparatide)、阿巴洛肽(abaloparatide)和骨化三醇(calcitriol)。本发明的硬骨素拮抗剂和额外治疗剂可以同时、分开或依序给予。

在另一方面，本公开提供一种治疗个体的癌症的方法，其包含向个体给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂。本文中关于肌病治疗所描述的所有实施例同等地适用于本公开的癌症治疗方面。因此，并且仅举例来说，在一个实施例中，癌症是乳癌，并且在一个实施例中，硬骨素拮抗剂是抗硬骨素抗体赛图苏单抗(setrusumab)。

癌症诱发的溶骨疾病被定义为癌细胞扩散到骨髓中，伴随溶骨破坏和/或成骨破坏。癌症诱发的溶骨疾病引起疼痛、脊髓压迫和骨折的风险增加。癌症诱发的溶骨疾病与乳癌、前列腺癌、肺癌肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、卵巢癌以及多发性骨髓瘤相关。癌症诱发的溶骨疾病的诊断对所属领域的技术人员来说是常规操作，并且可基于各种成像模态，包括射线照相术、磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)和18FDG-PET。

在另一方面，本公开提供一种治疗个体的癌症诱发的溶骨疾病的方法，其包含向个体给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂。本文中关于肌病治疗所描述的所有实施例同等地适用于本公开的癌症诱发的溶骨疾病治疗方面。因此，并且仅举例来说，在一个实施例中，癌症是乳癌，并且在一个实施例中，硬骨素拮抗剂是抗硬骨素抗体赛图苏单抗。

如本文所用，术语“个体(subject)”或“个体(individual)”或“患者”是指需要疗法的某人。如本文所用，术语“个体”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如小鼠、大鼠、非人类灵长类动物、绵羊、犬、猫、马和牛。然而，通常，术语“个体”是指人类。

术语“有效量”或“……有效的量”或“治疗有效量”包括提及足以产生所需结果，尤其是预防疾病进展和/或改善与所治疗的个体的疾病相关的症状的治疗剂的剂量。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗性措施，其中目标是预防或减缓(减轻)不合需要的生理变化或病症，如骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即，未恶化)、疾病进展的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是完全缓解)。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的情况下的预期存活期相比，存活期延长。需要治疗的个体通常是指已经罹患提供治疗的疾病、病状或病症的患者。

在一个方面，本公开提供硬骨素拮抗剂，其用于治疗个体的肌病。本文中关于治疗肌病的方法所描述的所有实施例/公开内容同等地适用于本公开的此医疗用途方面。

在一个方面，本公开提供硬骨素拮抗剂在用于制造治疗肌病的药物中的用途。本文中关于治疗肌病的方法所描述的所有实施例/公开内容同等地适用于本公开的此用途方面。

在一个方面，本公开提供硬骨素拮抗剂，其用于治疗个体的癌症。本文中关于治疗个体的癌症的方法所描述的所有实施例/公开内容同等地适用于本公开的此医疗用途方面。

在一个方面，本公开提供硬骨素拮抗剂，其用于治疗个体的癌症诱发的溶骨疾病。本文中关于治疗个体的癌症诱发的溶骨疾病的方法所描述的所有实施例/公开内容同等地适用于本公开的此医疗用途方面。

硬骨素拮抗剂

硬骨素是一种天然存在的蛋白质，其在人类中由SOST基因编码。硬骨素为一种分泌型糖蛋白，其具有C端半胱氨酸结状(CTCK)结构域，且与骨形态发生蛋白质(BMP)拮抗剂的DAN(神经母细胞瘤中的差异筛选选择的基因畸变(differential screening-selectedgene aberrative))家族的序列类似性。硬骨素主要由骨细胞产生，但也在其它组织中表达。人类硬骨素的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1中。

硬骨素拮抗剂为所属领域中已知的，并且包括抗体、小分子化合物和寡核苷酸。因此，在一个实施例中，硬骨素拮抗剂为抗体、小分子化合物或寡核苷酸。小分子硬骨素拮抗剂描述于例如以引用的方式明确地并入本文中的WO2014153203中。寡核苷酸硬骨素拮抗剂的实例包括siRNA和反义寡核苷酸。如例如EP2277522和US9791462中所描述，用于识别其它硬骨素拮抗剂的方法是所属领域中已知的，所述方法以引用的方式明确地并入本文中。

本发明的硬骨素拮抗剂通常以高亲和力结合人类硬骨素。如本文所用，术语“高亲和力”是指以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小、1×10^-11M或更小或1×10^-12M或更小的K_D结合人类硬骨素的硬骨素拮抗剂。在一个实施例中，硬骨素拮抗剂以1×10^- ⁸M或更小的K_D结合人类硬骨素。在一个实施例中，硬骨素拮抗剂以1×10^-9M或更小的K_D结合人类硬骨素。在一个实施例中，硬骨素拮抗剂以1×10^-10M或更小的K_D结合人类硬骨素。在一个实施例中，硬骨素拮抗剂以1×10^-11M或更小的K_D结合人类硬骨素。在一个实施例中，硬骨素拮抗剂以1×10^-12M或更小的K_D结合人类硬骨素。较高亲和力结合通常为优选的。通常，硬骨素拮抗剂以1×10^-8M到1×10^-11M的K_D结合人类硬骨素。如本文所用，术语“K_D”意指解离常数，其由K_d与K_a的比率(即K_d/K_a)获得并且以摩尔浓度(M)的形式表示。K_D值可使用所属领域中沿用已久的方法测定。用于测定抗体的K_D的方法例如是通过使用表面等离子共振，或使用生物传感器系统，如

系统。

硬骨素拮抗剂还可以阻断基于细胞的wnt信号传导分析中的硬骨素的抑制性作用。关于“阻断基于细胞的wnt信号传导分析中的硬骨素的抑制性作用”的硬骨素拮抗剂，在一个实施例中，这意指在基于细胞的super top flash(STF)分析中，在硬骨素存在下，在IC50小于1mM、100nM、20nM、10nM或更小的情况下恢复wnt诱导的信号传导的硬骨素拮抗剂。WO2009/047356更详细地描述所述wnt STF分析，所述公开内容以引用的方式明确地并入本文中。

抗硬骨素抗体代表本发明的优选硬骨素拮抗剂，并且适合的抗硬骨素抗体和制造抗硬骨素抗体的方法公开于WO2009047456中，例如，所述方法和抗体以引用的方式明确地并入到本公开中，明确地包括这些抗体的6个CDR、VH和VL序列以及全长重链和轻链序列。在一优选实施例中，抗硬骨素抗体为赛图苏单抗，其为抗硬骨素单克隆抗体。赛图苏单抗包含以下CDR：SEQ ID NO:2的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:3的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:4的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:7的轻链可变区CDR3。赛图苏单抗的VH和VL序列包含：SEQ ID NO:8所示的VH多肽氨基酸序列和SEQ ID NO:9所示的VL多肽氨基酸序列。赛图苏单抗的重链和轻链序列包含：SEQ ID NO:10所示的重链多肽氨基酸序列和SEQ ID NO:11所示的轻链多肽氨基酸序列。

因此，在一个实施例中，抗硬骨素抗体包含至少一个或多个选自由以下组成的群组的互补决定区(CDR)序列：(a)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个实施例中，抗硬骨素抗体至少包含含有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3。在一个实施例中，抗硬骨素抗体包含所有6种前述CDR。

在另一实施例中，抗硬骨素抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或结合与包含以下的抗硬骨素抗体相同的表位的抗硬骨素抗体：(a)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在相关实施例中，抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的VL多肽序列和具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH多肽序列的抗硬骨素抗体相同的表位。在另一实施例中，抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列的抗硬骨素抗体相同的表位。在一个实施例中，抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列的抗硬骨素抗体相同的表位。

在另一实施例中，抗硬骨素抗体包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90(如至少95、98或99或100)一致性百分比(％)的VH。在又一实施例中，抗硬骨素抗体包含与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列具有至少90(如至少95、98或99或100)一致性百分比(％)的VL。在再一实施例中，抗硬骨素抗体包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90(如至少95、98或99或100)一致性百分比(％)的VH，和与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列具有至少90(如至少95、98或99或100)一致性百分比(％)的VL。

在又一实施例中，抗硬骨素抗体包含具有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VL。在仍再一实施例中，抗硬骨素抗体包含与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列具有至少90(如至少95、98或99或100)一致性百分比(％)的重链，和/或与具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的轻链的至少90(如至少95、98或99或100)一致性百分比(％)。在一个实施例中，抗硬骨素抗体包含具有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的轻链。

其它抗硬骨素抗体和制造抗硬骨素抗体的方法的大量实例可见于WO00/32773、WO2005/003158、WO2005/014650、WO2006/119107、WO2006/119062、WO2009/039175、WO2008/061013和WO2008/115732。前述PCT公开中所公开的方法和抗硬骨素抗体中的每一种以引用的方式明确地并入到本公开中，明确地包括这些抗体的6种CDR、重链可变序列(VH)、轻链可变序列(VL)以及全长重链和轻链序列。

在一个实施例中，抗硬骨素抗体为罗莫珠单抗(romosozumab)。罗莫珠单抗包含由SEQ ID NO:12表示的全长重链序列和由SEQ ID NO:13表示的全长轻链序列。因此，在一个实施例中，抗硬骨素抗体包含含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列。在一个实施例中，抗硬骨素抗体结合与罗莫珠单抗相同的表位，也就是说，抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列的抗硬骨素抗体相同的表位。

在另一实施例中，抗硬骨素抗体为布索珠单抗(blosozumab)。布索珠单抗包含由SEQ ID NO:14表示的全长重链序列和由SEQ ID NO:15表示的全长轻链序列。因此，在一个实施例中，抗硬骨素抗体包含含有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列。在一个实施例中，抗硬骨素抗体结合与布索珠单抗相同的表位，也就是说，抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列的抗硬骨素抗体相同的表位。

抗硬骨素抗体所属领域中已知结合以下人类硬骨素序列/以下人类硬骨素序列内：CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC(“环2表位(loop 2epitope)”；SEQ ID NO:16)和/或DVSEYCRELHFTR SAKPVTELVCSGQCGPAR WWRPSGPDFRCIPDRYR LVASCKCKRLTR(“T20.6表位”SEQ ID NO:17)，例如如WO00/32773、WO2005/003158、WO2005/014650、WO2006/119107、WO2006/119062、WO2009/039175和WO2008/061013中所示例，并且这些以引用的方式明确地并入到本公开中，如上文所指出。因此，在一个实施例中，本发明的抗硬骨素抗体结合环2表位”(SEQ ID NO:16)和/或“T20.6表位”(SEQ ID NO:17)/环2表位”(SEQ ID NO:16)和/或“T20.6表位”(SEQ ID NO:17)内。

抗硬骨素抗体

如本文中所提及，术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”为包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每个重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每个轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置可以使用熟知编号方案定义，例如Kabat编号方案(Kabat,E.A.等人，1991《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)》，第五版，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，美国国家卫生研究院(NIH)公开案第91-3242号)或Chothia编号方案(Al Lazikani等人，(1997)《分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)》273:927 948)。在一个实施例中，CDR区使用Kabat系统定义。在另一实施例中，CDR区使用Chothia系统定义。

在一个实施例中，本文中对抗体的提及涵盖经分离、单克隆或多克隆抗体。抗硬骨素抗体可以是人类、人源化、小鼠或嵌合抗体。抗硬骨素抗体可以是双特异性、多特异性或单链抗体。在一个实施例中，抗硬骨素抗体为单克隆抗体。在一个实施例中，抗硬骨素抗体为人源化抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)是指保持特异性结合抗原(例如硬骨素)的能力的抗体的全长或一个或多个片段。已展示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括：Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；Fab'片段，包含Fab片段，其中CH1结构域通过其它氨基酸延伸，例如以提供铰链区或铰链区结构域的一部分，F(ab)2片段，一种包含铰链区处由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段(Ward等人，1989《自然(Nature)》341:544-546)，其由VH结构域组成；以及经分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过不同基因编码，但其可以使用重组方法通过合成连接子连接，使其能够作为单一蛋白质链制造，其中VL和VH区配对以形成单价分子，(称为单链Fv(scFv)；参见例如美国专利第5,892,019号)。所述单链抗体也意图涵盖于术语抗体内。这些抗体片段是使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用对片段进行筛选。本发明的抗硬骨素抗体的抗原结合片段、变异体或衍生物包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、dAb、单链Fv(scFv)或二硫键连接的Fv(sdFv)。在一个实施例中，抗硬骨素抗体为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、Fv、单链Fv(scFv)或二硫键连接的Fv(sdFv)。

在一个实施例中，抗硬骨素抗体为IgM、IgE或IgG同种型，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。如本文所用，“同种型”是指通过重链恒定区基因提供的抗体类别。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一个实施例中，重链恒定区选自IgG2和IgG4同种型。

如本文所用，“经分离抗体”是指大体上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合硬骨素的经分离抗体大体上不含特异性结合除硬骨素以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合硬骨素的经分离抗体可具有与其它抗原，例如来自其它物种的硬骨素分子的交叉反应性。此外，经分离抗体可以大体上不含其它细胞材料和/或化学物质。在一个实施例中，本文中对抗体的提及意指经分离抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“人类抗体”意在包括具有框架区和CDR区都来源于人类来源的序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，那么恒定区也来源于所述人类序列，例如人类种系序列，或人类种系序列的突变形式，或含有来源于如Knappik等人(2000.《分子生物学杂志》296,57-86)所述的人类框架序列分析的共同框架序列的抗体。

人类抗体可包括不由人类序列编码的氨基酸残基(例如由体外无规或定点突变诱发或体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人类抗体”不意在包括其中来源于另一哺乳动物物种，如小鼠的种系的CDR序列已经植入到人类框架序列上的抗体。

术语“人类单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，其具有框架区和CDR区都来源于人类序列的可变区。在一个实施例中，人类单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自转基因非人类动物(例如，转基因小鼠)与永生化细胞融合的B细胞，所述B细胞具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。

如本文所用，术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，如从针对人类免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从被转化以表达人类抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，从重组的组合人类抗体库分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因、序列的全部或一部分剪接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人类抗体具有框架区和CDR区来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施例中，所述重组人类抗体可以接受体外突变诱发(或者，当使用人类Ig序列的转基因动物时，体内体细胞突变诱发)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列尽管是来源于人类种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能并不天然存在于体内人类抗体种系库中。

评估抗体对硬骨素的结合能力的标准分析为所属领域中已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹(western blot)和RIA。适合的分析详细地描述于WO2009/047356中。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)还可以通过所属领域中已知的标准分析，如通过Biacore分析来评定。在WO2009/047356中进一步详细描述评估抗体对硬骨素的功能特性(例如受体结合、预防或改善骨质溶解)的作用的分析。因此，举例来说，结合与本文所述的抗硬骨素抗体相同的表位的抗体可以通过在标准硬骨素结合分析中其与本文所述的抗硬骨素抗体交叉阻断或被交叉阻断(例如竞争性抑制其结合)的能力来识别。测试抗体抑制本发明的抗体与人类硬骨素的结合的能力表明，测试抗体可以与所述抗体竞争与结合人类硬骨素；根据非限制性理论，所述抗体可以结合人类硬骨素上的与与其竞争的抗体相同或相关(例如结构上类似或空间上邻近)的表位。抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与人类硬骨素的结合的能力或程度，和因此其是否可以称为交叉阻断或被交叉阻断，可以使用标准竞争结合分析来确定。一种适合的分析涉及使用Biacore技术，其可使用表面等离子共振技术测量相互作用程度。用于测量交叉阻断的另一分析使用基于ELISA的方法。这些方法的进一步细节可见于WO2009/047356，例如，所述公开内容以引用的方式明确地并入本文中。

抗硬骨素抗体(如赛图苏单抗)的额外特征描述于WO2009/047356中，所述公开内容、论述和数据以引用的方式并入本文中。仅举例来说，抗硬骨素抗体可展现以下功能特性中的至少一种：基于细胞的矿化分析中抗体阻断硬骨素的抑制性作用，Smad1磷酸化分析中抗体阻断硬骨素的抑制性作用，抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，并且抗体增加骨骼形成和质量和密度。如上文所指出，这些特性详细地描述于WO2009/047356中。

药物组合物

本发明的硬骨素拮抗剂还可以作为药物组合物的一部分配制，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的硬骨素拮抗剂。所述组合物可包括本发明的硬骨素拮抗剂中的一种或组合(例如两种或更多种不同的本发明的硬骨素拮抗剂)。举例来说，本发明的药物组合物可包含两种或更多种结合人类硬骨素上的不同表位或以其它方式具有互补活性的抗硬骨素抗体。本发明的硬骨素拮抗剂和本发明的额外治疗剂还可以组合制剂形式配制。

术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给予(例如，通过注射或输注)。取决于给予途径，硬骨素拮抗剂可以包覆在保护化合物免于酸和可能使化合物不活化的其它天然条件的作用的材料中。在一些实施例中，用于静脉内给予的组合物通常为无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。

在一些实施例中，药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的即用制备的无菌粉剂。在某些实施例中，本公开提供用于制备无菌可注射溶液的硬骨素拮抗剂的无菌粉剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其由其先前无菌过滤的溶液得到硬骨素拮抗剂加任何额外所需成分的粉剂。在组合物将通过输注给予的情况下，其可以用含有无菌药用级水、生理盐水或右旋糖/水的输液瓶来施配。在通过注射给予组合物的情况下，可以提供一安瓿注射用无菌水或生理盐水，使得可以在给予前混合各成分。

剂量和给予

本发明的硬骨素拮抗剂可以使用所属领域中已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种给予途径给予。技术人员将了解，给予途径和/或给予模式将随所讨论的拮抗剂和所需结果而变化。给予途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它肠胃外给予途径，例如通过注射或输注。在一个实施例中，给予通过静脉内途径进行。在一个实施例中，给予通过输注静脉内进行。在另一实施例中，给予皮下进行。

如本文所用，短语“肠胃外给予”意指除了经肠和局部给予之外的、通常通过注射进行的给予模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，硬骨素拮抗剂可以通过非肠胃外途径给予，如局部、表皮或粘膜给予途径，例如鼻内、经口、阴道、经直肠、舌下或局部。

调整剂量方案以提供最优所需反应(例如治疗反应)。例如，可给予单个大丸剂、可以随时间推移给予若干分次剂量或剂量可以如治疗状况的紧急状态所指示成比例地减少或增加。为了易于给予和剂量均匀性，以单位剂型形式配制肠胃外组合物尤其有利。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的个体的物理离散单元；每一单元含有经计算以与所需药物载体结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的单位剂型的规格受制于并直接取决于：硬骨素拮抗剂的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及混配所述活性化合物用于治疗个体中的敏感性的领域中固有的局限性。

举例来说，取决于所选择的特定硬骨素拮抗剂，剂量在约0.0001到200mg/kg宿主体重范围内可能是适当的。示范性治疗方案需要按以下给予：每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每三个月到每6个月一次。

综述

术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成，或可含有其它某物，例如X+Y。

关于数值x的术语“约”是任选的，并且意思是例如x±10％。

如本文所用，两个序列之间的一致性百分比是序列共有的一致位置数目的函数(即，一致性％＝一致位置数/总位置数×100)，其考虑了需要引入以对两个序列进行最优比对的空位数目和每个空位的长度。如下文非限制性实例中所述，两个序列之间的序列比较和一致性百分比的测定可以使用数学算法实现。

两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以使用已并入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(Comput.Appl.Biosci.)》,4:11-17,1988)算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、为12的空位长度罚分(gaplength penalty)和为4的空位罚分(gap penalty)来测定。此外，两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以使用已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》48:444-453,1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及为16、14、12、10、8、6或4的空位权数(gap weight)和为1、2、3、4、5或6的长度权数(length weight)来测定。

附图说明

图1.来源于乳癌的硬骨素抑制成骨细胞分化和癌细胞迁移.

A)通过qRT-PCR在非转移性MCF-7和转移性MDA-MB-231乳癌细胞中测定Sost mRNA表达。B)在对照培养基或从MDA-MB-231乳癌细胞收集的癌症调节培养基(CM)存在下颅骨成骨细胞分化成成骨细胞。成骨细胞分化通过茜素红(Alizarin Red)染色测定。C)在所指示浓度的MDA-MB-231来源CM存在下培养颅骨成骨细胞。通过TopFlash报道基因分析测定Wnt信号传导活性。D)用对照培养基、来自用阴性对照siRNA(siRNA neg CM)或针对Sost的siRNA(siRNA Sost CM)转染的MDA-MB-231细胞的CM培养的颅骨成骨细胞中的Wnt信号传导活性。E)测定用阴性对照siRNA(siRNA neg CM)或针对Sost的siRNA(siRNA Sost CM)转染之后的MDA-MB-231乳癌细胞迁移的Transwell分析的定量。F)在对照培养基或从MDA-MB-231转移性乳癌细胞收集的癌症调节培养基(CM)中颅骨细胞分化成成骨细胞。通过Runx2和骨钙蛋白(Oxn)基因表达的定量来测定成骨细胞分化。数据表示为平均值±SEM。双尾斯图登氏t检验(Student's t-test)用于比较两组A，D)，并且ANOVA接着是图基氏事后分析(Tukey's post-hoc analysis)用于比较三个或更多个组C，E，F)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2.硬骨素的药理学抑制降低小鼠中的骨转移负荷.

将稳定地表达荧光素酶基因的MDA-MB-231乳癌细胞注射到8周龄雌性免疫低下SCID小鼠的左心室中。通过生物发光成像(BLI)在注射乳癌细胞之后两周检测到微转移，并且使小鼠随机分组并且一周一次接受媒剂(wither vehicle)或抗硬骨素抗体(Scl-Ab，100mg/kg)持续四周。A+B)通过BLI A)观测并对骨中的肿瘤生长进行B)定量。C，D)C)肺中和D)脑中的HLA蛋白质和mRNA表达通过免疫组织化学和qRT-PCR测定。E，F)使用组织学切片，对用媒剂(n＝16个胫骨)或Scl-Ab(n＝16个胫骨)处理的癌症负载小鼠的胫骨中的转移范围进行定量。比例尺：1mm。

图3.硬骨素抗体处理保护以免乳癌诱发的骨破坏.

A，B)非肿瘤负载小鼠和用媒剂或抗硬骨素抗体(Scl-Ab)处理的具有肿瘤的小鼠的A)股骨和B)胫骨中的骨质量(BV/TV，骨体积/总体积)的微计算机断层扫描(μCT)分析。C)用媒剂或Scl-Ab处理的肿瘤负载小鼠的远端股骨的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。D)近端胫骨的骨质量(BV/TV，骨体积/组织体积)的组织形态分析(健康未处理组n＝5，媒剂处理组n＝10，Scl-Ab处理组n＝10；癌症负载媒剂处理组n＝8，癌症负载Scl-Ab处理组n＝8)。E)近端胫骨的骨形成率(BFR/BS，骨形成率/骨表面)的分析。F)具有骨转移的小鼠的近端胫骨的冯库萨/范吉森(von Kossa/van Gieson)染色(两个左图)和在骨癌界面处的钙黄绿素双重标记(两个右图)。比例尺指示50μm。G)在骨癌界面处骨形成率/骨表面(BFR/BS)的定量(媒剂n＝6，Scl-Ab n＝3)。H)用媒剂或Scl-Ab处理的癌症负载小鼠的远端股骨中的成骨相关转录因子(Osterix)的免疫组织化学染色。比例尺指示50μm。I)远端股骨的组织形态分析(N.Ob/B.Pm，成骨细胞的数目/骨周长；Ob.S/BS，成骨细胞表面/骨表面)(媒剂n＝6，Scl-Abn＝3)。J)用媒剂或Scl-Ab处理的癌症负载小鼠的远端股骨的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。比例尺指示50μm。K)破骨细胞的数目/骨周长(N.Oc/B.Pm)和破骨细胞表面/骨表面(Oc.S/BS)的定量(媒剂n＝8，Scl-Ab n＝8)。数据表示为平均值±SEM。双尾斯图登氏t检验用于比较两组(A，B，G，I，K)，并且ANOVA接着是图基氏事后分析用于比较三个或更多个组(D，E)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。L)来自用媒剂或Scl-Ab处理的健康小鼠和癌症负载小鼠的近端胫骨的冯库萨/范吉森染色和荧光双重标记(插图)。比例尺指示1mm(黑色)和50μm(白色)。

图4.抑制硬骨素预防乳癌诱发的肌肉功能的损失并且增加存活期.

A)用媒剂或抗硬骨素抗体(Scl-Ab)处理的非肿瘤负载小鼠的EDL肌肉的力频率。B)非肿瘤负载小鼠和用媒剂或Scl-Ab处理的具有肿瘤的小鼠中的EDL肌肉重量。C)非肿瘤负载小鼠和用媒剂或Scl-Ab处理的具有肿瘤的小鼠的EDL肌肉的力频率。D)TA肌肉切片用丁二酸盐染色来染色，并且使用Osteomeasure系统对肌肉纤维面积进行定量。E)用媒剂或Scl-Ab处理的肿瘤负载小鼠的存活期曲线。F)来自不进行处理(n＝5)、用媒剂(n＝10)或抗硬骨素抗体(Scl-Ab，n＝10)处理的健康小鼠，和来自用媒剂(n＝8)或Scl-Ab(n＝8)处理的癌症负载小鼠的趾长伸肌(EDL)的比力。G)用媒剂(n＝8)或Scl-Ab(n＝8)处理的具有骨转移的小鼠的EDL肌肉的耐力。H)针对丁二酸脱氢酶(SDH)染色的来自不进行处理、媒剂或Scl-Ab处理的健康小鼠以及来自用媒剂或Scl-Ab处理的具有骨转移的小鼠的胫骨前肌切片。展示两个代表性肌肉/分组。比例尺指示50μm。I)使用SDH染色的来自不进行处理(n＝5)、媒剂(n＝10)或Scl-Ab处理(n＝10)的健康小鼠和来自用媒剂(n＝8)或Scl-Ab(n＝8)处理的癌症负载小鼠的肌肉切片的所有肌肉纤维、氧化纤维(暗)和非氧化(亮)纤维的截面积(CSA)的定量。数据表示为平均值±SEM。三个或更多个组使用ANOVA接着是图基氏事后分析比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5.硬骨素在来自患者的原发性乳癌组织中的表达

在来自48名患者的乳癌组织中分析SOST mRNA表达。于所有患者和三阴性(ER-，PR-，HER-)和激素受体阴性(ER-，PR-)患者中展示硬骨素阳性和硬骨素阴性组织样品的比例。所有，n＝48；ER-，PR-，HER-，n＝9；ER-，HER-，n＝7。

图6.Scl-Ab对癌症负载小鼠的骨骼肌的作用的基础分子机制

用抗硬骨素抗体处理恢复乳癌诱发的NF-κB信号传导的活化和Pax7阳性细胞数目增加。A)健康未处理小鼠(n＝5)和用媒剂(n＝8)或Scl-Ab(n＝8)处理的癌症负载小鼠的腓肠肌(GAS)中的磷酸化IKKα和IKKβ(p-IKKα和p-IKKβ)、磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)、磷酸化p38(p-p38)和总p38的免疫印记分析。使用肌动蛋白作为内参考物。展示代表性样品。B)用媒剂(veh)或TGF-β1刺激的C2C12成肌细胞中的磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)、磷酸化p38(p-p38)和总p38的免疫印记分析。使用肌动蛋白作为内参考物。展示6个独立实验的代表性图像。C)用对照肽或NF-κB阻断肽(NPD)处理并且用媒剂或TGF-β1刺激的C2C12细胞中的磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)、磷酸化p38(p-p38)和总p38的免疫印记分析。使用肌动蛋白作为内参考物。展示4个独立实验的代表性图像。D)在10天的肌源性分化之后，通过C2C12细胞中的qRT-PCR对成肌蛋白和MyoD mRNA表达进行定量(n＝3)。E)对来自健康未处理小鼠(n＝5)和来自用媒剂(n＝8)或Scl-Ab(n＝8)处理的癌症负载小鼠的GAS肌肉中的Pai1mRNA表达进行定量。F)来自健康未处理小鼠和来自用媒剂或Scl-Ab处理的具有骨转移的小鼠的TA肌肉中的Pax7的免疫组织化学染色。比例尺指示上图中的50μm和下图中的100μm。G)来自健康未处理小鼠(n＝5)和来自用媒剂(n＝8)或Scl-Ab(n＝8)处理的具有骨转移的小鼠的TA肌肉中的Pax7阳性细胞的定量。数据表示为平均值±SEM。双尾斯图登氏t检验用于比较两组D)，并且ANOVA接着是图基氏事后分析用于比较三个或更多个组E，G)，*p<0.05，***p<0.001。

图7.LRP5突变赋予对乳癌介导的Wnt信号传导抑制的抗性

用对照培养基或癌症CM刺激的从对LRP5突变G171V杂合的小鼠(LRP5-G171V+/T)和对照同窝出生仔畜(LRP5-G171V+/+)分离的颅骨成骨细胞中的Wnt信号传导活性(n＝4个独立实验)。ANOVA接着是图基氏事后分析用于比较三个或更多个组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

实施本发明的模式

实例1-抗硬骨素拮抗剂处理小鼠肿瘤模型中肌肉大小、质量、肌力和功能的损失

方法

对于颅骨成骨细胞培养物，从1到3天大的小鼠解剖出颅盖并且在含有0.1％胶原酶和0.2％分散酶的α-MEM中依序消化。将细胞部分2到4组合并在含有10％FBS和P/S的α-MEM中扩增。C2C12细胞购自DSMZ并在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的D-MEM(英杰(Invitrogen))中培养。细胞用10ng/ml TGF-β1(R&D)或100ng/ml重组硬骨素(R&D)刺激。为了抑制C2C12细胞中的NF-κB信号传导，用NEMO结合结构域肽(NPD，Enzo)或L-TAT对照肽(Enzo)预处理细胞1小时。使用补充有2％马血清(英杰)和1％青霉素/链霉素的D-MEM诱导肌细胞分化。MCF-7和MDA-MB-231乳癌细胞购自ATCC。在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的D-MEM(英杰)中培养MCF-7细胞，并且在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的α-MEM中使MDA-MB-231细胞生长。测试所有细胞系的支原体污染。根据制造商说明书使用脂染胺3000(赛默飞世尔(ThermoFischer))用加扰对照siRNA或针对硬骨素的siRNA(傲锐东源(Origene))转染MDA-MB-231细胞。为了收集经调节培养基(CM)，在1％FBS存在下培养MDA-MB-231细胞24小时并且收集CM并将其存储于-80℃下。

通过补充具有0.2mM L-抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸盐的α-MEM来诱导成骨细胞分化。在将细胞固定于4％中和缓冲甲醛溶液中之后，通过茜素红染色确定成骨细胞分化。MCF-7和MDA-MB-231乳癌细胞购自ATCC。在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的D-MEM中培养MCF-7细胞，并且在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的α-MEM中培养MDA-MB-231细胞。使用RNEasy试剂盒从培养的细胞中分离RNA并且根据制造商说明书使用NEB ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。通过qRT-PCR使用以下引物测定硬骨素/sost表达：Sost正向：CCA CGG AAA TCA TCC CCG AG(SEQ ID NO:18)，Sost反向：CAT CGG TCA CGT AGC GGG TG(SEQ ID NO:19)。

MDA-MB-231细胞使用脂染胺用阴性对照siRNA或针对Sost的siRNA(购自傲锐东源)转染。为了收集经调节培养基(CM)，在1％FBS存在下培养MDA-MB-231细胞24小时并且收集经调节培养基并将其存储于-80℃下。使用Transwell分析测定细胞迁移。为了测定Wnt信号传导活性，使用Neon系统用TopFlash和Renilla质粒转染颅骨成骨细胞。使用Promega双荧光素酶试剂盒测量荧光素酶活性。

将稳定地表达荧光素酶基因的MDA-MB-231乳癌细胞注射到8周龄雌性免疫低下SCID小鼠的左心室中。通过生物发光成像(BLI)在注射乳癌细胞之后两周检测到微转移，并且使小鼠随机分组到两个处理组中。一周一次静脉内(i.v)，一组接受媒剂(50μl/10g小鼠)，并且另一组接受抗硬骨素抗体赛图苏单抗(Scl-Ab)(100mg/kg)，持续四周。每周通过BLI测量肿瘤负荷。在最后一次注射后一周处死小鼠。在存活研究中，每天监测小鼠并且一旦其达到明确定义的标准(如体重减轻20％)便处死小鼠。不进行处理(n＝10)、用媒剂(n＝10)或用Scl-Ab(n＝10)处理的健康CB-17/lcr-Prkdcscid/Rj小鼠充当对照组。研究者对群组分配不知情。

使用微计算机断层扫描(μCT)进行长骨的三维分析。使用具有10μm的固定各向同性体素(isotropic voxel)大小的高分辨率微计算机断层扫描(70峰kV，在XμA，400ms积分时间下；Viva80微型CT；Scanco Medical公司)分析小鼠的长骨。此阈值通过人工地评估来自每组四个样品的10个单一断层扫描片(tomographic slice)来验证以分离矿化组织并且在不包括未矿化组织的情况下保存其形态。使用3D距离技术(Scanco Medical公司)对经数字提取的骨组织执行所有分析。通过在各片中绘制轮廓来人工地定义所关注区域(ROI)。归因于癌症负载小鼠中癌症诱发的骨破坏和不存在完好骨表面，ROI含有皮质和小梁骨两者。在非癌症负载骨骼中，仅使用标准方法分析小梁骨(Bouxsein等人，《骨与矿物质研究杂志(J Bone Miner Res.)》2013；28(1):2-17)。

使用1300A完整动物肌肉测试系统(Aurora Scientific)分析趾长伸肌(EDL)的离体收缩性。为此目的，将EDL从后肢解剖，将挂钩连接到肌肉的肌腱，并将肌肉安装在力传感器之间。使用两个电极之间的超强刺激来刺激肌肉收缩。对于疲劳研究，用70Hz重复刺激EDL 50次，并且检测到最大强直力。收集数据，并且使用动态肌肉控制/数据获取(DMC)和动态肌肉控制数据分析(DMA)程序(Aurora Scientific)分析数据。为此目的，将EDL从后肢解剖，将挂环连接到肌肉的肌腱，并且安装到力传感器。使用两个电极施加的超强刺激来刺激肌肉收缩。对于疲劳研究，用70Hz重复刺激EDL 50次，并且检测到最大强直力。收集数据，并且使用动态肌肉控制/数据获取(DMC)和动态肌肉控制数据分析(DMA)程序(AuroraScientific)分析数据。如先前所描述来计算比肌力(Bonetto等人，《骨关键报道(BonekeyRep.)》2015；4:732)。研究者在数据分析期间是不知情的。

对于骨分析，在处死之前，分别用钙黄绿素(20mg/kg)和地美环素(20mg/kg；都来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))注射小鼠七天和两天。收集胫骨且将其固定于4％多聚甲醛(PFA)中48小时。对于组织形态分析，将胫骨包埋于甲基丙烯酸甲酯中。使用5μm矢状切片进行甲苯胺蓝、冯库萨/范吉森和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。根据标准方案使用OsteoMeasure系统(Osteometrics)进行定量骨组织形态测量。从软组织清下股骨，在+4℃下固定于4％PFA中24小时，用4％EDTA脱钙4天，并且用20％EDTA脱钙24小时，并且包埋于石蜡中。切割切片，并且使用抗成骨相关转录因子抗体(兔多克隆；Santa Cruz)进行免疫组织化学染色。在+4℃下将脑和肺组织固定于4％PFA中24小时。组织样品包埋于石蜡中，切分且用针对HLA 1类ABC的抗体(小鼠单克隆，艾博抗(Abcam))进行免疫组织化学染色。对于组织学分析，胫骨前肌(TA)从后肢解剖，包埋于10％黄芪胶中且速冻于冷却的2-甲基丁烷中。使用低温切片机进行低温切片并且切片用丁二酸盐染色。对于肌肉纤维面积(MFA)的定量，将12μm厚的TA肌肉的低温切片用丁二酸盐染色(参见下文的试剂和方案)，并且使用OsteomeasureTM系统(美国Osteometrics公司)对纤维面积和数目进行定量。总纤维面积除以纤维的数目以得到图4B中所示的平均纤维面积。MFA提供肌肉纤维萎缩的度量，即个别肌肉纤维的大小。研究者关于处理是不知情的。

丁二酸盐染色方案

试剂：

0.2M磷酸二氢钠→在室温下存储

0.2M磷酸氢二钠→在室温下存储

0.2M磷酸盐缓冲液，pH 7.6→在+4℃下存储

13ml 0.2M磷酸二氢钠缓冲剂

87ml 0.2M磷酸氢二钠缓冲剂

检查pH并且使用NaOH或HCl调节到7.6

0.2M丁二酸钠溶液→在室温下存储

NBT溶液→在+4℃下存储

0.1g氯化硝基四氮唑蓝(NBT)西格玛编号6876

50ml dH2O

培育培养基→在即将使用前制备。

10ml 0.2M磷酸盐缓冲剂(在加热板(50℃到70℃)上混合直到晶体消失)

10ml丁二酸钠溶液

10ml NBT溶液

10ml dH2O

生理食盐水→在室温下存储

福尔马林-生理盐水溶液9％-10％→每次都新制备

90ml生理盐水

10ml 37％至40％甲醛

15％乙醇

方案：

·在37℃下在置于玻片染色缸(Coplin jar)中的培育培养基中培育切片30分钟

·在生理食水中冲洗切片

·将切片固定于福尔马林生理盐水溶液(玻片染色缸)中3到5分钟

·在玻片染色缸中在15％乙醇中冲洗5分钟

·用水性封固介质(mounting medium)(水性封固)或用甘油明胶(gluceringelatine)封固且使其静置2-3分钟

·用指甲油密封盖玻片的边缘且使其干燥

·可在室温下存储载片

从软组织清下股骨，在+4℃下固定于4％多聚甲醛中48小时，用EDTA脱钙并且包埋于石蜡中。切割切片且用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色来染色(

等人《肿瘤靶点(Oncotarget.)》2016年11月29日；7(48):79032-79046)。

从小鼠解剖肺和脑组织并且切成两半。一半在液氮中速冻且使用Trizol分离RNA。使用RNeasy Plus微型试剂盒(凯杰(Qiagen))从培养的细胞中分离RNA。使用NEBProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，并且通过qRT-PCR分析人类特异性人类白细胞抗原(HLA)基因、成肌蛋白、MyoD、Pai1和SOST的表达。在归一化到GAPDH mRNA之后，使用比较CT方法计算每一目标基因的相对表达量。

+4℃下另一半组织在4％多聚甲醛中固定24小时。组织样品包埋于石蜡中，切分并且用针对HLA的抗体染色(参见

等人《癌症研究(Cancer Res.)》2015年4月1日；75(7):1433-44)。

当比较两组时，使用双尾斯图登氏(Student’s)t检验分析参数数据。当比较多于两组时，使用单因素方差分析(ANOVA)，接着是图基氏(Tukey’s)事后分析以比较所述组。在p<0.05下，认为概率值在统计学上显著。实验以生物复本重复至少三次，且使用最少两个技术复本。所有定量数据表示为平均值±SEM。

结果

与非转移性MCF-7乳癌细胞相比，转移性MDA-MB-231乳癌细胞中的硬骨素表达显著更高(图1A)。为了解决转移性乳癌细胞减损成骨细胞分化的假设，收集来自MDA-MB-231转移性乳癌细胞并且在存在或不存在已经由乳癌细胞调节的培养基的情况下使初级颅骨细胞分化成成骨细胞。成骨细胞分化和成骨细胞中Wnt信号传导的活性由来自MDA-MB-231乳癌细胞的经调节培养基(CM)以剂量依赖性方式抑制(图1B，C)。经调节培养基抑制成骨细胞分化和基质矿化，其由成骨细胞标记基因Runx2和Ocn表达减少和较弱茜素红染色展示(图1F，B)。这些发现指示转移性乳癌细胞可以分泌以旁分泌方式抑制成骨细胞中的典型Wnt信号传导的因子。

在使用siRNA拮抗乳癌细胞中的硬骨素时，CM的Wnt活性抑制部分消除(图1D)。乳癌细胞中的硬骨素表达的降低还限制癌细胞迁移(图1E)。这表明来源于乳癌细胞的硬骨素减损骨形成但支持转移特点。

稳定地表达荧光素酶基因的MDA-MB-231乳癌细胞通过心脏注射在雌性SCID小鼠中递送，并且使得在用媒剂或赛图苏单抗(Scl-Ab，100mg/kg)处理之前形成转移。不进行处理、用媒剂或Scl-Ab处理的非癌症负载小鼠充当健康对照组。每周生物发光成像揭露与对照组相比，经Scl-Ab处理的小鼠中的骨转移的生长减少(图2A，B)。通过癌症负载小鼠的胫骨中的转移面积的组织学分析确认肿瘤生长减少(图2E，F)。为了评估Scl-Ab处理对其它部位处的癌细胞再定位和转移形成的潜在作用，在处死之后通过离体生物发光对若干器官，包括肺、肝和脑进行成像(数据未示出)。硬骨素的抑制不改变在骨骼外部位处乳癌细胞的丰度，指示乳癌细胞未再定位到其它器官(图2C，D)。

Scl-Ab处理对未经处理(naive)小鼠中的肌肉功能不具有作用(图4A)，但其保护免于癌症诱发的肌肉纤维面积的减小(图4B)和肿瘤负载小鼠中的肌肉肌力和功能的损失(图4C)，并且延长这些动物的寿命(图4D)。综上所述，数据表明硬骨素的药理学抑制减少骨转移负荷，预防癌症诱发的溶骨疾病以及骨骼肌质量、大小、肌力和功能的损失。

实例2-硬骨素表达为乳癌细胞的一般特点

乳癌细胞已经展示表达Dickkopf 1(Dkk1)，其为典型Wnt信号传导的一种可溶性拮抗剂。然而，拮抗来源于癌细胞的Dkk1并不完全恢复Wnt路径的活性，表明可能存在额外机制。实际上，表达分析揭露与非转移性MCF-7乳癌细胞相比，转移性MDA-MB-231乳癌细胞中Wnt抑制剂硬骨素的显著较高表达(图1A)。为了确定硬骨素表达是否为乳癌细胞的一般特点，使用EMBL-EBI表达地图(EMBL-EBI Expression Atlas)进行计算机模拟分析(Papatheodorou I等人《核酸研究(Nucleic Acids Rs.)》2018；46(D1):D246-D251)。除MDA-MB-231细胞系的细胞以外，在SUM159PT、CAL51、HCC 1187、HCC 1197、HCC1395、HCC1806和KPL-4乳癌细胞系的细胞中发现硬骨素的表达。有趣的是，这些细胞系中的六个(SUM159PT、CAL51、HCC 1187、HCC 1197、HCC 1395和HCC 1806)既不表达雌激素受体(ER)也不表达孕酮受体(PR)，并且不携带HER-2/Neu基因的扩增(称为三阴性乳癌细胞)。此外，尽管KPL-4细胞具有HER-2/Neu扩增，但其不表达ER或PR，表明硬骨素表达为激素受体阴性乳癌细胞的共同特点。

为了解决硬骨素是否在来自患者的原发性乳癌组织中表达的问题，本发明人对获自48名乳癌患者和获自四名健康个体的组织活检体中的硬骨素表达进行定量。根据制造商的说明书，使用TissueScan乳癌阵列III(傲锐东源)分析48个人类乳癌组织中的SOST表达。利用由来自8个不同主要器官的72个肿瘤样品和24个非恶性组织样品的96个样品组成的TissueScan癌症调查阵列96I(傲锐东源)分析各种恶性组织中的SOST的表达模式。使用qRT-PCR对SOST的表达进行定量。使用β-肌动蛋白(ACTB)作为内部对照物。

虽然未在健康乳房组织中检测到硬骨素表达，但21％的原发性乳癌表达硬骨素(图5)。有趣的是，56％的三阴性乳癌组织和43％的ER阴性和PR阴性乳癌组织表达硬骨素(图5)。此外，具有未知受体状态的3例转移性乳癌中的2例(66％)对于硬骨素表达为阳性的。表达ER或PR或这两种受体的肿瘤不表达硬骨素(数据未图示)。为了确定硬骨素表达是否为乳癌的特异性特点或其是否还由其它类型的癌症表达，本发明人分析了人类结肠(n＝9)、肾(n＝9)、肝(n＝9)、肺(n＝9)、前列腺(n＝9)、卵巢(n＝9)和甲状腺(n＝9)癌症活检体和相应健康组织中的硬骨素表达。在两个结肠(22％)、一个卵巢(11％)和两个肺(22％)癌症组织中检测到硬骨素表达，表明硬骨素表达不为乳癌特有的(表1)。

实例3-LRP5突变赋予对乳癌介导的Wnt信号传导抑制的抗性

硬骨素通过结合LRP5受体的细胞外区的第一β-螺旋桨结构域(β-propellerdomain)来抑制成骨细胞中的典型Wnt信号传导路径的活化。LRP5的此结构域内的杂合错义突变(G171V和A214V)由于硬骨素的结合减少而产生患者和小鼠中的高骨质量表现型。为了确定癌细胞来源的硬骨素是否通过Lrp5抑制成骨细胞中的Wnt活性，本发明人从对于Lrp5突变G171V杂合的经基因修饰的小鼠获得成骨细胞。支持我们的假设的是，携带具有停用的硬骨素结合位点的突变Lrp5的成骨细胞对乳癌介导的Wnt信号传导抑制具有抗性(图7)。这些数据表明乳癌细胞至少部分地通过典型Wnt信号传导路径的硬骨素/Lrp5介导的抑制而减损成骨细胞分化。

实例4-硬骨素诱发的骨破坏和Scl-Ab处理的作用

另外，硬骨素抑制预防由μCT和组织学分析测定的癌症诱发的骨破坏(图3A-C)。近端胫骨的组织学分析揭露与健康的经媒剂处理的对照动物相比较，癌症负载经媒剂处理的小鼠中的骨形成率和骨质量显著降低(图3L，D，E)。有趣地，Scl-Ab处理具有骨转移的小鼠不仅恢复与健康的经媒剂处理的对照动物的骨质量相当的骨质量，而且将骨质量和骨形成两者增加到健康的经Scl-Ab处理的小鼠的水平(图3D和E)。转移附近的骨表面的详细组织形态分析揭露经媒剂处理的小鼠中存在经乳癌细胞钝化的骨形成，其通过Scl-Ab处理显著恢复(图3F和G)。这些结果表明Scl-Ab至少部分地通过在骨肿瘤界面恢复乳癌诱发的骨形成抑制来预防骨转移的情形下的骨质流失。

为了进一步分析具有乳癌骨转移的小鼠中Scl-Ab的作用模式，分别在癌症负载小鼠血清中测量作为骨形成和骨再吸收的生物标记的1型胶原蛋白氨基前肽(amino pro-peptide of type 1collagen，P1NP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)5b。酶联免疫吸附分析(ELISA)用于测定小鼠血清中的P1NP和TRAP浓度。所有程序都根据制造商(immunodiagnostics systems)说明书进行。

与经媒剂处理的动物相比，经Scl-Ab处理的小鼠中P1NP血清浓度较高，而TRAP5b的血清浓度降低，表明Scl-Ab处理活化骨形成并且减少骨再吸收。此双重作用模式已经在绝经后骨质疏松的处理的情形下一致地经过报道。为了进一步在细胞层级研究此发现，在癌症负载小鼠中对成骨细胞和破骨细胞的参数进行定量。正如所预期的，与经媒剂处理的对照动物相比，在Scl-Ab处理的癌症负载小鼠中形成骨骼的成骨细胞的数目和大小显著增加(图3H，I)。此外，再吸收骨骼的破骨细胞的数目和大小回应于Scl-Ab处理显著减小(图3J，K)，表明骨质量的增加是归因于同时的骨形成增加和骨再吸收减少。这些数据一起强烈地指示Scl-Ab处理不仅通过其同化代谢作用增加骨质量(该同化作用通过肿瘤诱发的损伤的成骨细胞的功能)，而且还减少破骨细胞活性的乳癌介导的增加，从而逆转溶骨疾病。

实例5-Scl-Ab对肌肉功能的影响

具有骨转移的患者通常罹患肌无力。类似地，患有乳癌诱发的转移性骨病的小鼠与健康动物相比具有降低的离体肌肉收缩性(图4F)。鉴于Scl-Ab在减少肿瘤负荷和骨破坏中的有益功效，本发明人假定硬骨素的抑制还可能影响肌肉功能。为了测试这一假设，本发明人分析了用Scl-Ab或媒剂对照物处理的健康小鼠和具有骨转移的小鼠的趾长伸肌(EDL)的比肌力和耐力。尽管Scl-Ab处理增加了健康小鼠的骨质量(图3L，D)，但这些动物中的肌肉功能未改变(图4F)。相比之下，通过比肌力(图4F)和耐力(图4G)的定量确定，Scl-Ab处理负载骨转移的小鼠保护小鼠免于癌症诱发的肌无力。为了更好地理解改变的肌肉功能的疾病机制，将胫骨前肌(TA)针对丁二酸脱氢酶染色，并且对氧化和非氧化纤维的截面积(CSA)进行定量。

与未改变的肌肉功能一致，Scl-Ab处理健康小鼠既不影响氧化也不影响非氧化肌肉纤维的CSA(图4H，I)。有趣的是，骨转移引起CSA的显著减少，其通过Scl-Ab处理完全恢复(图4H，I)。由于在癌症负载小鼠中氧化肌肉纤维受影响(图4I)，似乎有可能转移性骨病可能在骨骼肌中引起氧化应激和肌肉纤维萎缩，其通过用Scl-Ab处理来预防。

实例6-Scl-Ab对癌症负载小鼠的骨骼肌的作用的基础分子机制

为了进一步阐明Scl-Ab对癌症负载小鼠的骨骼肌的作用的基础分子机制，本发明人研究了涉及氧化应激的各种信号传导路径。

细胞溶解于含有50mM Tris碱、150mM NaCl、0,5％诺纳德(Nonindet)P-40(NP-40)、0,25％脱氧胆酸钠和完全蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏(Roche))的低盐溶解缓冲剂(pH 7.6)中。使用杜恩斯均质机(dounce homogenizer)将肌肉组织在溶解缓冲剂(20mMTris，pH7.8，137mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2，1％Triton X-100，10％甘油，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中均质化。将溶解物在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离且进行免疫印迹分析。将免疫印迹在4℃下与表2中列出的初级抗体一起培育过夜。

经过氧化酶标记的抗兔或抗小鼠二级抗体(1:10 000，Santa Cruz，目录号：W401B，W402B)用于观察使用Clarity Western ECL底物(伯乐(BioRad))的条带。使用ChemiDoc成像系统和Image Lab软件(伯乐)获取免疫印迹的图像。

蛋白质印迹分析揭露与健康对照动物相比，癌症负载小鼠的腓肠肌(GAS)中p38、ERK1/2和STAT3的磷酸化增加(图6A)。有趣的是，在经Scl-Ab处理的动物的肌肉中p38的癌症诱发的磷酸化恢复(图6A)。由于NF-κB路径的活化已展示为骨骼肌萎缩的关键组分，所以本发明人研究NF-κB信号传导是否还牵涉乳癌诱发的骨转移。在稳态条件下，NF-κB通过与称为IκB(κB的抑制剂)的抑制剂蛋白质的IκB家族的成员的相互作用而隔离在细胞质中。在活化后，含有两种IκB激酶IKKα和IKKβ的IKK复合物使IκB蛋白质磷酸化，从而使其靶向于泛素化和蛋白酶体降解。有趣的是，相比于健康动物，IKKα和IKKβ在用媒剂处理的癌症负载小鼠的肌肉中强烈磷酸化。此外，在癌症负载小鼠中NF-κB亚基p65的磷酸化显著增加，指示活化的NF-κB信号传导。Scl-Ab处理极大地减少IKKα、IKKβ和p65的磷酸化(图6A)，表明乳癌骨转移的存在活化p38-NF-κB信号传导级联，其通过抑制硬骨素而减弱。

为了确定硬骨素是否直接活化成肌细胞中的p38-NF-κB信号传导路径，本发明人用重组硬骨素刺激C2C12成肌细胞。硬骨素处理未诱导p38或NF-κB路径的组分的磷酸化(数据未示出)，表明路径由存在于转移性微环境中的细胞因子间接活化。TGF-β1为在乳癌诱发的骨再吸收期间从骨基质释放的丰富生长因子。有趣的是，用TGF-β1刺激未分化的C2C12成肌细胞活化p38-NF-κB路径，因此再现在癌症负载小鼠的肌肉中观察到的效果(图6B)。抑制NF-κB路径消除TGF-β1诱导的p38的磷酸化(图6C)，表明TGF-β1的作用至少部分通过NF-κB介导。一致地，TGF-β1刺激抑制C2C12成肌细胞分化为肌细胞，如通过成肌蛋白和MyoD的表达减少所确定(图6D)。这些数据表明在溶骨骨再吸收期间从骨基质释放的TGF-β1降低肌肉功能，其通过Scl-Ab处理预防。实际上，与健康动物相比，TGF-β1目标基因Pai1的表达在骨转移负载小鼠的肌肉中显著增加(图6E)。然而，Pai1表达在Scl-Ab处理的肿瘤负载小鼠的肌肉中不增加(图6E)，指示Scl-Ab处理恢复TGF-β1和p38-NF-κB路径的乳癌诱发的活化。

在结肠癌中，NF-κB累积阻止Pax7的下调，引起受损的肌肉再生和受损的骨骼肌功能。为了解决这种问题是否还在具有乳癌骨转移的小鼠中存在，本发明人分析胫骨前肌中的Pax7阳性卫星细胞的数目。有趣的是，相比于健康动物，癌症负载小鼠中Pax7阳性细胞的数目显著增加(图6F和G)。此癌症诱发的增加部分地但显著地通过Scl-Ab处理恢复(图6G)。共同地，这些数据表明硬骨素的药理学抑制通过阻止癌症介导的NF-κB信号传导的活化和Pax7阳性卫星细胞的后续增加而保护免于乳癌诱发的肌肉功能的丧失。

应理解，本发明仅举例描述，并且可进行修改，同时保持在本发明的范围和精神内。

序列表

<110> 美莱奥生物制药第三有限公司

<120> 硬骨素拮抗剂的用途

<130> P073406WO

<140> TBC

<141> 2019-06-28

<150> GB1810746.6

<151> 2018-06-29

<160> 19

<170> SeqWin2010版本1.0

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<212> PRT

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<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 智人

<400> 11

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<213> 智人

<400> 12

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 14

<211> 444

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Pro Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Phe Gln His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ser Asp Pro Glu Ile Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Asp Thr Thr Tyr Lys Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val His Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Trp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp

1 5 10 15

Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys

20 25

<210> 17

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 智人

<400> 17

Asp Val Ser Glu Tyr Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Ser Ala Lys

1 5 10 15

Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Trp

20 25 30

Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg

35 40 45

Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg

50 55 60

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 18

ccacggaaat catccccgag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 19

catcggtcac gtagcgggtg 20

Claims

1.一种治疗个体的肌病的方法，其包含向所述个体给予治疗有效量的硬骨素拮抗剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肌病的特征在于骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肌病为恶病质、肌肉减少症或肌营养不良(MD)，如杜氏肌营养不良(DMD)或贝氏肌营养不良(DMB)。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肌病为癌症相关的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失，如癌症恶病质、癌症相关肌炎(CAM)、发炎性肌病或类固醇诱发的骨骼肌质量、大小、肌力和/或功能的损失。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述癌症为乳癌、肺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、胆管癌或肝细胞癌。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述癌症为乳癌。

7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述硬骨素拮抗剂为抗硬骨素抗体、小分子化合物或寡核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体为小鼠、嵌合、人源化或人类抗体。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体为单克隆抗体。

10.根据权利要求7到9中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体为人源化抗体。

11.根据权利要求7到10中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、Fv、单链Fv(scFv)或二硫键连接的Fv(sdFv)。

12.根据权利要求7到11中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体为IgG同种型，如IgG2或IgG4同种型。

13.根据权利要求7到12中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及

(f)包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

14.根据权利要求7到13中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体包含：

a)与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的VH多肽序列；和/或

b)与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的VL多肽序列。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体包含含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH多肽序列和含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的VL多肽序列。

16.根据权利要求7到15中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体包含：

a)与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的全长重链氨基酸序列；和/或

b)与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的全长轻链氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体包含含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列。

18.根据权利要求7到12中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体结合选自SEQ IDNO:16和/或SEQ ID NO:17的序列。

19.根据权利要求7到12中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH多肽序列和具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的VL多肽序列的抗硬骨素抗体相同的表位。

20.根据权利要求7到12或18中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列的抗硬骨素抗体相同的表位。

21.根据权利要求7到12中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体结合与包含具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的全长重链氨基酸序列和具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的全长轻链氨基酸序列的抗硬骨素抗体相同的表位。

22.根据权利要求7到21中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨素抗体为赛图苏单抗、罗莫珠单抗或布索珠单抗。

23.根据任一前述权利要求所述的方法，其包括向所述个体给予治疗有效量的额外治疗剂，任选地其中所述额外治疗剂为抗癌药物和/或用于治疗肌病的药剂。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述额外治疗剂选自以下中的一种或多种：

化学治疗剂，如伊马替尼、来那度胺、硼替佐米、亮丙瑞林、阿比特龙和培美曲塞；单克隆抗体，如利妥昔单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗；骨保护药，如双膦酸盐、唑来膦酸、地诺单抗、阿仑膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、特立帕肽、阿巴洛肽和骨化三醇。

25.一种用于治疗个体的肌病的抗硬骨素拮抗剂，任选地其中所述肌病根据权利要求2到6中任一项所定义，和/或其中所述硬骨素拮抗剂根据权利要求7到22中任一项所定义。