CN112626248A - 番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法 - Google Patents

番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法，通过提出了番茄根结线虫病抗病基因（Mi‑1.2）的2对高效性引物InMi1‑F/InMi1‑R和InMi2‑F/InMi2‑R，番茄烟草花叶病毒病抗病基因（SW‑5b）的3对高效性引物InSW1‑F/InSW1‑R、InSW2‑F/InSW2‑R和InSW3‑F/InSW3‑R，其可以更加准确地判断植株的抗感性。本发明的番茄抗病基因相关标记的引物及方法，其PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测，扩增带型清晰，且有多个引物可以重复，准确度更高。

Description

番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)作为一种集鲜食、菜用、观赏于一体的重要蔬菜作物，具有营养价值高、适应性广、栽培容易、经济效益高等优点，在世界各地都有广泛栽种，而我国是世界最大的番茄生产和消费国家之一。近年来，随着番茄产业的迅猛发展，栽培方式的不断创新、丰富，栽培技术的全面改革，番茄生产已成为菜农增收致富和出口创汇的重要途径。番茄市场潜力巨大，种植及推广的经济社会效益可观。但是，近几年来，随着番茄栽培面积的不断扩大，长季、反季或周年种植，致使番茄连作频繁，重茬严重，轮作困难，导致番茄病虫害侵染严重，尤其是像根结线虫病、烟草花叶病毒病这类植物“癌症”为害已成为保护地栽培种的突出问题，轻者减产20％～30％，严重的减产50％以上，甚至绝产。因此，选育多抗保护地专用番茄品种，在提高自研番茄品种的综合“品性”，在打破传统番茄种植生产模式以及促使我国蔬菜产业整体升级和良性发展等方面，具有十分重要的意义。目前育种工作者在番茄常规育种方面取得了很大的突破，并且已经开始利用生物技术开展分子辅助育种，通过选用成熟稳定的各类分子标记技术加快育种进度、加强育种针对性。
为了减少番茄病害的发生，育种工作者利用传统育种方法通过表现型间接对基因型进行选择，但是这种选择方法存在周期长、效率低等许多缺点。随着分子生物学技术的成熟，分子技术在番茄种子辅助育种上得到了广泛的应用。通过 DNA分子标记可以针对性的检测番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)和番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)，目前已报道2007年Seah等利用番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)相关标记在基因区域开发出的引物SCAR-1-F/SCAR-1-R，在抗病品种中扩增出377bp的片段大小，在感病品种中扩增出432bp片段。2011 年Truong等利用番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记在基因区域开发出的引物SW-5-2-F/SW-5-2-R，在抗病品种中扩增出464bp/510bp的片段大小，在感病品种中扩增出570bp片段。抗病基因相关标记引物的开发不仅加强了育种的针对性，提高了育种效率，而且促进优质多抗番茄品种的选育，传统育种方法也逐渐被取代。
但是现有的标记引物SW-5-2-F/SW-5-2-R，其判断的准确性还不够，存在一定的误判的情况。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提出了番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2) 的2对高效性引物InMi1-F/InMi1-R和InMi2-F/InMi2-R，番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)的3对高效性引物InSW1-F/InSW1-R、InSW2-F/InSW2-R 和InSW3-F/InSW3-R，其可以更加准确地判断植株的抗感性。
一种番茄根结线虫病抗病基因和烟草花叶病毒病抗病基因标记，所述根结线虫病抗病基因上下游标记引物为分别为InMi1-F、InMi1-R或InMi2-F、InMi2-R，所述烟草花叶病毒病抗病基因上下游标记引物分别为InSW1-F、InSW1-R或者 InSW2-F、InSW2-R或者InSW3-F、InSW3-R，其中，
InMi1-F：AAATTATGAAAACAAGTATTTGGAG；
InMi1-R：AGAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC；
InMi2-F：ATTATGAAAACAAGTATTTGGAGT；
InMi2-R：GAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC；
InSW1-F：TGCTCAAATATATAAAAACATCCCTA；
InSW1-R：TTACCCTTTAATTCTAATCAAAAACT；
InSW2-F：GTTACCATACCTATAATGTTTGTTT；
InSW2-R：TAGGATATGAGTTTTTGATTAGAAT；
InSW3-F：CCATACCTATAATGTTTGTTTTA；
InSW3-R：GGATATGAGTTTTTGATTAGAAT。
一种采用权利要求1所述的标记进行鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)提取番茄叶片基因组DNA；
(2)利用引物权利要求1中的任意一对引物对步骤(1)提取的43个番茄亲本材料进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)扩增后的产物进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、显色、染色；
(4)根据步骤(3)的结果判断番茄的抗感性。
进一步地，所述步骤(1)包括以下步骤：
①取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；
②在磨好的样中加入600μl 2％的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min 摇晃一次；
③12000rpm离心5min，吸取350μl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250μl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④13000rpm离心2min，取250μl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550μl 无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；
⑤12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥待离心管中无酒精味时，加入100μl ddH2O溶解DNA；放4℃冰箱。
进一步地，所述步骤(2)的扩增包括以下步骤：
进行PCR扩增时采用的反应体系为15μL体系，其中提取番茄亲本材料的叶片基因组DNA 1μL，2*Taq MasterMix(for PAGE)7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；PCR扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。
进一步地，所述步骤(3)：在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。
进一步地，所述步骤(4)对步骤(3)中引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳抗感片段大小对比分析，得到抗感植株。
本发明的有益效果：
1.本发明中番茄抗性基因相关标记的引物是在已报道相关基因区域引物序列的基础上开发出的片段更小、标记更多的Indel引物序列，其具有特异性强，准确度高的特点。
2.用本发明的番茄抗性基因相关标记的引物及方法，可检测番茄材料是否具有抗感根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)或烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)。
3.本发明的番茄抗病基因相关标记的引物及方法，其PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测，扩增带型清晰，且有多个引物可以重复，准确度更高。
4.本发明避免传统的育种主要依赖于植株的表现型选择，环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率，大大缩短鉴定时间，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。
附图说明
图1表示已报道的番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)相关标记的引物 SCAR-1-F/SCAR-1-R，其中感病材料序列片段大小为432bp、抗病材料序列片段大小为380bp。
图2表示本文开发的番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)相关标记的引物 InMi1-F/
InMi1-R，其中感病材料序列片段大小为155bp、抗病材料序列片段大小为100bp。图3表示本文开发的番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)相关标记的引物 InMi2-F/
InMi2-R，其中感病材料序列片段大小为152bp、抗病材料序列片段大小为97bp。图4表示已报道的番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记的引物 SW-5-2-F/SW-5-2-R，其中感病材料序列片段大小为574bp、抗病材料序列片段大小为510bp/464bp。
图5表示本文开发的番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记的引物InSW1-F/InSW1-R，其中感病材料序列片段大小为280bp、抗病材料序列片段大小为220bp/205bp。
图6表示本文开发的番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记的引物InSW2-F/InSW2-R，其中感病材料序列片段大小为240bp、抗病材料序列片段大小为230bp/170bp。
图7表示本文开发的番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记的引物InSW3-F/InSW3-R，其中感病材料序列片段大小为240bp、抗病材料序列片段大小为230bp/170bp。
具体实施方式
面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
同时，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电性连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一：
以江苏绿港现代农业发展有限公司自主选育的番茄骨干亲本为试验材料，利用番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)和番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b) 相关标记已报道的引物SCAR-1-F/SCAR-1-R和SW-5-2-F/SW-5-2-R进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖凝胶电泳的PCR产物进行克隆、测序，利用软件 Primer 5设计出番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)的2对高效性引物 InMi1-F/InMi1-R和InMi2-F/InMi2-F；番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b) 的3对高效性引物InSW1-F/InSW1-R、InSW2-F/InSW2-R和InSW3-F/InSW3-R。本发明目的在于根据已报道的抗病基因的保守序列设计更多特异性引物，更加精准的检测番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)和番茄烟草花叶病毒病抗病基因 (SW-5b)，且该引物片段更短、扩增效率更高、特异性更好。
本发明所采用的技术方案：
本发明所述番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)的2对高效性引物 InMi1-F/InMi1-R和InMi2-F/InMi2-R，其特征在于：在抗病品种中扩增出150bp 左右的片段大小，在感病品种中扩增出100bp左右片段。番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)的3对高效性引物InSW1-F/InSW1-R、InSW2-F/InSW2-R和 InSW3-F/InSW3-R，在抗病品种中扩增出170/230bp左右的片段大小，在感病品种中扩增出280/240bp左右片段。
上述番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)相关标记引物序列为：
SCAR-1F：TGGAAAAATGTTGAATTTCTTTTG
SCAR-1R：GGGTAAACAAGCCATATAGTATGC
InMi1-F：AAATTATGAAAACAAGTATTTGGAG
InMi1-R：AGAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC
InMi2-F：ATTATGAAAACAAGTATTTGGAGT
InMi2-R：GAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC
上述番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记引物序列为：
SW-5-2-F：TTCCGCATCAGCCAATAGTGT
SW-5-2-R：AGATGGGCTTCAAGAACCTAATT
InSW1-F：TGCTCAAATATATAAAAACATCCCTA
InSW1-R：TTACCCTTTAATTCTAATCAAAAACT
InSW2-F：GTTACCATACCTATAATGTTTGTTT
InSW2-R：TAGGATATGAGTTTTTGATTAGAAT
InSW3-F：CCATACCTATAATGTTTGTTTTA
InSW3-R：GGATATGAGTTTTTGATTAGAAT
番茄抗病基因相关InDel标记引物序列开发的方法，包括以下步骤：
(1)提取番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病的抗感亲本材料各3个的叶片基因组DNA；
(2)利用已报道番茄根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)相关标记基因区域引物 SCAR-1-F/SCAR-1-R和番茄烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)相关标记基因区域引物SW-5-2-F/SW-5-2-R对步骤(1)提取的番茄抗感亲本材料的叶片基因组 DNA进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)对步骤(3)抗感番茄材料电泳产物进行克隆、测序；
(5)利用软件Primer5对步骤(4)番茄抗感材料测序结果设计引物；
(6)提取43个番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病的抗感亲本材料的叶片基因组DNA；
(7)利用已报道的引物SCAR-1-F/SCAR-1-R、SW-5-2-F/SW-5-2-R和我们开发的引物InMi1-F/InMi1-R、InMi2-F/InMi2-R、InSW1-F/InSW1-R、InSW2-F /InSW2-R、InSW3-F/InSW-R对步骤(6)提取的43个番茄亲本材料进行PCR扩增。
(8)对步骤(7)已报道的引物SCAR-1-F/SCAR-1-R、SW-5-2-F/SW-5-2-R PCR 扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳；引物InMi1-F/InMi1-R、InMi2-F/InMi2-R、 InSW1-F/InSW1-R、InSW2-F/InSW2-R、InSW3-F/InSW-R进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、显色、染色；
(9)对步骤(8)电泳结果进行比对分析。
所述步骤(1)和(6)中提取番茄亲本的叶片基因组DNA采用改良的CTAB法提取：①取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；
②在磨好的样中加入600μl 2％的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min 摇晃一次；
③12000rpm离心5min，吸取350μl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250μl 氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④13000rpm离心2min，取250μl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550μl 无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；
⑤12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥待离心管中无酒精味时，加入100μl ddH2O溶解DNA；放4℃冰箱；
所述步骤(2)中PCR扩增时采用的反应体系为25μL体系，其中提取黄瓜亲本及其杂交后代的叶片基因组DNA 2μL，2*Taq MasterMix(Dye)12.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至25μL；
所述步骤(2)和(7)中PCR扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行 35个循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。
所述步骤(3)中电泳检测时，在加有溴化乙锭(EB)的2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1X TAE缓冲液，电压为150v。电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察电泳条带，在365nm波长下分析DNA电泳条带大小，扫描图像并保存。
所述步骤(4)中克隆将步骤(3)的抗感番茄材料的PCR产物在紫外灯下切下含目的DNA的琼脂糖胶块，用PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物，与pMD-19-T 载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆，PCR法鉴定是否含有外源目标插入片段，将含有目标DNA的转化子进行测序，测序工作由杭州尚亚塞生物技术有限公司完成。
所述步骤(5)中根据步骤(4)测序出来的引物序列，利用Primer5软件引物序列大小控制在90bp-300bp之间。
所述步骤(6)方法如步骤(1)。
所述步骤(7)中利用已报道的引物SCAR-1-F/SCAR-1-R、SW-5-2-F/SW-5-2-R 进行PCR扩增方法如步骤(2)所述；我们开发的引物InMi1-F/InMi1-R、InMi2-F/ InMi2-R、InSW1-F/InSW1-R、InSW2-F/InSW2-R、InSW3-F/InSW-R进行PCR扩增时采用的反应体系为15μL体系，其中提取番茄亲本材料的叶片基因组DNA 1μ L，2*Taq MasterMix(for PAGE)7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；PCR扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。
所述步骤(8)中2％琼脂糖凝胶电泳方法如步骤(3)，在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。
所述步骤(9)对步骤(8)中已报道引物的琼脂糖凝胶电泳和本文开发引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳抗感片段大小对比分析，抗感植株吻合度达到100％，本文开发引物的抗感片段小于已报道的引物，且条带更清晰。
图1、2、3是对43个番茄亲本材料根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)的检测，由图1可知用已报道的引物SCAR-1-F/SCAR-1-R检测出感病番茄材料20个，抗病材料14个；由图2可知用本文开发的引物InMi1-F/InMi1-R检测出来感病番茄材料22个，抗病材料17个；由图3可知用本文开发的引物InMi2-F/InMi2-R 检测出来感病番茄材料21个，抗病材料16个。
图4、5、6、7是对43个番茄亲本材料烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b) 的检测，由图4可知用已报道的引物SW-5-2-F/SW-5-2-R检测出感病番茄材料 15个，抗病材料16个；由图5可知用本文开发的引物InSW1-F/InSW1-R检测出来感病番茄材料16个，抗病材料23个；由图6可知用本文开发的引物 InSW2-F/InSW2-R检测出来感病番茄材料16个，抗病材料22个；由图7可知用本文开发的引物InSW3-F/InSW3-R检测出来感病番茄材料16个，抗病材料21 个。
由图可知，本文开发的引物序列对番茄抗病基因相关标记的灵敏度更好，PCR 扩增出的条带更清晰，吻合度更高，检测结果较已报道的引物序列结果更准确。
因此，本实施例具有以下技术效果：
1.番茄抗性基因相关标记的引物是在已报道相关基因区域引物序列的基础上开发出的片段更小、标记更多的Indel引物序列，其具有特异性强，准确度高的特点。
2.番茄抗性基因相关标记的引物及方法，可检测番茄材料是否具有抗感根结线虫病抗病基因(Mi-1.2)或烟草花叶病毒病抗病基因(SW-5b)。
3.番茄抗病基因相关标记的引物及方法，其PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测，扩增带型清晰，且有多个引物可以重复，准确度更高。
4.避免传统的育种主要依赖于植株的表现型选择，环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率，大大缩短鉴定时间，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏绿港现代农业发展有限公司
<120> 番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法
<130> 20201020
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 1
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly
1 5 10 15
Thr Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly
20 25
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 2
Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 3
Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Thr Ala
1 5 10 15
Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Thr
20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
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Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
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Thr Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Thr Ala
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
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Thr Thr Ala Cys Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Cys Thr Ala
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Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 7
Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Ala
1 5 10 15
Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr
20 25
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Thr Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr
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Gly Ala Thr Thr Ala Gly Ala Ala Thr
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<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 10
Gly Gly Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala
1 5 10 15
Thr Thr Ala Gly Ala Ala Thr
20

Claims (6)

1.一种番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记，其特征在于，所述根结线虫病抗病基因上下游标记引物为分别为InMi1-F、InMi1-R或InMi2-F、 InMi2-R，所述烟草花叶病毒病抗病基因上下游标记引物分别为InSW1-F、InSW1-R或者InSW2-F、InSW2-R或者InSW3-F、InSW3-R，其中，
InMi1-F：AAATTATGAAAACAAGTATTTGGAG；
InMi1-R：AGAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC；
InMi2-F：ATTATGAAAACAAGTATTTGGAGT；
InMi2-R：GAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC；
InSW1-F：TGCTCAAATATATAAAAACATCCCTA；
InSW1-R：TTACCCTTTAATTCTAATCAAAAACT；
InSW2-F：GTTACCATACCTATAATGTTTGTTT；
InSW2-R：TAGGATATGAGTTTTTGATTAGAAT；
InSW3-F：CCATACCTATAATGTTTGTTTTA；
InSW3-R：GGATATGAGTTTTTGATTAGAAT。
2.一种采用权利要求1所述的标记进行鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取番茄叶片基因组DNA；
利用引物权利要求1中的任意一对引物对步骤（1）提取的43个番茄亲本材料进行PCR扩增；
（3）对步骤（2）扩增后的产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳、显色、染色；
（4）根据步骤（3）的结果判断番茄的抗感性。
3.根据权利要求2所述的标记进行鉴定的方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下步骤：
① 取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入600µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min摇晃一次；
③ 12000rpm离心5min，吸取350µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④ 13000rpm离心2min，取250µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；
⑤ 12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA；放4℃冰箱。
4.根据权利要求2所述的标记进行鉴定的方法，其特征在于，所述步骤（2）的扩增包括以下步骤：
进行PCR扩增时采用的反应体系为15μL体系，其中提取番茄亲本材料的叶片基因组DNA1μL，2*Taq MasterMix (for PAGE) 7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；PCR扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s， 58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。
5.根据权利要求2所述的标记进行鉴定的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，电泳检测包括以下步骤：在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。
6.根据权利要求2所述的标记进行鉴定的方法，其特征在于，所述步骤（4）对步骤（3）中引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳抗感片段大小对比分析，得到抗感植株。
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Denomination of invention: Tomato root-knot nematode and tobacco mosaic virus disease resistance gene markers and methods

Effective date of registration: 20220901

Granted publication date: 20220520

Pledgee: Jiangsu SINOSURE technology microfinance Co.,Ltd.

Pledgor: JIANGSU GREENPORT MODERN AGRICULTURAL DEVELOPMENT Co.,Ltd.

Registration number: Y2022980014217

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