CN112625984A - 一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明以E.coli BW25113为宿主菌，构建了异淀粉酶的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）。本发明基因工程菌表达异淀粉酶蛋白活性高，其酶活可达3936 U/g，生产成本低。本发明基因工程菌能够广泛应用于α‑环糊精工业生产。

Description

一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，它涉及一种异淀粉酶的基因工程菌及其在合成α-环糊精中的应用。
背景技术
异淀粉酶是淀粉酶家族的重要成员，属于淀粉脱支酶的一种。异淀粉酶是一种内切型淀粉酶，能专一性地切开支链淀粉分支点的α-1，6-糖苷键，可以剪下整个侧支，形成直链淀粉，且不能水解直链分子中的α-1，6-糖苷键。由于异淀粉酶对底物中α-1，6-糖苷键位置的特异性强，因而被广泛应用于酶制剂或食品加工业的加工助剂。异淀粉酶单独使用可使支链淀粉变为直链淀粉，也可与糖化酶、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、4-α-葡聚糖转移酶等淀粉酶配合使用生产葡萄糖、麦芽糖、环糊精、抗性淀粉等产品，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其他糖化酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前虽然国内在异淀粉酶研究上有相关报道，但现在市场上的商业化产品仍主要为进口酶制剂。目前仍急需研究可以商业化应用的异淀粉酶来扩大异淀粉酶库。
现有技术有报道异淀粉酶TfIA，来源于嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca），其具有较高活性的酶，在大肠杆菌中能够实现重组表达。源于Thermobifida cellulosilyticaTB100菌的异淀粉酶基因A0A147KK56在核苷酸水平上与TfIA同源性高于85%，其表达的蛋白与TfIA具有相当的异淀粉酶活性。目前，A0A147KK56在大肠杆菌中的重组表达还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种异淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程菌是以E.coli BW25113（购自Biovector NTCC INC，货号为355297）为宿主菌，表达异淀粉酶基因A0A147KK56，异淀粉酶A0A147KK56的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因工程菌的具体构建方法是：将异淀粉酶基因A0A147KK56连接到表达载体pBAD HisB（购自Invitrogen公司，产品目录号V430-01）上，得到合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB；将合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到大肠杆菌E.coli BW25113宿主菌中，得到基因工程菌E.coliBW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）。
所述合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到大肠杆菌E.coli BW25113宿主菌的具体步骤为：
(1)取一支储存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受态细胞在冰上解冻20~30 min；
(2)在合成质粒固体粉末中加入40 μL的ddH2O，充分混匀；
(3)取2~3 μL的步骤（2）合成质粒溶液加入步骤（1）解冻后的感受态细胞中，加入过程中用手指轻轻拨弹；
(4)将步骤（3）产物在冰上放置20~30 min，再将其放置在42℃水浴锅中水浴120 s进行热击，热击完成后立即取出放回冰上静置2~5 min；
(5)加入800 μL的2YT液体培养基，并在振荡频率为200 rpm的37℃振荡培养箱培养40min；
(6)取步骤（5）的转化菌液50 μL涂布于2YT固体培养基平板上，于37℃培养10~12 h；
(7)挑选单菌落至含100 μg/mL氨苄青霉素的抗性液体2YT培养基中，于37℃培养6~8h；
(8)取等体积菌液与等体积无菌80%（体积）甘油溶液混合放置于保菌管，储存于-80℃冰箱，备用。
所述异淀粉酶的基因工程菌诱导产酶的具体方法如下：
(1)将-80℃保存的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）在2YT固体培养基平板上划线分离，于37℃恒温培养箱中培养24 h，得到单克隆菌落；
(2)挑取单克隆菌落接种至2YT液体培养基中，于37℃培养4~6 h，后将所得培养液按1%~2%的接种量接种至摇瓶中，于37℃，200 rpm培养2~3 h后；
(3)用最终浓度为1%~2%（质量）的阿拉伯糖诱导产酶，诱导温度为25℃~30℃，诱导转速为220 rpm，诱导时间为14~18 h。
所述2YT固体培养基成分为分子级蛋白胨9~11 g/L，分子级酵母粉4~6 g/L，NaCl4~6 g/L，琼脂粉1.5%~2%（质量），氨苄青霉素100 μg/mL，pH为6.8~7.2。
所述2YT液体培养基成分为分子级蛋白胨9~11 g/L，分子级酵母粉4~6 g/L，NaCl4~6 g/L，pH为6.8~7.2。
本发明的另一个目是提供一种上述异淀粉酶的基因工程菌在合成α-环糊精中的应用方法。
本发明所指诱导时间是指从加入诱导剂阿拉伯糖开始算起。
本发明的有益效果：
本发明构建的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB），具有高产异淀粉酶的优点，最高酶活力可达3936 U/g，比相同条件下，基因工程菌E.coli BW25113(TfIA/pBAD HisB）的酶活力3027 U/g提高了30%，可用于异淀粉酶的大批量生产。
本发明构建的基因工程菌表达的异淀粉酶粗酶液，在无水乙醇存在下与α-环糊精葡萄糖基转移酶共同作用于100 g/L可溶性淀粉，能够产生50 g/L的α-环糊精，可以应用于α-环糊精的工业生产。
附图说明
图1为摇瓶发酵18 h时，OD600=0.05基因工程菌破壁上清SDS-PAGE电泳图，其中孔道1，2分别为E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）在30℃和25℃诱导产生的蛋白，孔道3，4分别为E.coli BW25113(TfIA/pBAD HisB）在30℃和25℃诱导产生的蛋白。
图2为25℃诱导温度下，重组工程菌E.coli BW25113(TfIA/pBAD HisB）及E.coliBW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）产酶的活力。
图3为用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切载体pBAD HisB，回收载体骨架4.1 kb。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，如无特别说明，本发明中所使用的试剂和耗材均为市购获得的常规产品。
培养基：
2YT固体培养基平板的制备：分子级蛋白胨9~11 g/L，分子级酵母粉4~6 g/L，NaCl 4~6g/L，琼脂粉1.5%~2%（质量），pH为6.8~7.2，混合均匀，于121℃，灭菌20 min，后室温放置冷却至50~55℃后，于超净工作台中添加终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，混合均匀，15 mL/皿分装到直径为90 mm的无菌培养皿中，静置冷却，备用。
2YT液体培养基制备：分子级蛋白胨9~11 g/L，分子级酵母粉4~6 g/L，NaCl 4~6g/L，pH为6.8~7.2，混合均匀，于121℃，灭菌20 min，后室温放置冷却，备用。
实施例一
一、基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）的构建
1、设计一对引物，由AF和AR组成。
AF：5’ - CGAGCCTCGAGATGGTGGAAGTCTGGC -3’
AR：5’- ATTCGCATATGTTATCAGTCCCCCGAAGCCTC-3’
AF中，波浪线标注的是Xho1酶切识别序列，双下划线标记靶序列对应的区域。AR中，波浪线标注的是Kpn1酶切识别序列，双下划线标记靶序列对应的区域。
2、以Thermobifida cellulosilytica TB100菌中的基因A0A147KK56为模板，用AF和AR组成引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。50 μL PCR反应体系为：模板1 μL, 引物各1μL， 2×高保真酶溶液25 μL，ddH2O 22 μL；PCR反应条件为：95℃预变性3 min，再95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环后， 72℃延伸0 min，然后保持10℃。
3、用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切步骤2的PCR产物，得到酶切产物。
4、用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切载体pBAD HisB，回收载体骨架4.1 kb，如图3所示。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。连接体系为载体骨架与酶切产物的浓度比为1:3~1:5，添加Gibson反应液6 μL，该反应体系于50℃反应1 h后，获得质粒A0A147KK56/pBAD HisB，其中异淀粉酶A0A147KK56的核苷酸序列是SEQ IDNO.1。
6、将合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到E.coli BW25113宿主菌得到基因工程菌E.coli BW25113（A0A147KK56/pBAD HisB）。
转化步骤为：（1）取一支储存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受态细胞在冰上解冻20~30 min；（2）在合成质粒固体粉末中加入40 μL的ddH2O，充分混匀；（3）取2~3 μL的合成质粒溶液加入解冻后的感受态细胞中，加入过程中用手指轻轻拨弹；（4）将步骤（3）产物在冰上放置20~30 min，再将其放置在42℃水浴锅中水浴120 s进行热击，热击完成后立即取出放回冰上静置2~5 min；（5）加入800 μL的2YT液体培养基，并在振荡频率为200 rpm的37℃振荡培养箱（购自上海智诚分析仪器制造有限公司，型号ZWY-2102C）培养40min；（6）取步骤（5）的转化菌液50 μL涂布于2YT固体培养基平板上，于37℃培养10~12 h；（7）挑选单菌落至含100 μg/mL氨苄青霉素的抗性液体2YT培养基中，于37℃培养6~8 h；（8）取等体积菌液与等体积无菌80%（体积）甘油溶液混合放置于保菌管，储存于-80℃冰箱，备用。
二、基因工程菌E.coli BW25113(TfIA/pBAD HisB）的构建
1、设计一对引物，由TF和TR组成。
TF：5’ - CCGAGCCTCGAG ATGCCCATGG TGGAAGTCTG -3’
TR：5’- TTCGCATATGCATATGTTATCAGGAGGGCAGGGCTTTCG-3’
TF中，波浪线标注的是Xho1酶切识别序列，双下划线标记靶序列对应的区域。TR中，波浪线标注的是Kpn1酶切识别序列，双下划线标记靶序列对应的区域。
2、 以嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）基因组TfIA为模板，用TF和TR组成引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。50 μL PCR反应体系为：模板1 μL, 引物各1 μL， 2×高保真酶溶液25 μL，ddH2O 22 μL；PCR反应条件为：95℃预变性3 min，再95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环后， 72℃延伸0 min，然后保持10℃。
3、用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切步骤2的PCR产物，得到酶切产物。
4、用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切载体pBAD HisB，回收载体骨架4.1kb，见图3。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。连接体系为载体骨架与酶切产物的浓度比为1:3~1:5，添加Gibson反应液6 μL，该反应体系于50℃反应1 h后，获得质粒TfIA/pBAD HisB，其中异淀粉酶TfIA的核苷酸序列是SEQ ID NO.2。
6、将合成的质粒TfIA/pBAD HisB转化到E.coli BW25113宿主菌得到基因工程菌E.coli BW25113（TfIA/pBAD HisB）。
转化步骤为：（1）取一支储存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受态细胞在冰上解冻20~30 min；（2）在合成质粒固体粉末中加入40 μL的ddH2O，充分混匀；（3）取2~3 μL的合成质粒溶液加入解冻后的感受态细胞中，加入过程中用手指轻轻拨弹；（4）将步骤（3）产物在冰上放置20~30 min，再将其放置在42℃水浴锅中水浴120 s进行热击，热击完成后立即取出放回冰上静置2~5 min；（5）加入800 μL的2YT液体培养基，并在振荡频率为200 rpm的37℃振荡培养箱培养40 min；（6）取步骤（5）转化菌液50 μL涂布于2YT固体培养基平板上，于37℃培养10~12 h；（7）挑选单菌落至含100 μg/mL氨苄青霉素的抗性液体2YT培养基中，于37℃培养6~8 h；（8）取等体积菌液与等体积无菌80%（体积）甘油溶液混合放置于保菌管，储存于-80℃冰箱，备用。
三、异淀粉酶制备方法及酶活力测定
1、 将-80℃保存的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）及E.coliBW25113（TfIA/pBAD HisB）菌株分别在含氨苄青霉素的2YT固体培养基平板上划线分离，于37℃恒温培养箱中培养24 h，得到单克隆菌落。挑取单克隆菌落接种至2YT液体培养基中于37℃培养4~6 h，后将所得培养液分别按1%~2%的接种量接种至摇瓶中，于37℃，200 rpm培养2~3 h后，用最终浓度为1%~2%（质量）的阿拉伯糖诱导产酶，诱导温度为25℃~30℃，诱导转速为220 rpm，诱导时间为14~18 h。测定其细胞浓度（OD600），并取OD600=100的发酵液于4000 rpm离心机中4℃离心，收集菌体。用pH7.0，100 mM Tris-HCl缓冲液悬浮细胞，超声破碎，蛋白纯化后测定两种酶的活力。
2、酶活力测定方法：吸取50 μL经过pH7.0，100 mM Tris-HCl缓冲液稀释的纯化酶液，终浓度为12.5 μg/mL，加入到含有450 mL 1%（质量/体积）可溶性淀粉的18 mm×18 cm试管中，50℃预热10 min，后50℃孵育30 min。孵育后取出加入0.5 mL I2-KI指示剂，混匀后用水稀释6倍。用紫外分光光度计（购自岛津，UV-1800）测定稀释液在610 nm下吸光度。1个单位的异淀粉酶定义为50℃，pH7.0条件下，每克酶作用于可溶性淀粉1 min导致其在610nm吸光度值变化0.01个吸光度的酶量。
如图1所示，为摇瓶发酵18 h时，OD600=0.05基因工程菌破壁上清的SDS-PAGE蛋白电泳图，蛋白电泳结果显示：在约70kDa处有一条与理论分子量一致的条带。同时，酶活测定的实验结果如图2所示，25℃诱导重组工程菌BW25113（A0A147KK56/pBAD HisB）的淀粉酶活力为3936 U/g，高于重组工程菌E.coli BW25113（TfIA/pBAD HisB）的淀粉酶活力3027 U/g。
实施例二本发明基因工程菌在制备α-环糊精中的应用
1、设计一对引物，由CF和CR组成。
CF：5’ - CCGAGCCTCGAG AAGAAAACGG CTATCGCGAT -3’
CR：5’- TTCGCATATGCATATGTTAATTCTGCCAATCAACAGTTA-3’
CF中，波浪线标注的是Xho 1酶切识别序列，双下划线标记靶序列对应的区域。CR中，波浪线标注的是Kpn 1酶切识别序列，双下划线标记靶序列对应的区域。
2、以软腐芽孢杆菌（Bacillus macerans）基因组α-CGTase为模板，用CF和CR组成引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。50 μL PCR反应体系为：模板1 μL, 引物各1 μL， 2×高保真酶溶液25 μL，ddH2O 22 μL；PCR反应条件为：95℃预变性3 min，再95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环后， 72℃延伸0 min，然后保持10℃。
3、用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切步骤2的PCR产物，得到酶切产物。
4、用限制性内切酶Xho1和Kpn1双切载体pBAD HisB，回收载体骨架4.1kb。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。连接体系为载体骨架与酶切产物的浓度比为1:3~1:5，添加Gibson反应液6 μL。该反应体系于50℃反应1 h后，获得质粒α-CGTase/pBAD HisB，其中α-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列是SEQ IDNO.3。α-环糊精葡萄糖基转移酶能够以直链淀粉为底物，合成α-环糊精。
6、将合成质粒α-CGTase/pBAD HisB转化到E.coli BW25113宿主菌得到基因工程菌E.coli BW25113（α-CGTase/pBAD HisB）。
转化步骤为：（1）取一支储存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受态细胞在冰上解冻20~30 min；（2）在合成质粒固体粉末中加入40 μL的ddH2O，充分混匀；（3）取2~3 μL的合成质粒溶液加入解冻后的感受态细胞中，加入过程中用手指轻轻拨弹；（4）将步骤（3）产物在冰上放置20~30 min，再将其放置在42℃水浴锅中水浴120 s进行热击，热击完成后立即取出放回冰上静置2~5 min；（5）加入800 μL的2YT液体培养基，并在振荡频率为200 rpm的37℃振荡培养箱培养40 min；（6）取步骤（5）转化菌液50 μL涂布于2YT固体培养基平板上，于37℃培养10~12 h；（7）挑选单菌落至含100 μ/gmL氨苄青霉素的抗性液体2YT培养基中，于37℃培养6~8 h；（8）取等体积菌液与等体积无菌80%（体积）甘油溶液混合放置于保菌管，储存于-80℃冰箱，备用。
7、A0A147KK56粗酶液制备
将构建的基因工程菌BW25113（A0A147KK56/pBAD HisB）在含氨苄青霉素的2YT固体培养基平板上划线分离，于37℃恒温培养箱中培养24 h，得到单克隆菌落。挑取单克隆接种至2YT液体培养基中于37℃培养4~6 h，后将所得的培养液按1%~2%的接种量接种至摇瓶中，于37℃，200 rpm摇床中培养2~3 h后，用最终浓度为1%~2%（质量）的阿拉伯糖诱导产酶，诱导温度为25~30℃，诱导转速为220 rpm，诱导时间为14~18 h。测定其细胞浓度（OD600），并取OD600=100的发酵液于4000 rpm离心机中4℃离心，收集菌体，用pH 7.0，100 mM的Tris-HCl缓冲液重悬菌体后，超声破碎，8000 rpm离心机中4℃离心10min，上清液即为A0A147KK56粗酶液，冰上放置待用。
8、TfIA粗酶液和α-CGTase粗酶液的制备
TfIA粗酶液和α-CGTase粗酶液制备方法与A0A147KK56粗酶液制备方法相同。
9、制备α-环糊精
将150 g/L底物的可溶性淀粉水溶液煮沸10 min，室温冷却。取2 mL加入新的EP管中，然后按照500 U/g底物加入异淀粉酶A0A147KK56和8~12OD/mL α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGTase）混合，添加终浓度为10%（体积）的无水乙醇，后用100 mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液定容至3 mL，得到终浓度为100 g/L可溶性淀粉反应液。混合均匀后于振荡频率为200rpm的40℃振荡摇床反应8-12 h，产物在150℃加热解除产物与无水乙醇之间的作用，得到α-环糊精溶液。
HPLC检测条件为：安捷伦HPLC色谱仪，Waters NH2色谱柱（4.6mm×150mm），RID检测器，流动相由70%乙腈、30%水和1‰氨水组成，流速为0.7 mL/min，柱温为40℃。HPLC检测结果显示，基因工程菌BW25113（A0A147KK56/pBAD HisB）粗酶液与基因工程菌E.coliBW25113（α-CGTase/pBAD HisB）粗酶液共同作用可生成50 g/L的α-环糊精；基因工程菌E.coli BW25113（TfIA/pBAD HisB）粗酶液与工程菌E.coli BW25113（α-CGTase/pBADHisB）粗酶液共同作用可生成40 g/L的α-环糊精。因此，构建的基因工程菌BW25113（A0A147KK56/pBAD HisB）能够与基因工程菌E.coli BW25113（α-CGTase/pBAD HisB）共同作用应用于合成α-环糊精。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司
<120> 一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggtggaag tctggcccgg caccccctac ccgctcggag cgacctacga cggctccggg 60
acgaacttct cgctcttctc cgaggtcgcc accggggtgg agctgtgcct gttcgacgac 120
gacggcgcgg agacccggat cgagctgacc gagcgggacg gccacgtctg gcacggctac 180
ctgccggggg tggggccggg gcagcgctac ggctaccggg tgcacggccc ccacgacccg 240
gcgcgcggcc tgcgctgcaa cccgaacaag ctgctggtcg acccctacgc caaggccatc 300
gacgggcgga tcgagtggca cgagtcgctg ttcgactacc acttcgacga cccgtcgcgg 360
gtcaacaacc acgacagcgc cccctacctg cccaagtgcg tggtggtcag cccgttcttc 420
gactggggca acgagaagcg gcccgccgtc ccctaccacg agacggtgat ctacgagacc 480
cacgtgcgcg ggatgaccgt gcgccacccc gaggtgcccg agcgcctgcg cggcacctac 540
gccggcatgg cccatcccgc cgtcgtcgac cacctgcgcg cgctcggcgt caccgcggtg 600
gagctgatgc cggtccacca cttcctgccc gagcacgccc tggtcgcgcg gggcctgacc 660
aactactggg gctacaacac gctggcgttc ctggcgcccg acagcgggta cgcggcgacc 720
ggcacccgcg gcgagcaggt ccaggagttc aaggcgatgg tcaaggccct gcacgaggcg 780
ggcatcgagg tcatcctcga cgtggtctac aaccacaccg ccgagggcga ccacatgggg 840
ccgacgctgt cgctgcgcgg catcgacaac ctggcctact accgggtgcg cgaggacgac 900
cggcgctact acctcgacta caccggctgc ggcaacagcc tcaacatgcg gcacccgcac 960
tcgttgcagt tgatcatgga ctcgctgcgg tactgggtgc tggagatgca cgtcgacggg 1020
ttccggttcg acctggcctc ggcgctggcc cgggagttcc acgacgtgga ccggctcagc 1080
acgttcttcg acatcgtgca gcaggacccg gtgatctccc aggtcaagct gatcgccgag 1140
ccgtgggacg tgggtcccgg cggctaccag gtgggcaact tcccgccgct gtggagcgag 1200
tggaacggca agtaccgcga caccgtccgc gacttctggc gcggctaccc ggtcctgccg 1260
gaactggcgt cgcgactgtc gggctcctcc gacctgtacc aggccgacgg gcgccgcccg 1320
gtggcctccg tcaacttcgt cacctgccac gacggcttca ccctggccga cctggtctcc 1380
tacgaccgca agcacaacga ggccaacggg gaggacaacc gggacggcac cgacgacaac 1440
cgctcctgga accacggcgt ggaggggccc accgacgacc cggaggtcac cgcgctgcgc 1500
cgccgccagg tgcgcaacat gctcgccacg ctcatgctca gccagggcgt gccgatgctc 1560
tcgcacggcg acgagatcgg ccgcacccag cacggcaaca acaacgccta ctgccaggac 1620
aacgagatcg cctggatgga ctgggagctg ggcgaggagc aggaggagct gctggagttc 1680
gtgcggaggc tgtcccgact gcgccgcggg cacccggtgt tccgccgccg ccggttcttc 1740
cagggcgacc tgtccggtca gggccggcag cgcgacatcg cctggctgcg ccccgacggg 1800
gggctcatgg ccgactccga ctggggtcgg ggcgggcggg cgctgggggt gttcctcaac 1860
ggcgacgcca tcaccgagcc cgaccggctg ggccgccggg tgcgcgacga ctcgttcctg 1920
ctgctgttga acgcggaggt cggcagcgtg cgcttcaccc tgccggaccg cagttacggc 1980
tcggcctggg agacggttgt ggacacggcc gaacccggcg tgaccggtcg tcccctcctg 2040
ctcgcgggcg gcggcgtgac cgtggtcgac cgggcgtttc tcgtgctcag aagggtgggg 2100
gaggcttcgg gggactga 2118
<210> 2
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgcccatgg tggaagtctg gcctggtcac gcgtatccgc tcggggcgac ctacgacggg 60
tccggaacca acttctcgct tttctccgaa gtcgcgaccg gggtagaact ctgcctgttc 120
gacgacgacg gggcggagac tcgggttccg ctcaccgaac aggacggcca cgtctggcac 180
ggctacctgc cgacggtggg tcccggacag cggtacggat accgcgtcca cggaccttac 240
gatccggaac gtggcctccg ctgcaacccc aacaagctcc tcgtcgaccc ctacgccaag 300
gccatcgacg ggcagattca ctggcacgag tccctcttcg actaccactt tgccgaccct 360
ggccgggtca acaaccacga cagcgccccc tacgtcccca cctgcgtcgt cgtcagcccg 420
ttcttcgact ggggggccga acagcacccc aacatcccct accacgagac ggtcatctac 480
gaggcccacg tccgcgggat gaccatccgc caccccgacg tgccgccgcc gctccgcggc 540
acctacgccg gaatggcgca ccccgccatc atcgagcacc ttctctccct gggcgtcacc 600
gcggtggagc tcatgccgat ccaccacttc ctgccggagc acgccctggt cgcccgaggg 660
ctcaccaact attggggcta caacaccctg gcgttcttcg cgccgcacag cggatacgcc 720
gccaccggga cccggggcca tcaagtccag gagttcaaaa ccatggtcaa ggccctccac 780
caggcgggga tcgaagtcat cctcgacgtg gtgtacaacc acaccgcgga aggcgaccac 840
atgggccccg ccctgtccct gcgcggcatc gacaacctcg cctactaccg ggtgcgggaa 900
gacaatccgc gctactacct ggactacacc ggctgcggca acagcctcaa cgtgcgccac 960
ccgcactcgc tgcagctcat catggactcg ctgcgctact gggtgctcga catgcacgtc 1020
gacggtttcc gctttgacct cgccgccgcc ctcgcccggg agttccacga cgtggaccgg 1080
ctcagcacat tcttcgacat tgtccagcag gacccggtca tctcccaggt caagctcatt 1140
gccgaaccgt gggacgtggg ccccggcggc taccaggtcg gtaacttccc gcccctgtgg 1200
accgagtgga acgggaaata ccgcgacact gtccgcgact tctggcgggg ctaccccgta 1260
ctgccggagc tcgcctcccg catctccggc tcctccgacc tctaccaggc cgacgggcgc 1320
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gtctcctacg accgcaaaca caacgaagcc aacggggagg acaaccggga cggcaccgac 1440
gacaaccgct cgtggaacca cggcacggaa ggccccacca ccgactctgc catcgccacg 1500
ctgcgccgcc gccagatgcg caacatgctg accacgctca tgctcagcca aggcgtgccc 1560
atgctctccc acggcgacga gatcggccgt acccaacacg gcaacaacaa cgcctactgc 1620
caggacaacc ccatctcctg ggtggactgg gagctcgccc gccgcaacgc cgacctgctc 1680
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tacttgcccg ccggcagcga cgtcaccgtg atcgaccggt cgttcctggt gctcaagggg 2100
gtgacgaaag ccctgccctc ctga 2124
<210> 3
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aagaaaacgg ctatcgcgat cgcggttgct ttggcaggct ttgcgaccgt agcgcaggcg 60
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ggcgatcgct caaacctgaa actgtacttt ggtggcgatt ggcagggtat catcgataag 240
attaacgacg gttatcttac cggcatgggt gtaaccgctc tgtggatcag tcaaccagtg 300
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tgggctcgcg atttcaaaca gactaacgac gcgtttggtg atttcgcaga tttccagaac 420
ctcattgata cggcccacgc gcacaacatc aaagtggtta tcgattttgc tccgaaccac 480
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actgatttct ccaccattga ggacggtatc tacaagaact tgtacgatct ggctgacatt 660
aaccataaca acaatgcgat ggacgcttat tttaagtctg caattgatct gtggctgggt 720
atgggtgttg acggtattcg ttttgatgcc gttaagcaca tgccgttcgg ttggcagaag 780
agcttcgtct cttctatcta cggtggggac cacccggttt ttacctttgg tgaatggtac 840
ctgggcgcag atcagaccga tggcgataac attaaattcg cgaacgaatc cggcatgaac 900
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gttagcgtgc cggcaggtac caaactggat ttcaaattca tcaaaaaagg tggtggcacc 2040
gtcacctggg agggtggcgg taaccacact tacaccactc cggcttcgtc ggtaggcacc 2100
gtaactgttg attggcagaa t 2121
序列表
<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司
<120> 一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
atggtggaag tctggcccgg caccccctac ccgctcggag cgacctacga cggctccggg 60
acgaacttct cgctcttctc cgaggtcgcc accggggtgg agctgtgcct gttcgacgac 120
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gaggcttcgg gggactga 2118
<210> 2
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
atgcccatgg tggaagtctg gcctggtcac gcgtatccgc tcggggcgac ctacgacggg 60
tccggaacca acttctcgct tttctccgaa gtcgcgaccg gggtagaact ctgcctgttc 120
gacgacgacg gggcggagac tcgggttccg ctcaccgaac aggacggcca cgtctggcac 180
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tacagcgcgg cgtgggagac ggtggtcgac acggccgacc ctgaggtggc cggccgcccc 2040
tacttgcccg ccggcagcga cgtcaccgtg atcgaccggt cgttcctggt gctcaagggg 2100
gtgacgaaag ccctgccctc ctga 2124
<210> 3
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
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agtccggata cctcggttga caacaaagta aacttctcca ctgatgttat ttaccagatc 120
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gaaaacatta cctcggtaat caaatactcg ggtgttaaca acactagcta tcacggctac 360
tgggctcgcg atttcaaaca gactaacgac gcgtttggtg atttcgcaga tttccagaac 420
ctcattgata cggcccacgc gcacaacatc aaagtggtta tcgattttgc tccgaaccac 480
acttctccgg ctgaccgcga caacccgggt ttcgcggaga atggtgcgct gtacgataac 540
ggcagcctgc tgggtgctca cagtaacgat accgcgggtc tgttccatca caacggtggt 600
actgatttct ccaccattga ggacggtatc tacaagaact tgtacgatct ggctgacatt 660
aaccataaca acaatgcgat ggacgcttat tttaagtctg caattgatct gtggctgggt 720
atgggtgttg acggtattcg ttttgatgcc gttaagcaca tgccgttcgg ttggcagaag 780
agcttcgtct cttctatcta cggtggggac cacccggttt ttacctttgg tgaatggtac 840
ctgggcgcag atcagaccga tggcgataac attaaattcg cgaacgaatc cggcatgaac 900
ctgttggatt tcgagtatgc acaggaagta cgtgaggtct tccgtgacaa aaccgaaacc 960
atgaaggact tatacgaagt cttggcttct actgaaagcc agtacgacta catcaacaac 1020
atggtaacct tcatcgacaa ccatgacatg gaccgtttcc aggttgctgg tagcggtact 1080
cgtgctacag aacaggctct ggccttgact ctgacctccc gtggtgttcc tgctatttac 1140
tacggtaccg aacaatacat gaccggtgat ggtgacccaa acaaccgtgc aatgatgacc 1200
tccttcaaca cgggtacgac cgcatacaaa gttatccaag ctctggcacc gctgcgtaag 1260
agcaaccctg ctatcgcata cggcaccacc actgagcgtt gggtgaacaa cgacgttctg 1320
attatcgaac gtaagtttgg ttcttcggcg gctctggtgg caatcaaccg taactcctcg 1380
gcagcttacc cgatcagcgg cctgctgtct tctctcccgg cgggtacata ttctgacgtg 1440
ctgaacggtc tgctgaacgg caactctatt actgttggca gtggcggcgc ggttacaaac 1500
ttcacactgg cggcgggtgg taccgcagta tggcagtaca ccgccccgga aacttccccg 1560
gcaatcggca acgtgggccc gacgatgggt caaccgggca acattgtaac cattgacggc 1620
cgcggtttcg gcggcacggc tggcaccgta tactttggca ccactgcggt taccggtagt 1680
ggtattgttt cttgggaaga tacccagatt aaagctgtga ttccgaaagt cgcagcgggt 1740
aagaccggtg tctctgttaa aacctcctct ggtaccgcca gcaacacgtt caaaagtttc 1800
aatgtgctga ccggcgatca agtcaccatg cgtttccttg tgaaccaggc aaacaccaac 1860
tacggtacca acgtttactt ggtcgggaat gcggcggagc tgggcagctg ggacccgaat 1920
aaagcaatcg gtccgatgta caaccaagtt atcgcaaaat atccgagctg gtactatgac 1980
gttagcgtgc cggcaggtac caaactggat ttcaaattca tcaaaaaagg tggtggcacc 2040
gtcacctggg agggtggcgg taaccacact tacaccactc cggcttcgtc ggtaggcacc 2100
gtaactgttg attggcagaa t 2121

Claims (6)

1.一种异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以E.coli BW25113为宿主菌，表达异淀粉酶基因A0A147KK56，所述异淀粉酶基因A0A147KK56的核苷酸序列如SEQNo.1所示，所述基因工程菌构建方法为：将异淀粉酶基因A0A147KK56连接到表达载体pBADHisB上，得到合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB；将合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到大肠杆菌E.coli BW25113宿主菌中，得到基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBADHisB）。
2.根据权利要求1所述的异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于所述合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到大肠杆菌E.coli BW25113宿主菌的具体步骤为：
（1）取一支储存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受态细胞在冰上解冻20~30 min；
（2）在合成质粒固体粉末中加入40 μL的ddH2O，充分混匀；
（3）取2~3 μL的步骤（2）合成质粒溶液加入步骤（1）解冻后的感受态细胞中，加入过程中用手指轻轻拨弹；
（4）将步骤（3）产物在冰上放置20~30 min，再将其放置在42℃水浴锅中水浴120 s进行热击，热击完成后立即取出放回冰上静置2~5 min；
（5）加入800 μL的2YT液体培养基，并在振荡频率为200 rpm的37℃振荡培养箱培养40min；
（6） 取步骤（5）的转化菌液50 μL涂布于2YT固体培养基平板上，于37℃培养10~12 h；
（7）挑选单菌落至含100 μg/mL氨苄青霉素的抗性液体2YT培养基中，于37℃培养6~8h；
（8）取等体积菌液与等体积无菌80%（体积）甘油溶液混合放置于保菌管，储存于-80℃冰箱，备用。
3.根据权利要求1或2所述的异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述异淀粉酶的基因工程菌诱导产酶的具体方法如下：
（1）将-80℃保存的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）在2YT固体培养基平板上划线分离，于37℃恒温培养箱中培养24 h，得到单克隆菌落；
（2）挑取单克隆菌落接种至2YT液体培养基中，于37℃培养4~6 h，后将所得培养液按1%~2%的接种量接种至摇瓶中，于37℃，200 rpm培养2~3 h后；
（3）用最终浓度为1%~2%（质量）的阿拉伯糖诱导产酶，诱导温度为25℃~30℃，诱导转速为220 rpm，诱导时间为14~18 h。
4.根据权利要求3所述的异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述2YT固体培养基成分为分子级蛋白胨9~11 g/L，分子级酵母粉4~6 g/L，NaCl 4~6 g/L，琼脂粉1.5%~2%（质量），氨苄青霉素100 μg/mL，pH为6.8~7.2。
5.根据权利要求3所述的异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述2YT液体培养基成分为分子级蛋白胨9~11 g/L，分子级酵母粉4~6 g/L，NaCl 4~6 g/L，pH为6.8~7.2。
6.根据权利要求1~5任一项所述的异淀粉酶的基因工程菌在合成α-环糊精中的应用。
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