CN112625950B - 一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂及其制备方法和应用。所述增绿菌剂由混合菌体种子液通过扩培制成的，其中包括采用保藏编号为CGMCC No.20918的丝状芽孢杆菌GBW‑F006、CGMCC No.20919的植物内芽孢杆菌GBW‑F008和CGMCC No.14499的丁酸梭菌GBW‑N1制备而成的种子液。所述增绿菌剂使用方法简单，只需将增绿菌剂稀释后以2～4kg/亩的用量与有机肥混合后，施入绿叶菜根部的15‑25cm处即可，其具有显著提高绿叶菜的根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量的能力，能够提高绿叶菜的光合作用，促进绿叶菜的生长和质量，也有利于绿叶菜的种植。

Description

一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物种植领域，具体涉及一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
绿叶菜是一类主要以鲜嫩的绿叶、叶柄等为产品的速生蔬菜，在我国有10多个科30多个种。叶片叶绿素是蔬菜进行光合作用积累有机物必不可少的物质，其含量对植物营养的吸收具有重要的指示作用。叶绿素含量越高，光合能力也会越强，植株叶色浓绿生长健壮，对一些植物病害的抵抗能力也会随之增强。氮素含量影响着叶绿素含量、光合速率等光合作用的环节，缺氮会使叶片颜色变淡，从而影响叶片的光合作用效率。多年来研究均表明，植物叶绿素含量与氮素水平有较好的正相关性，它通常是氮素胁迫的指示器，通过观察叶片的颜色变化可以监测植物氮素营养状况。
在提高绿叶菜氮素含量的方法中，有机肥与化肥同样常见。但有机肥质量参差不齐，其效果是否能较好地发挥，取决于其制作流程与养分调配。通过大量的微生物技术研发发现，在施用有机肥时加入微生物，可有效促进小分子物质如氨基酸、小分子糖等的释放，还可显著提高土壤速效氮水平，进而使植物获得更多氮素，也将显著增强植物的光合作用，提高植物光合有机物的积累，进而促进植物的生长发育。目前，在与有机肥配合施用的以提高绿叶菜叶绿素的微生物中，多数微生物存在不能产酶、不能耐受土壤18～20℃的低温、无法在土中萌发增殖、不能耐受土壤的微厌氧环境、无抑菌抗病效果或无释氮解磷解钾效果等问题，进而导致增绿效果不理想。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂及其制备方法和应用，该增绿菌剂能够很好的提高绿叶菜中的叶绿素含量、叶片氮含量和根际土壤速效氮。
为了实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂，所述增绿菌剂经混合菌体种子扩培制成，所述混合菌体种子液包括丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液和丁酸梭菌种子液。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液和丁酸梭菌种子液的体积比为4～5:4～5:6～7。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌种子液采用保藏编号为CGMCC No.20918的丝状芽孢杆菌GBW-F006培养得到，其菌含量为8～10×108CFU/ml。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌种子液采用保藏编号为CGMCC No.20919的植物内芽孢杆菌GBW-F008培养得到，其菌含量为6～8×108CFU/ml。
进一步的，所述丁酸梭菌种子液采用保藏编号为CGMCC No.14499的丁酸梭菌GBW-N1培养得到，其菌含量为3～6×108CFU/ml。
本发明还提供了所述的提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂的制备方法，所述制备方法具体步骤如下：
(1)将丝状芽孢杆菌、植物内芽孢杆菌和丁酸梭菌分别在种子培养液中进行活化培养，制备成丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液、丁酸梭菌种子液；
(2)将步骤(1)中的丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液、丁酸梭菌种子液按照4～5:4～5:6～7的体积比混合均匀，得到混合菌体种子液；
(3)将步骤(2)中的混合菌体种子液按照5～8％的接种量接种到扩培培养液中进行一级扩培，得到一级扩培液；
(4)将步骤(3)中的一级扩培液按照10～15％的接种量接种到扩培培养液中进行二级扩培，得到所述增绿菌剂。
进一步的，所述扩培培养液的配方为：磷虾粉8～10g，糖蜜5～6g，氯化铵2～3g，柠檬酸钠1～1.5g，氯化锰0.5～0.8g，硫酸镁0.2～0.3g，磷酸氢二钠0.15～0.25g，磷酸二氢钾0.25～0.35g，蒸馏水1000ml，pH 7.6～7.8。
进一步的，所述扩培的培养条件包括：扩培转速155～165rpm/min；扩培时间46-48h，扩培温度36℃～38℃。
进一步的，所述增绿菌剂的总生物量为300～330×108CFU/ml。
本发明还提供了所述的增绿菌剂在用于制备提高绿叶菜叶绿素含量的复合制剂中的应用。
进一步的，所述增绿菌剂的使用方法为：将所述增绿菌剂稀释后以2～4kg/亩的用量与有机肥混合后，施入绿叶菜根部的15-25cm处。
进一步的，所述增绿菌剂稀释后的稀释菌量为3～5.5×108CFU/ml。
最优的，所述增绿菌剂的应用剂量为2～3kg/亩。
最优的，所述增绿菌剂稀释后的稀释菌量为3～4.4×108CFU/ml。
进一步的，所述增绿菌剂能够显著提高绿叶菜的根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量。
进一步的，所述绿叶菜包括菠菜和芫荽。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
1、本发明所述的提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂由丝状芽孢杆菌GBW-F006、植物内芽孢杆菌GBW-F008和丁酸梭菌GBW-N1经活化培养制成种子液，再复合扩培而成，其具有多菌复合效应；上述的微生物均可在土壤中很好的萌发增殖，并产生蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、磷酸酶等多种酶类，促进氨基酸、小分子碳水化合物等物质的释放，有利于有机肥肥效的发挥；所述增绿菌剂能够显著增加绿叶菜的根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量，进而促进绿叶菜的光合作用，影响有机物的合成与累积，提高绿叶菜的产量和品质，提高种植经济效益。
2、本发明中的丝状芽孢杆菌GBW-F006分离自甜瓜根际土，可耐受15℃-45℃，在土中前3d内可持续萌发并增殖，具有较强的病原细菌、真菌拮抗能力，可抑制好氧、厌氧细菌与木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、麦根腐平脐蠕孢等多种病原真菌，针对植物萎蔫病病原菌木贼镰刀菌的抑制率高达92.9％；植物内芽孢杆菌GBW-F008可耐受20℃-42℃，且可产多种酶类，木聚糖酶水解比值达3.97，并具有较强的解有机磷、无机磷和钾的能力，解有机磷比值高达2.31，其还具有较强的促生长能力，可促进土中速效磷、速效钾释放，提高土壤游离氨基酸与吲哚乙酸含量；丁酸梭菌GBW-N1为典型厌氧菌，可在厌氧环境中萌发增殖，并发挥产酶、产酸、抑菌等益生功能。
3、本发明所述的增绿菌剂制备方法简单、合理，使用方便，其使用效果优异，具有良好的应用前景。
附图说明
图1：丝状芽孢杆菌GBW-F006在NA培养基上的菌落、菌体与芽孢图。
图2：植物内芽孢杆菌GBW-F008在NA培养基上的菌落、菌体与芽孢图。
图3：丁酸梭菌GBW-N1在TSC培养基上的菌落、菌体与芽孢图。
图4：增绿菌剂不同稀释菌量对菠菜根际土壤速效氮的影响。
图5：增绿菌剂不同稀释菌量对菠菜叶片氮含量的影响。
图6：增绿菌剂不同稀释菌量对菠菜叶片叶绿素含量的影响。
图7：增绿菌剂不同应用剂量对芫荽根际土壤速效氮的影响。
图8：增绿菌剂不同应用剂量对芫荽叶片氮含量的影响。
图9：增绿菌剂不同应用剂量对芫荽叶片叶绿素含量的影响。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1
一、丝状芽孢杆菌GBW-F006的分离筛选与鉴定
1、丝状芽孢杆菌GBW-F006的分离与筛选
从河北沧州、邯郸、河南濮阳、安阳、山东青岛、海阳、青州、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根际土，于医学检验样品袋内4℃冷藏保存，并及时分离，其中涉及辣椒、西葫芦、花菜、甜瓜、番茄、黄瓜等56种作物。取土壤样品2g，放入18mL无菌水中，于30℃、200rpm/min震荡提取30min，样液于75℃水浴20min，然后进行梯度稀释，取各个梯度稀释液100μl在NA平板上进行涂布，将涂布好的平板37℃倒置培养48h，用灭菌竹签挑去不同形态的单菌落，转接于NA斜面上，37℃培养48h后镜检确定产芽孢，并将菌株于4℃保藏备用。
将低温驯化后获得的67株菌分别接种至改良营养肉汤(NB)培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(NH4)2SO4 2g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.05g，pH 7.2-7.4，蒸馏水1L)中，于15℃、200rpm/min震荡培养24h，在OD600nm测定培养液吸光值。67株菌中，有60株在15℃下培养24h，OD600nm的吸光值<1.0，仅有7株菌在15℃下培养24h，OD 600nm的吸光值>1.0，其中，菌株GBW-F006的15℃培养液OD值最高，说明该菌具有很好的耐低温特性，该菌株分离自寿光上口镇李家南邵村李先洲家11年甜瓜根际土。
所述菌株GBW-F006在NA培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图1所示。GBW-F006在NA培养基上的菌落如图1a，为乳白色，圆形，直径2-6mm，表面光滑无皱褶，不透明，边缘整齐，无晕环；GBW-F006在24h的10×100倍油镜镜检结果如图1b，菌体呈G+，为圆柱状，芽孢端生呈椭圆形，直径1-2μm。
2、丝状芽孢杆菌GBW-F006的16S rRNA序列测定
以所述菌株GBW-F006的DNA为模板，使用16S rDNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-F006的16S rDNA测序结果与NCBI GenBank中的序列进行Blast比对分析，结果显示菌株GBW-F006与Bacillus filamentosus同源相似性为99.72％，因此确定该菌株为丝状芽孢杆菌。
3、丝状芽孢杆菌GBW-F006的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-F006进行菌种保藏，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；丝状芽孢杆菌Bacillus filamentosus的保藏编号为：CGMCC No.20918。
4、丝状芽孢杆菌GBW-F006的菌株特性
丝状芽孢杆菌GBW-F006在15℃～45℃温度范围内能生长繁殖，但其最适合生长温度在25℃～37℃，该菌最高可耐受9％NaCl，该菌接触酶与氧化酶反应均为阳性，可水解脲酶，分解酪素，可利用柠檬酸盐。GBW-F006还可利用木糖、蔗糖、菊粉、葡萄糖、山梨醇、水杨苷、D-海藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、L-脯氨酸芳胺酶等。丝状芽孢杆菌GBW-F006分离自甜瓜根际土，在土中前3d内可持续萌发并略微增殖，经实验验证，其还可抑制好氧霍乱弧菌、厌氧产气荚膜梭菌与木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉和麦根腐平脐蠕孢等多种病原真菌，其中对木贼镰刀菌的抑制率高达92.9％。
二、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分离筛选与鉴定
1、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分离与筛选
从河北廊坊、山东济南、泰安、莱阳、淄博、聊城、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根部，装于医学检验样品袋内，4℃冷藏保存并及时分离，涉及包含丝瓜、甜瓜、尖椒、五彩椒、番茄、黄瓜等56种作物根部样本。取样品2g，放入18mL无菌水中，于30℃、200rpm/min震荡提取30min，样液于75℃水浴20min，然后进行梯度稀释，取各个梯度稀释液100μl在NA平板上进行涂布，将涂布好的平板37℃倒置培养48h，用灭菌竹签挑去不同形态的单菌落，转接于NA斜面上，37℃培养48h后镜检确定产芽孢，筛选到72株芽孢菌，并将菌株于4℃保藏备用。
灭菌的48孔培养板内每孔装有1ml含有色氨酸Try诱导剂的改良LB培养基，灭菌后冷却，然后将所筛选到的72株芽孢菌分别接种于48孔板内，37℃200rpm/min震荡培养24h，经8000rpm离心5min，取无菌上清液200μl转移至96孔板内，按照Salkowski比色法原理，芽孢菌发酵液在色氨酸诱导下会产生吲哚乙酸IAA，IAA与Salkowski显色剂发生反应，产生红色，颜色越深说明IAA含量越高。筛选了72株芽孢菌，产IAA能力定性比较后显示菌株GBW-F008的红色反应最深，说明菌株GBW-F008产IAA能力在72株菌中最强，该菌株来源于泰安市高新区房村镇朱家庄村11年番茄棚，分离自番茄根部。
所述菌株GBW-F008在NA培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图2所示，GBW-F008在NA培养基上的菌落如图2a，为白色，不透明，圆形，边缘整齐，表面湿润光泽，直径1-5mm；GBW-F008在24h的10×100倍油镜镜检结果如图2b，镜检菌体呈G+，菌体为圆柱状，直径2-3μm，芽孢近端生呈长椭圆形，周生鞭毛。
2、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分子鉴定
以所述菌株GBW-F008的DNA为模板，使用16S rDNA通用引物进行扩增后并测定其序列，将得到的菌株GBW-F008的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行Blast比对分析，结果显示菌株GBW-F008与Bacillus endophyticus的同源性最高，因此确定菌株GBW-F008为植物内芽孢杆菌。
3、植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-F008进行菌种保藏，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；植物内芽孢杆菌Bacillus endophyticus的保藏编号为：CGMCC No.20919。
4、植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌株特性
植物内芽孢杆菌GBW-F008在20℃～42℃温度范围内能够生长繁殖，但其最适合生长温度在37℃，在pH 4.5～9.6的改良NB培养基内均能正常生长，最适生长pH范围为6.5～7.5，该菌最高可耐受10％NaCl，可产生脲酶，接触酶与氧化酶反应均为阳性，可利用柠檬酸盐；GBW-F008还可利用木糖、菊粉、葡萄糖、D-核糖、环糊精、古老糖、D-海藻糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、亮氨酸芳胺酶等。所述植物内芽孢杆菌GBW-F008可产淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶类，木聚糖酶水解比值达3.97，且具有良好的解磷解钾等能力，解有机磷比值高达2.31。
三、丁酸梭菌GBW-N1的筛选、分离与鉴定
1、丁酸梭菌GBW-N1的分离筛选与纯化
将采集样品培养的菌悬液，梯度稀释后涂布于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(TSC)培养基上，多次分离纯化后得到单菌落，命名为GBW-N1，保存。
所述菌株GBW-N1的在TSC固体培养基上培养24h的菌落图3所示，其菌落图如3a，圆形，黑色，表面光滑，中间略凸起，边缘不整齐；所述菌株GBW-N1在TSC液体培养基上培养48h的菌体图3b所示，菌体呈杆状，1.1-1.2μm×2.1-3.6μm，单个排列，革兰氏阳性，芽胞呈梭状，中生，胞囊膨大。
2、丁酸梭菌GBW-N1的分子鉴定
以所述的菌株GBW-N1的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-N1的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-N11与Clostridium butyricum同源性最高，因此确定该菌株GBW-N1为丁酸梭菌。
3、丁酸梭菌GBW-N1的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-N1进行菌种保藏，所述丁酸梭菌GBW-N1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年08月07日；丁酸梭菌Clostridiumbutyricum的保藏编号为CGMCC No.14499。
4、丁酸梭菌GBW-N1的菌株特性
丁酸梭菌GBW-N1在pH值6～8的范围内均能生长，而最适的生长pH值为7.1-7.5；在溶氧含量1～5mg/L范围内都能正常生长，而最适的生长溶解氧浓度在2-4mg/L；能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，能够降解或分解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐和半固体琼脂；在30～45℃温度范围内均能正常生长繁殖，而最适的生长温度在35～38℃。丁酸梭菌GBW-N1为厌氧菌，可在厌氧环境中萌发增殖，并发挥产酶、产酸、抑菌等益生功能。
实施例2
本发明所述的提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂的制备方法如下：
1、将丝状芽孢杆菌GBW-F006、植物内芽孢杆菌GBW-F008和丁酸梭菌GBW-N1分别在对应的种子培养液中进行活化培养，制备成种子液；其中，
丝状芽孢杆菌GBW-F006种子培养液配方为：玉米浆干粉1～1.5g，棉籽蛋白粉2～2.5g，蛋白胨0.8～1g，酵母膏0.5～0.8g，KH2PO4 0.1～0.3g，MgSO4·7H2O 0.05～0.08g，MnSO4·H2O 0.03～0.05g中性蛋白酶5万U/g 0.1～0.2g，pH 7.3～7.5，蒸馏水1L，培养时间12-14h，培养温度35℃～38℃；
植物内芽孢杆菌GBW-F008种子培养液配方为：玉米淀粉8～10g，豆饼粉2～3g，K2HPO4 2～3g，MgSO4·7H2O 0.5～0.8g，MnSO4·H2O 0.5～0.8g，CaCO3 0.1～0.3g，FeCl3·6H2O 5～6mg，pH 7.0～7.5，蒸馏水1L，培养时间13-15h，培养温度34℃～39℃；
丁酸梭菌GBW-N1种子培养液配方为：豆粕粉2～2.5g，磷酸氢二钠0.5～0.8g，磷酸氢二钾，0.25～0.35g，硫酸锰0.05～0.08g，pH 7.6～7.8，蒸馏水1L，培养时间14-18h，培养温度36℃～38℃。
2、将活化培养好的菌含量为8～10×108CFU/ml的丝状芽孢杆菌GBW-F006种子液、6～8×108CFU/ml的植物内芽孢杆菌GBW-F008种子液、3～6×108CFU/ml的丁酸梭菌GBW-N1种子液按照4～5:4～5:6～7的体积比混合均匀，得到混合菌体种子液。
3、将混合菌体种子液按照5～8％的接种剂量接种到扩培培养液中进行一级扩培，得到一级扩培液。
4、将一级扩培液按照10～15％的接种量接种到扩培培养液中进行二级扩培，最终得到总生物量为300～330×108CFU/ml的增绿菌剂。
其中，上述的扩培培养液的配方为：磷虾粉8～10g，糖蜜5～6g，氯化铵2～3g，柠檬酸钠1～1.5g，氯化锰0.5～0.8g，硫酸镁0.2～0.3g，磷酸氢二钠0.15～0.25g，磷酸二氢钾0.25～0.35g，pH 7.6～7.8，蒸馏水1000ml；其扩培条件为：扩培转速155～165rpm/min；扩培时间46-48h，扩培温度36℃～38℃。
实施例3
试验在新泰市楼德镇某菠菜种植基地进行。将供试菠菜均为为6组，具体分组见表1，试验按增绿菌剂稀释菌量逐渐增加顺序设定为A0、A1、A2、A3、A4、A5共6组，每组均以空白灭菌的扩培培养液将实施例2制备得到的增绿菌剂稀释至特定菌量，然后均以2kg/亩的应用剂量，与有机肥底肥一起施入菠菜根部15cm～20cm处，每个试验组规模为3垅，每垅定植60～80棵菠菜。
表1：增绿菌剂不同稀释菌量分组
Figure BDA0002847304550000091
试验为期2个月，重点考察增绿菌剂不同稀释菌量对菠菜根际土壤速效氮、菠菜叶片氮含量和菠菜叶绿素含量的影响。分别采集0d、15d、30d、45d、60d不同时间的菠菜根际土样品，测定土壤速效氮含量指标；土壤速效氮含量采用NaOH碱解-扩散法测定。分别采集0d、15d、30d、45d、60d不同时间的菠菜叶片，于105℃下杀青30min，然后80℃烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎，过0.3mm筛后用塑封袋保存测定时称样0.2g，按凯氏定氮法消煮，用ATN-100凯氏定氮仪测定叶片氮含量。采用乙醇-丙酮混合浸提法测定植物叶片的叶绿素含量。每组取4个重复样品测定，结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析。
图4-6显示了本发明的增绿菌剂在不同稀释菌量下对菠菜根际土壤速效氮、菠菜叶片氮含量和菠菜叶绿素含量的影响；结果显示，与对照组相比，虽然A1与A2组均可在一定程度上提高菠菜根际土壤速效氮、菠菜叶片氮含量和菠菜叶绿素含量，但指标增长幅度较小，显著低于A3～A5组对这些指标的提升(P<0.05)。当增绿菌剂的稀释菌量介于3～5.5×108CFU/ml时，与对照A0相比，可极其显著提高菠菜根际土壤速效氮、菠菜叶片氮含量和菠菜叶绿素含量(P<0.01)，在试验结束时，指标相对于对照组涨幅分别为54.5％-57.6％、1.37-1.46倍、1.47-1.62倍，但A3～A5三组间差异不显著，且稀释菌量组A3与A4的应用性价比更高。综合应用效果与经济成本，本发明所述提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂的最合适稀释菌量为3～4.4×108CFU/ml。
实施例4
试验在青岛市店埠镇某芫荽种植基地进行。将供试芫荽均为为5组，具体分组见表2，试验按本发明的增绿菌剂应用剂量逐渐增加顺序设定为B0、B1、B2、B3、B4共5组，每组均以空白灭菌的扩培培养液将实施例2制备得到的增绿菌剂稀释至菌量为3～4.4×108CFU/ml，然后按照表2所述设定每组对应的不同应用剂量，与有机肥底肥一起施入芫荽根部20cm～25cm处，每个试验组规模为3垅，每垅定植100～120株芫荽。
表2：增绿菌剂不同应用剂量分组
Figure BDA0002847304550000101
试验为期100d，重点考察本发明所述增绿菌剂稀释后不同应用剂量对芫荽根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量的影响。分别采集0d、20d、40d、60d、80d与100d不同时间的芫荽根际土样品，测定土壤速效氮含量指标，土壤速效氮含量采用NaOH碱解-扩散法测定。分别采集0d、20d、40d、60d、80d与100d不同时间的芫荽叶片，于105℃下杀青30min，然后80℃烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎，过0.3mm筛后用塑封袋保存测定时称样0.2g，按凯氏定氮法消煮，用ATN-100凯氏定氮仪测定叶片氮含量。采用乙醇-丙酮混合浸提法测定植物叶片的叶绿素含量。每组取4个重复样品测定，结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析。
图7-9显示了本发明所述提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂在不同应用剂量下对芫荽根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量的影响，结果显示，与对照组B0相比，虽然B1组可在一定程度上提高芫荽根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量，但指标增长幅度较小，显著低于B2～B4组对这些指标的提升(P<0.05)。试验结果显示，当增绿菌剂的应用剂量介于2～4kg/亩时，与对照B0相比，可极其显著提高芫荽根际土壤速效氮、叶片氮含量和叶绿素含量(P<0.01)，在试验结束时，指标相对于对照涨幅分别为24.8％-27.1％、2.89-3.05倍、1.56-1.63倍，但这三组间差异不显著，且应用剂量B2与B3，即应用剂量为2～3kg/亩时的应用性价比最高。综合应用效果与经济成本，本发明所述提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂的最合适应用剂量为2～3kg/亩。
试验总结：本发明所述提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂由丝状芽孢杆菌GBW-F006、植物内芽孢杆菌GBW-F008和丁酸梭菌GBW-N1复合而成，这些芽孢菌均可在土壤中萌发增殖，并产生蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、磷酸酶等多种酶类，促进氨基酸、小分子碳水化合物等物质的释放，有利于有机肥肥效的发挥。这些生命本初的小分子物质在土壤中表现为速效氮、速效磷、速效钾等指标的显著提升，在植物体内表现为叶片氮含量和叶绿素含量的增加，这些都将最终影响光合作用，进而影响有机物的合成与累积，最终提高种植经济效益。经过系列实施例试验验证，所述提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂的稀释菌量为3～5.5×108CFU/ml，应用剂量为2～4kg/亩；且综合经济成本考量，最适合的稀释菌量为3～4.4×108CFU/ml，最适合的应用剂量为2～3kg/亩，在此条件下，不仅可以保证应用效果，且性价比更高。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂，其特征在于：所述增绿菌剂经混合菌体种子液扩培制成，所述混合菌体种子液包括菌含量为8~10×108 CFU/ml、保藏编号为CGMCCNo.20918的丝状芽孢杆菌（Bacillus filamentosus）GBW-F006的种子液；菌含量为6~8×108 CFU/ml、保藏编号为CGMCC No.20919的植物内芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）GBW-F008的种子液；菌含量为3~6×108 CFU/ml、保藏编号为CGMCC No.14499的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GBW-N1的种子液；
所述丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液和丁酸梭菌种子液的体积比为4~5:4~5:6~7。
2.根据权利要求1所述的提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂，其特征在于，所述扩培的培养条件包括：扩培转速155~165 rpm/min；扩培时间46-48h，扩培温度36℃~38℃。
3.权利要求1所述的提高绿叶菜叶绿素含量的增绿菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体步骤如下：
（1）将丝状芽孢杆菌、植物内芽孢杆菌和丁酸梭菌分别在种子培养液中进行活化培养，制备成丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液、丁酸梭菌种子液；
（2）将步骤（1）中的丝状芽孢杆菌种子液、植物内芽孢杆菌种子液、丁酸梭菌种子液按照4~5:4~5:6~7的体积比混合均匀，得到混合菌体种子液；
（3）将步骤（2）中的混合菌体种子液按照5~8%的接种量接种到扩培培养液中进行一级扩培，得到一级扩培液；
（4）将步骤（3）中的一级扩培液按照10~15%的接种量接种到扩培培养液中进行二级扩培，得到所述增绿菌剂。
4.权利要求1所述的增绿菌剂在用于制备提高绿叶菜叶绿素含量的复合制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增绿菌剂的使用方法为：将所述增绿菌剂稀释后以2~4 kg/亩的用量与有机肥混合后，施入绿叶菜根部的15-25cm处。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述增绿菌剂稀释后的稀释菌量为3~5.5×108 CFU/ml。
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