CN112603916A - 月桂酸在制备沙门氏菌ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及月桂酸在制备沙门氏菌III型分泌系统抑制剂中的应用，以沙门氏菌III型分泌系统为药物靶标，从抗毒力角度出发筛选天然化合物在抗沙门氏菌感染中的作用，通过构建III型分泌系统报告体系，筛选到月桂酸能够显著抑制沙门氏菌III型分泌系统功能，在不影响细菌生长的条件下可抑制沙门氏菌入侵HeLa细胞，同时具有较小的细胞毒性，为临床上以III型分泌系统为靶标的抗沙门氏菌感染提供新的研发策略和先导化合物。相比传统抗生素在直接杀死沙门氏菌的作用机制，月桂酸以III型分泌系统为靶标的治疗策略可以解除病原细菌的武装，降低细菌致病力，有效防治细菌感染，同时给予细菌的选择压力小，从而降低了产生耐药性的风险。

Description

月桂酸在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及月桂酸在制备沙门氏菌III型分泌系统抑制剂中的应用，属于医学制药技术领域。

背景技术

沙门氏菌主要侵害幼年、青年动物，并使其发生败血症、胃肠炎及组织局部炎症。对于成年动物则呈现散发型或局限性沙门氏菌病，也可导致怀孕母畜的流产，其主要的传染途径是消化道。鼠伤寒沙门氏菌为宿主泛嗜性菌，该菌是当前世界各国分离率最高的菌型之一，它可以使各种畜禽、犬、猫及实验动物发生副伤寒，表现为胃肠炎或败血症，也可以引起人类食物中毒，无论在医学、动物医学还是在公共卫生都具有重要的意义。目前，对抗沙门氏菌感染普遍采用抗生素进行治疗，由此导致的耐药菌株对公共卫生安全造成了很大的威胁。细菌受到的强烈生存压力是耐药菌株产生的主要原因，故寻求既可以降低致病性又对病原体生长不影响的新型抗菌药物迫在眉睫。

III型分泌系统(T3SS)是存在于革兰氏阴性致病菌中高度保守的毒力因子，是一种注射器状的毒性蛋白运输系统，分泌效应蛋白至宿主细胞内，协助细菌完成侵袭。T3SS抑制剂可以有效降低革兰氏阴性病原体的致病力，同时对细菌的生长没有抑制作用。T3SS抑制剂的这一特性使其成为新型抗生素开发的理想选择，不仅可发挥抗感染作用，而且对细菌选择性压力小，不易诱导产生耐药性。

脂肪酸是构成磷脂，甘油三酸酯和胆固醇酯的最重要元素，代表饮食中重要的能量摄入。许多产生棕榈油，椰子油和橄榄油的植物都富含脂肪酸。月桂酸是具有12个碳原子的饱和中链脂肪酸，它在某些水果，母乳和椰子油中含量丰富。椰子油是月桂酸的主要来源，约占总脂肪酸的50％；它具有抗菌，抗炎，抗糖尿病活性，并且它也是用于治疗皮肤疾病的常用药物。目前，国内外未见月桂酸通过抑制沙门氏菌III型分泌系统的功能来抵抗沙门氏菌感染的报道。

发明内容

本发明所述月桂酸CAS登录号为69-72-7，分子式为C₇H₆O₃，分子量为 138.12。

月桂酸的化学结构式如下：

本研究以沙门氏菌III型分泌系统为药物靶标，从抗毒力角度出发筛选天然化合物在抗沙门氏菌感染中的作用，通过构建III型分泌系统报告体系，筛选到月桂酸能够显著抑制沙门氏菌III型分泌系统功能，在不影响细菌生长的条件下可抑制沙门氏菌入侵HeLa细胞，同时具有较小的细胞毒性。综上，本研究提出了一种有效的沙门氏菌III型分泌系统抑制剂月桂酸，为临床上有效防治沙门氏菌及其他革兰氏阴性菌感染提供新的研发策略和先导化合物。

附图说明

图1：月桂酸抑制效应蛋白SipA的易位进而抑制T3SS的功能(蓝色表示效应蛋白SipA的转运功能正常；绿色表示效应蛋白SipA不能正常转运)

图2：月桂酸不影响鼠伤寒沙门氏菌的生长(横轴表示时间，纵轴表示测定值)

图3：月桂酸对HeLa细胞无细胞毒性(横轴表示不同浓度月桂酸处理组，纵轴表示细胞存活率)

图4：月桂酸对沙门氏菌介导HeLa细胞损伤的保护作用(横轴表示不同浓度月桂酸处理组，纵轴为LDH释放量)

具体实施方式

通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

月桂酸在制备沙门氏菌III型分泌系统抑制剂中的应用，用于药学上可接受的任何载体。

实施例2

月桂酸作为沙门氏菌III型分泌系统抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。

实施例3

月桂酸作为沙门氏菌III型分泌系统抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病，特别是由沙门氏菌引起的人畜感染，包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和鸡白痢等疾病。

1.沙门氏菌III型分泌系统抑制剂的筛选

本研究首先通过分子克隆的方法构建SipA-TEM报告质粒，并将其转入沙门氏菌内。将天然化合物和含有报告质粒的沙门氏菌共同孵育培养3h后，以 MOI＝50感染细胞2h，加入CCF2-AM底物。在该报告体系中，效应蛋白和β- 内酰胺酶融合体通过III型分泌系统(T3SS)转运至宿主体内，水解荧光底物而导致其颜色产生变化，通过颜色差异筛选有效的天然化合物。

结论：β-内酰胺酶-SipA感染的Hela细胞呈现蓝色，说明T3SS效应蛋白 SipA能够正常转运至细胞内，而当敲除T3SS系统效应蛋白转运的关键基因 invA后使其失去正常的功能，感染的HeLa细胞呈现绿色，月桂酸与β-内酰胺酶-SipA共孵育后，感染的HeLa细胞呈现部分蓝色，说明月桂酸抑制沙门氏菌 T3SS效应蛋白SipA的易位而影响沙门氏菌T3SS的功能(见附图1)。

2.月桂酸对沙门氏菌生长的影响

沙门氏菌接种至LB液体培养基(0.3M NaCl)中过夜培养(37℃，200 rpm)，次日1∶100扩培至OD₆₀₀nm为0.3左右，量取20ml菌液分装于5个锥形瓶中，分别加入月桂酸贮存液使得其终浓度为4、8、16、32μg/ml，另余下一瓶加入等量DMSO。37℃，200rpm继续培养，每隔0.5h测定并记录每组样品的OD_600nm，直至细菌生长至平台期。

结论：在7h的培养时间内，月桂酸处理组(4～32μg/ml)与未加药物处理组相比，细菌生长至平台期OD_600nm值无可观测到的明显影响，表明月桂酸在有效浓度范围内不影响细菌正常生长(见附表1和附图2)。

附表1月桂酸对沙门氏菌(SL1344)生长的影响测定

3月桂酸对沙门氏菌入侵宿主细胞的影响

3.1月桂酸对宿主细胞无细胞毒性

将HeLa细胞系维持在含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ ml链霉素的DMEM高糖培养基中，将消化下的细胞用不含抗生素的DMEM 培养基调整其浓度为2×10⁴个/孔，置于37℃的含5％二氧化碳培养箱培养过夜。次日设置阳性对照组(0.1％TritonX-100)、阴性对照组(孔内仅加入DMEM 培养基)、药物组(分别加入月桂酸贮存液，使得每孔内月桂酸的终浓度分别为4，8，16，32μg/ml)，每组设定三个重复，于37℃温箱培养8h后取细胞培养上清，按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒使用说明测定492nm处吸光度，计算各组LDH释放率。

公式如下：LDH释放率(％)＝(待测组-DMEM对照组)/(0.1％ TritonX组-DMEM对照组)

结论：与未加月桂酸处理组相比，在0～32μg/ml浓度范围内月桂酸对HeLa 细胞几乎无毒性(见附表2和附图3)。

附表2月桂酸对HeLa细胞毒性测定(LDH释放率，％)

3.2月桂酸对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤的保护作用

将HeLa细胞悬浮在补充有10％胎牛血清的DMEM中，于96孔板中以2 ×10⁴个/孔密度培养过夜。野生型菌株SL1344和ΔinvA-SL1344在含0.3M NaCl LB肉汤中培养过夜，以不同浓度月桂酸预处理4h后，用MOI＝100感染细胞，每组三个重复，感染5h后，1000rpm离心10min取细胞培养上清于新的96孔板，按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒使用说明测定492nm处吸光度，计算各组LDH释放率。

结论：LDH在培养上清液中的释放量是细胞死亡的指标，与用SL1344感染但未用月桂酸治疗的对照组相比，16μg/ml月桂酸处理组的LDH释放量显著降低，表明月桂酸可有效缓解沙门氏菌介导的HeLa细胞的损伤(见附表3 和附图4)。

附表3月桂酸对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤的保护作用(LDH释放率，％)

Claims (5)

1.月桂酸在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的月桂酸用于抑制沙门氏菌III型分泌系统生物学功能。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的月桂酸抑制沙门氏菌III型分泌系统功能，降低沙门氏菌致病力。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的月桂酸制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的沙门氏菌感染是指由沙门氏菌引起的人畜感染，包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和鸡白痢等疾病。

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