CN112601535A - 用于癌症的重组治疗干预 - Google Patents

Abstract

描述了用于治疗或预防受试者中的癌症的组合物和方法，所述治疗或预防通过将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至受试者的膀胱中来进行，所述分枝杆菌菌株含有本发明的表达载体。药物组合物可以通过任何合适的手段包括通过导管施用。

Description

用于癌症的重组治疗干预

政府利益声明

本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号AI036973、AI037856在美国政府支持下进行。美国政府在本发明中具有某些权利。

发明背景

在北美、南美、欧洲和亚洲，膀胱的尿路上皮癌是最常见类型的膀胱癌(BC)。非肌层浸润性膀胱癌(Non-Muscle Invasive Bladder Cancer，NMIBC)与高复发率、频繁的膀胱内治疗、进展到晚期的风险以及所有癌症中最高的终生治疗相关。30年来，膀胱内BCG(卡介苗(bacillus Calmette Guerin))滴注一直是用于NMIBC的护理治疗标准。膀胱内BCG滴注在60％-70％的患者中有效。已表明BCG是一种非常有效的用于递送抗原的媒介物。证实了潜在免疫应答倾向于I型干扰素和Th1诱导介导的免疫应答的许多研究显示出前景。产生用于NMIBC的重组BCG(rBCG)菌株的努力集中在开发增强这些抗肿瘤免疫应答的菌株上。迄今为止，这样的努力没有产生超过传统的BCG的明显改善。

发明概述

本发明的一种实施方案是一种载体，该载体包含表达蛋白质或其功能部分的核酸序列，所述蛋白质或其功能部分产生STING激动剂，作为实例，所述STING激动剂包括c-di-AMP(也被称为3’-5’c-di-AMP)；c-di-GMP(也被称为3’-5’c-di-GMP)；3’-3’cGAMP(也被称为3′-5′,3′-5′cGAMP，是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)DncV蛋白的产物)；2’-3’cGAMP(也被称为2’-5’,3’-5’cGAMP，是人类cGAS蛋白的产物)及其组合。本发明的一些载体包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码Rv1354c蛋白或其功能部分的第一核酸序列；编码3’-3’环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的第二核酸序列；编码2’-3’环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的第三核酸序列；编码DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分的第四核酸序列，及它们的组合。这些核酸序列中的每一个都表达产生如本说明书的定义部分中描述的一种或更多种STING激动剂的蛋白质。本发明的一些载体包括除了上文列出的一个或更多个序列之外的编码PanC蛋白和PanD蛋白或其功能部分的第五核酸序列。包含编码PanC蛋白和PanD蛋白或其功能部分的核酸序列的载体通常不含抗生素抗性基因。本发明中使用的合适的载体可以包括以多于一个拷贝附加型复制(replicate episomally)的载体，或以单拷贝整合到细菌染色体中或以其他方式存在于细菌细胞中的载体。本发明的载体可以稳定整合到细菌基因组中，或者本发明的载体可以作为附加体质粒(episomalplasmid)稳定复制。合适的第三核酸序列包括过表达环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白的环化酶结构域的那些序列。其他合适的第三核酸序列可以表达非功能性的、具有识别调控DNA的能力的环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白。本发明的载体还可以包含编码将本发明中使用的分枝杆菌(Mycobacteria)菌株的PDE基因的表达敲除的序列或蛋白质的核酸序列。

本发明的另一种实施方案是分枝杆菌菌株，该分枝杆菌菌株包含本发明的载体中的任一种，所述载体包括含有表达蛋白质或其功能部分的核酸序列的载体，所述蛋白质或其功能部分产生STING激动剂。如上文提及的，作为实例，STING激动剂的实例包括c-di-AMP(也被称为3’-5’c-di-AMP)；c-di-GMP(也被称为3’-5’c-di-GMP)；3’-3’cGAMP(也被称为3′-5′,3′-5′cGAMP，是霍乱弧菌DncV蛋白的产物)；2’-3’cGAMP(也被称为2’-5’,3’-5’cGAMP，是人类cGAS蛋白的产物)及其组合。合适的核酸序列的实例包括选自由以下组成的组的核酸序列：编码Rv1354c蛋白或其功能部分的第一核酸序列；编码3’-3’环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的第二核酸序列；编码2’-3’环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的第三核酸序列；编码DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分的第四核酸序列，及它们的组合。本发明中使用的合适的分枝杆菌菌株的实例包括例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)或其组合。本发明中使用的另一种菌株是卡介苗分枝杆菌(Mycobacterium bacillus Calmette Guerin)(BCG)。本发明中使用的分枝杆菌菌株可以是缺乏其panCD基因操纵子的BCG的泛酸盐(pantothenate)营养缺陷型。panCD营养缺陷型菌株缺乏能够编码功能性PanC和/或PanD蛋白的基因组序列。在一些实施方案中，为泛酸盐营养缺陷型的分枝杆菌菌株包含本发明的载体，该载体包含编码PanC和PanD蛋白或其功能部分的panCD核酸。本发明的包含panCD核酸序列的载体优选地不含抗生素抗性基因或编码提供抗生素抗性的功能蛋白的核酸序列。为本发明的泛酸盐营养缺陷型的分枝杆菌优选地不含抗生素抗性基因组基因或不能编码提供抗生素抗性的功能蛋白。

本发明的另一种实施方案是药物组合物，该药物组合物包含本发明的分枝杆菌菌株中的任一种和药学上可接受的载体。

本发明的另一种实施方案是在受试者中引发1型干扰素应答、增强促炎性细胞因子的表达和/或引发训练免疫(trained immunity)的方法，该方法包括以下步骤：将包含本发明的菌株中的任一种的药物组合物施用至受试者中；以及在受试者中引发1型干扰素应答，增强促炎性细胞因子的表达和/或引发训练免疫。在一种实施方案中，该药物组合物通过导管被施用至受试者的膀胱中。

另一种实施方案是使用本发明的分枝杆菌菌株治疗或预防受试者中的癌症的方法。该方法包括以下步骤：将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至患有癌症的受试者，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质或其功能部分的载体；以及治疗或预防受试者中的癌症。作为实例，本发明可以用于治疗或预防癌症，包括上皮癌、乳腺癌、非肌层浸润性膀胱癌。在一些实施方案中，癌症是BCG无应答的非肌层浸润性膀胱癌(BCG无应答的NMIBC)，并且药物组合物通过膀胱内滴注施用。在一些实例中，癌症是BCG未治疗的非肌层浸润性膀胱癌(BCG-

non-muscle invasive bladder cancer)(BCG未治疗的NMIBC)，并且药物组合物通过膀胱内滴注施用。在其他实例中，癌症选自由以下组成的组：结肠癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、鼻咽癌、支气管癌及其组合，并且药物组合物被施用至上皮癌的腔表面。在一些实施方案中，癌症选自实体瘤、液体瘤，并且药物组合物通过肿瘤内注射和/或通过全身输注施用。本发明的方法可以包括施用检查点抑制剂的步骤，作为实例，所述检查点抑制剂诸如抗PD1、抗PDL1或其组合。在另一种实施方案中，癌症是膀胱癌，并且导管施用药物组合物。

本发明的一种实施方案是表达载体，该表达载体包含：编码Rv1354c蛋白或其功能部分的第一核酸序列；编码环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的第二核酸序列；编码环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的第三核酸序列；编码作为二腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分的第四核酸序列，或它们的组合。本发明的一些表达载体具有第一核酸序列，该第一核酸序列在与作为参考的天然Rv1354c蛋白的表达相比时过表达Rv1354c蛋白的环化酶结构域。本发明的一些表达载体具有第二核酸序列，该第二核酸序列在与天然DncV蛋白的表达相比时过表达环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白。本发明的一些表达载体具有第三核酸序列，该第三核酸序列在与天然cGAS蛋白的表达相比时过表达环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白的环化酶结构域。本发明中使用的合适的Rv1354蛋白包括结核分枝杆菌Rv1354蛋白。本发明中使用的合适的DncV蛋白包括霍乱弧菌DncV蛋白。本发明中使用的合适的cGAS蛋白包括智人(Homo sapiens)cGAS蛋白。本发明中使用的合适的DisA蛋白包括结核分枝杆菌disA蛋白。

本发明的另一种实施方案包括含有cdnP基因、Rv1354c基因、Rv1357c基因或其组合的BCG菌株，其中cdnP基因不能表达功能性环状二核苷酸磷酸二酯酶(CdnP)蛋白，Rv1354c基因不能表达功能性Rv1345c蛋白，和/或Rv1357c基因不能表达功能性Rv1357蛋白。本发明的一些BCG菌株可以具有包含非功能性EAL结构域的Rv1354c基因。本发明的BCG菌株可以包含本发明的任何表达载体。

本发明的另一种实施方案是治疗或预防膀胱癌的方法，该方法包括以下步骤：将包含BCG菌株的药物组合物施用至受试者的膀胱中，所述BCG菌株包含本发明的表达载体；以及当与不施用药物组合物的参考受试者相比时，治疗或预防受试者中的膀胱癌。药物组合物可以通过任何合适的手段包括通过导管施用。

本发明的另一种实施方案是在受试者中引发1型干扰素应答的方法，该方法包括以下步骤：将包含BCG菌株的药物组合物施用至受试者诸如受试者的膀胱中，所述BCG菌株包含本发明的表达载体；以及与不施用药物组合物的参考受试者相比，增强受试者中的1型干扰素应答。

本发明的另一种实施方案是治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：将包含BCG菌株的药物组合物施用至患有癌症的受试者的肿瘤中，所述BCG菌株包含本发明的表达载体；以及当与不施用药物组合物的参考受试者相比时，治疗或预防受试者中的癌症。药物组合物可以通过任何合适的手段包括注射到肿瘤中施用。可以通过该方法治疗或预防的癌症包括但不限于乳腺癌和/或非肌层浸润性膀胱癌。

本发明中使用的分枝杆菌的实例包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗(被称为BCG)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、鸟分枝杆菌菌群(Mycobacterium avium complex)和其他非结核分枝杆菌(NTM)。本发明中使用的BCG菌株(包括过表达STING激动剂的那些BCG菌株)的实例包括BCG Pasteur、BCG-Pasteur-Aeras、BCG Tice(也被称为BCG Chicago)、BCG-Connaught(也被称为BCG Toronto)、BCG Danish、BCG-Prague(也被称为BCG Czechoslovakian)、BCG Russia(也被称为BCG Moscow)、BCGMoreau(也被称为BCG Brazil)、BCG Japan(也被称为BCGTokyo)、BCG Sweden(也被称为BCGGothenburg)、BCG Birkhaug、BCG Glaxo、BCG Frappier(也被称为BCG Montreal)、BCGPhipps或其他可得的BCG菌株。

本发明的另一种实施方案是治疗糖尿病的方法，该方法包括以下步骤：将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至患有糖尿病的受试者，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质或其功能部分的载体；以及通过提供训练免疫来治疗或预防受试者中的糖尿病。训练免疫是指一种抗原刺激物引发更强的针对在稍后时间引入的第二种不同的抗原刺激物的免疫应答的能力。训练免疫是不依赖抗原的、基于异源CD4和CD8记忆活化的、细胞因子介导的，并且与表观遗传和代谢变化相关。该方法导致由训练免疫介导的糖酵解的上调。上文提及的糖酵解的上调有益于预防和治疗1型和2型糖尿病。

本发明的另一种实施方案是刺激受试者中的训练免疫的方法，该方法包括以下步骤：将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至受试者，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质或其功能部分的载体；以及刺激受试者中的训练免疫。其中该方法使受试者中的糖酵解上调和/或刺激受试者中组蛋白甲基化的附加型变化(episomalchange)，所述组蛋白甲基化的附加型变化介导受试者中的训练免疫。

本发明的另一种实施方案是治疗或预防受试者中的病毒感染的方法，该方法包括以下步骤：将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至受试者，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质或其功能部分的载体；以及治疗或预防受试者中的病毒感染。该方法刺激受试者中的训练免疫，治疗或预防受试者中的病毒感染。其中该方法使受试者中的糖酵解上调和/或刺激受试者中组蛋白甲基化的附加型变化，所述组蛋白甲基化的附加型变化介导受试者中的训练免疫。

本发明的另一种实施方案是治疗或预防受试者中的细菌感染或药物耐受性细菌感染的方法，该方法包括以下步骤：将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至受试者，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质或其功能部分的载体；以及治疗或预防受试者中的细菌感染或药物耐受性细菌感染。该方法刺激受试者中的训练免疫，治疗或预防受试者中的细菌感染。其中该方法使受试者中的糖酵解上调和/或刺激受试者中组蛋白甲基化的附加型变化，所述组蛋白甲基化的附加型变化介导受试者中的训练免疫。本发明的方法可以使用一种或更多种本发明的载体或者一种或更多种包含本发明的载体的细菌菌株。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编著,1988)；The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人.(编著),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文使用的，除非另外指定，否则以下术语具有下文归属于它们的含义。

“剂”意指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。

“改变”意指基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如通过标准的本领域已知方法诸如本文描述的方法检测到的。如本文使用的，改变包括表达水平的10％变化、优选地表达水平的25％变化、更优选地40％变化、以及最优选地50％或更大变化。

“改善”意指降低、抑制、减弱、减少、阻止或稳定疾病的发展或进展。

“类似物”意指不相同，但具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留了相应的天然存在的多肽的生物活性，同时具有某些生物化学修饰，所述生物化学修饰增强该类似物相对于天然存在的多肽的功能。例如，这样的生物化学修饰可以增加类似物的蛋白酶耐受性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。在另一个实例中，类似物可以包括非天然氨基酸。

“cdnP”意指1)编码环状二核苷酸磷酸二酯酶(cdnP)蛋白的cdnP基因或核酸序列，或2)环状二核苷酸磷酸二酯酶蛋白。实例包括H37Rv中具有NCBI基因ID 888920的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)cdnP基因Rv2837c，和UniProtKB/Swiss-Prot P71615.2的cdnP蛋白。

“cGas”意指1)编码环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白的cGas基因或核酸序列，或2)环状GMP-AMP合酶蛋白。cGas的实例包括智人(H.sapiens)cGAS基因(NCBI基因ID：115004)和由该基因编码的蛋白质(UniProtKB/Swiss-Prot:Q8N884.2)。cGas蛋白是一种来自人类的产生2’3’cGMP的环状GMP-AMP合酶。2’3’cGMP是人类中的STING激动剂。

“环化酶结构域”意指，cGAS的环化酶结构域，例如是Kranzusch等人(CellReports 2013；3:1362-1368PMID 23707061)中描述的522个氨基酸的人类cGAS蛋白的一部分。环化酶结构域可以被描述为具有位于氨基酸160-330的核苷酸酶(NTase)核心，和位于氨基酸330-522的调控-传感器结构域，即C-结构域。核苷酸酶核心序列的突变体以及调控-传感器结构域的突变体可以用于产生cGAMP的组成性活性变体，所述变体被设计成产生高水平的cGAMP而不具有对通过DNA结合活化的一般需要。环化酶结构域的另一个实例包括NCBI基因ID：887485的623个氨基酸的结核分枝杆菌Rv1354c，和由该基因编码的蛋白质(UniProtKB/Swiss-Prot:P9WM13)，该基因编码能够进行c-di-GMP(环状二鸟苷酸或环状di-GMP)合成(经由其GGDEF结构域，氨基酸201-400)和降解(经由其EAL结构域，氨基酸401-623)两者的蛋白质。GAF结构域(氨基酸1-200)是调控结构域。GGDEF结构域以及调控-传感器GAF结构域的突变体和被截短以去除EAL结构域(磷酸二酯酶活性)的多肽可以用于产生Rv1354c的组成性活性变体，该变体被设计成产生高水平的c-di-GMP。

“DisA”或“disA”意指1)编码DNA完整性扫描(DisA)蛋白的DisA基因或核酸序列，或2)DNA完整性扫描蛋白。实例包括NCBI基因ID：887485的358个氨基酸的结核分枝杆菌disA基因Rv3586，并且由该基因编码的蛋白质是UniProtKB/Swiss-Prot:P9WNW5.1。该蛋白质是二腺苷酸环化酶，如Dey&Bishai等人Nature Medicine 2015；21:401-6.PMID:25730264描述的。DisA蛋白是一种产生c-di-AMP的二腺苷酸环化酶。c-di-AMP是STING激动剂。

“疾病”意指损伤或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或紊乱。疾病的实例包括但不限于膀胱癌。

“dncV”意指编码环状GMP-AMP合酶的基因，该环状GMP-AMP合酶催化从GTP和ATP合成细胞信号转导中的第二信使3'3'-环状GMP-AMP(3'3'-cGAMP)。它也能分别从ATP和GTP产生c-di-AMP和c-di-GMP；然而，与由真核生物产生的2'3'-cGAMP相比，3'3'-cGAMP是由DncV体内产生的主要分子。它是有效的霍乱弧菌(V.cholerae)肠道定殖所必需的，并且使影响定殖的趋化性过程下调。它对dATP、TTP、UTP和CTP无活性。DncV蛋白是一种来自霍乱弧菌的产生3'3'cGAMP的环状GMP-AMP合酶。3'3'cGAMP是STING激动剂。

“EAL结构域”意指在多种细菌信号传导蛋白中发现的保守蛋白结构域。EAL结构域可以作为二鸟苷酸磷酸二酯酶起作用，并且已被表明刺激第二信使环状di-GMP的降解。非功能性EAL结构域将不具有这些功能中的一种或更多种。EAL结构域的实例包括307个氨基酸的结核分枝杆菌Rv1357c，其基因为NCBI基因ID：886815，并且由该基因编码的蛋白质是UniProtKB/Swiss-Prot:P9WM07，UniProtKB/Swiss-Prot:P9WM07编码c-di-GMP磷酸二酯酶(PDE)并且包含单个EAL结构域。该酶的活性是用作c-di-GMP磷酸二酯酶，将环状二核苷酸(其具有信号传导活性)裂解成2个GMP分子(其缺乏信号传导活性)，如标题为“A full-length bifunctional protein involved in c-di-GMP turnover is required forlong-term survival under nutrient starvation in Mycobacterium smegmatis”，Bharati BK,Sharma IM,Kasetty S,Kumar M,Mukherjee R,ChatterjiD.Microbiology.2012Jun；158(Pt 6):1415-27.doi:10.1099/mic.0.053892-0.Epub2012Feb 16.PMID:22343354的文章中描述的。EAL结构域的另一个实例包括H37Rv中的336个氨基酸的结核分枝杆菌cdnP基因(Rv2837c)，是一种c-di-AMP磷酸二酯酶，包含具有水解人类2’-3’cGAMP(人类cGAS酶的产物)的能力的EAL结构域，如由Jain-Dey Bishai等人.NatChem Biol.2017；13:210-217PMID28106876所示的。EAL结构域(环状二核苷酸磷酸二酯酶活性)和GGDEF结构域(环状二核苷酸环化-生物合成活性)的结构特征是已知的并且被很好地描述(例如，在Schirmer T,Jenal U.Structural and mechanistic determinants ofc-di-GMP signaling.Nat Rev Microbiol.2009；7:724-35.PMID:19756011中)。

“有效量”意指相对于未治疗的患者，改善疾病的症状所需的量。用于实施本发明的用于治疗性治疗疾病的一种或多于一种活性化合物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这样的量被称为“有效”量。

“dncV”意指1)编码环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白的dncV基因或核酸序列，或2)环状GMP-AMP合酶蛋白。实例包括但不限于NCBI基因ID：2614190的霍乱弧菌dncV基因，并且由该基因编码的蛋白质是UniProtKB/Swiss-Prot:Q9KVG7.1。

“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。该部分优选地包含参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以包含例如10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个核苷酸或氨基酸。

“基因缺失”意指使用本领域技术人员熟知的等位基因交换(allelic exchange)方法以使感兴趣的基因的全部基因编码区从BCG的染色体缺失。用选择性标志物诸如抗生素抗性盒进行的基因置换是等位基因交换的一种形式，并且可以进行。也存在产生未标记的缺失(无选择性标志物)的技术，其中基因完全缺失，并且没有选择性标志物被引入其位置。

“基因结构域缺失”意指使用上文的等位基因交换方法来去除编码特定结构域的基因部分(在本发明的情况下，是编码多功能性多肽的CDN磷酸二酯酶结构域的Rv1354c的EAL结构域)，而使多肽的其他部分保持完整并符合读框(in frame)。

“智人(H.sapiens)”意指智人(Homo sapiens)。

“获得”或如在“获得剂”中意指合成、购买或以其他方式得到剂。

“过表达”意指，在一般意义上，表达其相应蛋白质的基因的数量大于野生型或参考基因。在本发明中产生过表达蛋白质的基因的实例包括将编码感兴趣的基因的DNA融合至BCG中的强启动子诸如Phsp60或强条件性活性启动子(conditionally activepromoter)诸如PtetOFF。在PtetOFF中，基因表达在四环素、脱水四环素或多西环素的存在下关闭；然而，当重组BCG作为免疫疗法在人类或动物模型中施用时，感兴趣的基因将被开启。这种条件性活性策略具有以下优点：防止在BCG生长时，产生环状二核苷酸的酶的强过表达可能对BCG生物体具有任何对生存力或生长速率的有害影响，并且仅当BCG免疫疗法作为治疗剂被给予哺乳动物宿主时才允许强表达(“过表达”)。

“Mtb”意指结核分枝杆菌。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适于其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及适于天然存在的氨基酸聚合物。多肽可以被修饰，例如通过添加碳水化合物残基以形成糖蛋白。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋白以及非糖蛋白。

“减少”或“降低”意指例如至少约10％、25％、50％、75％或100％，或其间的任何百分比的负变化。

“增加”意指例如至少约10％、25％、50％、75％或100％，或其间的任何百分比的正变化。

“参考”意指标准或对照条件。

“参考序列”意指用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常是至少约16个氨基酸、优选地至少约20个氨基酸、更优选地至少约25个氨基酸、并且甚至更优选地约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度将通常是至少约50个核苷酸、优选地至少约60个核苷酸、更优选地至少约75个核苷酸、并且甚至更优选地约100个核苷酸或约300个核苷酸、或其附近或其间的任何整数。

“参考BCG菌株”意指，例如，不包含本发明的表达载体和/或其内源基因不能表达cdnP功能蛋白、Rv1354c功能蛋白、Rv1357c功能蛋白或其组合的常规BCG菌株。

“识别调控DNA的能力”意指蛋白质检测或结合DNA的能力。例如，已知cGAS蛋白与DNA诸如胞质DNA结合，并且触发GTP和ATP的反应，以形成环状GMP-AMP(cGAMP)。cGAMP与干扰素基因的刺激物(STING)结合，这经由TBK1触发IRF3的磷酸化。

“Rv1354c”意指1)编码Rv1354c蛋白的Rv1354c基因或核酸序列，或2)Rv1354c蛋白(例如，Gupta、Kumar和Chatterji；PLoS ONE(2010年11月)；第5卷；第11期；以及Bhariati、Sharma、Kasetty、Kumar、Mukherjee和Chatterji；Microbiology(2012),158,1415-1427)。Rv1354c蛋白是产生c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶。c-di-GMP是STING激动剂。

“Rv1357c”意指1)编码环状di-GMP磷酸二酯酶蛋白(Rv1357)的Rv1357基因或核酸序列，或2)环状di-GMP磷酸二酯酶蛋白(例如，Gupta、Kumar和Chatterji；PLoS ONE(2010年11月)；第5卷；第11期；以及Bhariati、Sharma、Kasetty、Kumar、Mukherjee和Chatterji；Microbiology(2012),158,1415-1427)。Rv1357c蛋白是产生c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶。c-di-GMP是STING激动剂。

“STING激动剂”意指与STING(干扰素基因的刺激物，或TMEM173)结合，活化STING，并且触发IRF3-TBK1途径的活化，导致1型干扰素和其他基因的转录增加的分子。

“CDN”意指环状二核苷酸，诸如3’-5’c-di-AMP、3’-5’c-di-GMP、3’-3’cGAMP(也被称为3′-5′,3′-5′cGAMP，是霍乱弧菌DncV蛋白的产物)、或2’-3’cGAMP(也被称为2’-5’,3’-5’cGAMP，是人类cGAS蛋白的产物)。

“PAMP”意指病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern)。PAMP是微生物产物，包括被先天免疫传感器识别的小分子。PAMP的实例是3'-5'c-di-AMP、3'-5'c-di-GMP、3'-3'cGAMP。

“DAMP”意指危险相关分子模式(danger associated molecular pattern)。DAMP是宿主来源的(即人类、小鼠或其他哺乳动物疾病模型)分子，产生这些分子以发出危险信号，所述危险诸如感染或其他正常生理学紊乱。DAMP的实例是2’-3’cGAMP，2’-3’cGAMP由宿主传感器酶cGAS在检测到胞质中的双链DNA后产生，如在病毒或某些细胞内细菌感染期间发生的。

“panCD”意指来自细菌或其他物种的遗传操纵子，它编码生物合成基因panC(编码具有泛酸-β-丙氨酸连接酶酶活性的PanC蛋白)和生物合成基因panD(编码具有天冬氨酸1-脱羧酶酶活性的PanD蛋白)。PanC和PanD蛋白是对于也被称为维生素B₅(一种B族维生素)的泛酸或泛酸盐的生物合成必需的。泛酸，一种水溶性维生素，是细菌和所有分枝杆菌包括BCG的必需营养素。泛酸是合成辅酶A(CoA)以及合成和代谢蛋白质、碳水化合物和脂肪所需的。

“特异性结合”意指例如识别和结合多肽或核酸序列，但基本上不识别和结合样品中的其他分子的化合物、核酸、肽、蛋白质或抗体。

“基本上相同”意指表现出与参考氨基酸序列(例如，本文描述的氨基酸序列中的任一种)或核酸序列(例如，本文描述的核酸序列中的任一种)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这样的序列在氨基酸或核酸水平与用于比较的序列至少60％、更优选地80％或85％、并且更优选地90％、95％或甚至99％相同。序列同一性通常使用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)来测量。这样的软件通过对多种取代、缺失和/或其他修饰分配同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e^-3和e^-100之间的概率评分指示密切相关序列。

“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。

“灵敏度”意指患有特定疾病的受试者的百分比。

“特异性”意指被正确地鉴定为患有特定疾病的受试者的百分比，即正常或健康受试者。例如，特异性被计算为与非癌症受试者(例如，正常的健康受试者)相比，患有特定疾病的受试者的数量。

“训练免疫”意指一种抗原刺激物引发更强的针对在稍后时间施用的第二种不同的抗原物的免疫应答的能力。训练免疫是不依赖抗原的、基于异源CD4和CD8记忆活化的、细胞因子介导的，并且与表观遗传和代谢变化相关。

“Phsp60”或“Phsp65”意指来源于麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)Hsp655’UTR的强分枝杆菌启动子。

“5’UTR”意指基因的5’非翻译区。

“3’UTR”意指基因的3’非翻译区。

“WT”意指野生型。

“BCG-WT”意指野生型牛分枝杆菌卡介苗菌株。

如本文使用的，本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简略表示。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”及类似词是指减少或改善紊乱和/或与其相关的症状。将理解，治疗紊乱或状况不要求(尽管不排除)紊乱、状况或与其相关的症状完全被消除。

除非从上下文中具体地陈述或明显的，如本文使用的术语“或”被理解为是包含性的。除非从上下文中具体地陈述或明显的，如本文使用的术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”被理解为是单数或复数。

除非从上下文中具体地陈述或明显的，如本文使用的术语“约”被理解为在本领域的正常公差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以被理解为在所陈述的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外从上下文清楚的，本文提供的所有数值都用术语约修饰。

如本文使用的，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”及类似词可以具有归于美国专利法的含义并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”及类似词；“基本上由……组成(consistingessentially of)”或“基本上包括(consists essentially)”同样地具有归于美国专利法的含义，并且术语是开放式的，允许比被叙述的更多的存在，只要被叙述的基本或新颖特征不被比叙述的更多的存在改变，但不包括现有技术的实施方案。

本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或更多种组合。

如本文使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”及类似词是指减少受试者中发展紊乱或状况的概率，所述受试者不具有，但处于发展紊乱或状况的风险或易于发展紊乱或状况。

这样的治疗(手术和/或化疗)将被合适地施用至罹患、患有、易患膀胱癌或疾病、紊乱或其症状，或处于膀胱癌或疾病、紊乱或其症状的风险的受试者，特别是人类。确定“处于风险”的那些受试者可以通过受试者或卫生保健提供者的诊断测试或意见(例如，遗传测试、酶或蛋白质标志物、标志物(如本文定义的)、家族史等)的任何客观或主观确定来进行。在特定实施方案中，确定受试者易患胰腺癌或患有胰腺癌通过测量至少一种标志物的水平来确定。

附图简述

图1A-图1B从pSD5B P_hsp60::disA质粒构建体过表达disA的分枝杆菌将大量的c-di-AMP释放到巨噬细胞胞质中并且转录高水平的disA mRNA。A.用携带pSD5B P_hsp60::disA质粒的结核分枝杆菌或野生型结核分枝杆菌(CDC1551)以1:20的MOI感染的J774巨噬细胞。在感染24小时后，通过LC-MS/MS确定巨噬细胞内c-di-AMP水平。如可以观察到的，M.tb-disA-OE菌株产生比野生型结核分枝杆菌(CDC1551)多～15倍的c-di-AMP。BCG-disA-OE预期将示出类似的高水平的c-di-AMP。(数据来自Dey B,Dey RJ,Cheung LS,Pokkali S,GuoH,Lee JH,Bishai WR.A bacterial cyclic dinucleotide activates the cytosolicsurveillance pathway and mediates innate resistance to tuberculosis.NatMed.2015；21:401-6.PMID:25730264。)B.携带pSD5B P_hsp60::disA质粒的BCG-Pasteur或BCG-Pasteur-WT生长到指数中期(mid-exponential phase)。将细菌裂解并且制备mRNA。通过定量RT-PCR确定disA mRNA的水平。BCG-disA-OE菌株产生比BCG-Pasteur-WT多～50倍的disA mRNA。

图2。过表达disA的BCG增加了促炎性细胞因子。用野生型BCG-Pasteur菌株和disA过表达的BCG-Pasteur菌株攻击的小鼠BMDM中促炎性细胞因子和IFN-β的基因表达谱分析(gene expression profiling)(qPCR)。

图3。过表达disA的BCG增加了IRF3信号传导。disA过表达对IRF途径的活化的影响通过IRF-SEAP QUANTI Blue报告物测定进行测量。测定感染的RAW-Blue ISG细胞的培养物上清液的IRF活化。IRF活化图下方的图像代表QUANTI Blue测定板和样品孔；一列孔的处理参数对应于上方与孔对准的柱所定义的参数。本图中的BCG-disA-OE来源于BCG Pasteur。

图4A-图4C。响应于disA过表达的促炎性细胞因子的增加。用野生型BCG-Pasteur菌株和disA过表达的BCG-Pasteur菌株攻击的小鼠BMDM中TNF-α(A)、IL-6(B)和IL-1β(C)的差异表达。通过ELISA测定培养物上清液的不同细胞因子。

图5。过表达disA的BCG诱导人类膀胱癌细胞(RT4)中有差异的免疫应答。用野生型BCG-Pasteur、野生型BCG-Tice菌株和BCG-Pasteur-disA-OE攻击的人类RT4膀胱癌细胞中的差异基因表达。使用基于SYBR green的定量实时PCR测量mRNA的表达水平。

图6。测试野生型菌株和BCG-disA-OE菌株的相对治疗功效的示意性工作流程。

图7。未治疗的荷瘤大鼠或者用WT BCG或过表达disA的rBCG治疗的荷瘤大鼠的肿瘤受累指数(tumor involvement index)(rBCG＝BCG-Pasteur-disA-OE；wtBCG＝BCG-Pasteur)。

图8。响应于使用不同BCG菌株的膀胱内疗法的MNU诱导的Fischer大鼠膀胱肿瘤的免疫谱分析。在使用野生型牛分枝杆菌BCG-Pasteur菌株和disA过表达的牛分枝杆菌BCG-Pasteur菌株的疗法后，大鼠膀胱肿瘤细胞中的差异基因表达。使用基于TaqMan的定量实时PCR测量mRNA的表达水平。BCG-WT是BCG Pasteur，并且BCG-disA-OE来源于本图中的BCGPasteur。

图9。来自未治疗的MNU肿瘤荷瘤大鼠(MNU tumor bearing rats)或者用WT或过表达disA的rBCG治疗的MNU肿瘤荷瘤大鼠的膀胱的基因表达谱分析。

图10。在不同细胞或组织中BCG-disA-OE对比BCG-WT的相对基因表达的汇总。用BCG-disA-OE和BCG-WT感染小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)、人类永生化膀胱癌细胞系RT4和5637以及大鼠永生化膀胱癌细胞系24小时，并且从细胞中制备mRNA。大鼠通过膀胱内滴注暴露于MNU 8周，并且然后通过膀胱内滴注用BCG-disA-OE或BCG-WT治疗8周。在第16周尸检时取出膀胱，并且制备mRNA。对所指示的细胞因子或趋化因子基因进行定量RT-PCR。示出的变化是观察到的BCG-disA-OE针对观察到的BCG-WT归一化的倍数诱导或减少。BCG-WT是BCG Pasteur，并且BCG-disA-OE来源于本图中的BCG Pasteur。

图11。提出的过表达disA的BCG的作用机制。

图12。对BCG的分子遗传修饰，这将增加作为STING激动剂的CDN PAMP和DAMP分子的水平。PAMP：病原体相关分子模式(由细菌产生)：c-di-AMP(disA)、c-di-GMP(Rv1354c)、3’3’-cGAMP(dncV)。DAMP：危险相关分子模式(由宿主产生)：2’-3’-cGAMP。OE：过表达。KO：敲除(基因置换)。

图13。BCG中存在的两种环状二核苷酸环化酶和磷酸二酯酶蛋白：BCG_RS07340和BCG_AHM07112的图。BCG_RS07340是一种具有CDN环化酶和CDN PDE活性两者的双功能蛋白。BCG_AHM07112是CDN PDE。结构域是：GAF(调控)、GGDEF(二鸟苷酸环化酶)和EAL二鸟苷酸磷酸二酯酶。

图14。与野生型结核分枝杆菌(Mtb-CDC1551)相比，携带pSD5B P_hsp60::disA质粒的结核分枝杆菌(M.tb-disA-OE或Mtb-OE)在小鼠中的毒力显著减弱。6-7周龄的雌性BALB/c小鼠(n＝10/组)如上文描述的通过气溶胶感染(aerosol infection)用～3.5log10 CFU进行感染。在第1天，对每组中的3只小鼠进行CFU计数，并且确认植入了3.5log10 CFU单位。小鼠保持饲养直到死亡。如可以观察到的，野生型结核分枝杆菌感染的中值死亡时间为150.5天。相比之下，用相同的M.tb-disA-OE(Mtb-OE)接种物感染的小鼠具有321.5天的中值死亡时间(p<0.001)。与BCG-WT相比，BCG-disA-OE预期在小鼠中显示出类似的毒力损失。(数据来自Dey B,Dey RJ,Cheung LS,Pokkali S,Guo H,Lee JH,and Bishai WR.A bacterialcyclic dinucleotide activates the cytosolic surveillance pathway and mediatesinnate resistance to tuberculosis.Nat Med.2015；21:401-6.PMID:25730264。)

图15A-图15B。其他BCG菌株也是有活性的：过表达disA的BCG Tice菌株也显示出与过表达disA的BCG Pasteur相似的促炎性细胞因子诱导。骨髓来源的巨噬细胞用BCGPasteur菌株和BCG Tice菌株两者的野生型菌株和disA过表达的菌株以1:20的M.O.I攻击15h。收获培养物上清液并且使用ELISA探测细胞因子。用两种不同的BCG菌株攻击的小鼠BMDM中TNF-α(A)和IL-6(B)的差异表达模式。BCG-Tice菌株来自商购可得的Onco-Tice产品。

图16。巨噬细胞中响应于BCG-disA-OE的I型干扰素应答是STING依赖的。将来自STING消融(KO)的小鼠和对照小鼠的骨髓来源的巨噬细胞用BCG Pasteur的野生型和disAOE菌株攻击24h。使用ELISA探测培养物上清液的IFN-β水平。

图17示出了在非肌层浸润性膀胱癌(NIMBC)的MNU致癌模型中，BCG-disA-OE的膀胱内滴注显示出最大的抗肿瘤功效(统计学显著的病理学改善)。在前8周内，大鼠组接受4次MNU的膀胱内处理(每2周一次处理)，以引发NIMBC。在接下来的8周内，大鼠接受4次PBS(未治疗的)、BCG-WT或BCG-disA-OE的膀胱内治疗(每2周一次治疗)。在16周实验结束时，将大鼠处死，并且取出它们的膀胱。将膀胱的一部分固定并进行H&E染色，并且然后由委员会认证的泌尿科病理学家以不知情的方式(blinded fashion)进行解释。确定并且示出肿瘤受累评分和癌症分期(T2-3、T1、CIS+乳头状病变、单独的CIS或正常-发育异常)。如可以观察到的，BCG-disA-OE滴注导致统计学显著且比PBS(未治疗的)更低的肿瘤受累指数，而BCG-WT未在统计学上显著优于PBS。这个16周的实验进行了两次。图7中的数据代表实验1的结果。本图(图17)中的数据代表实验1加实验2的组合结果。图8和图9中所示的qPCR数据是从实验1结束时尸检时使用膀胱组织获得的。

图18示出了BCG-disA-OE减少鼠同基因膀胱癌肿瘤中的Treg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)。小鼠在肋腹被植入5×10⁶个BBN975鼠膀胱癌肿瘤细胞。当肿瘤的直径为1.5cm时，小鼠接受PBS(对照)、BCG-WT或BCG-disA-OE的3次肿瘤内注射(每2天一次治疗)。在最后一次肿瘤内治疗后两天，将小鼠处死，并且取出它们的脾和肿瘤。在肿瘤细胞分散后，将细胞制备物染色并且进行流式细胞术。如可以观察到的，BCG-disA-OE导致减少的肿瘤CD4⁺Treg、减少的肿瘤CD8⁺Treg和减少的脾CD4⁺Treg。

图19示出了在两种小鼠模型中，BCG-disA-OE比BCG-WT更安全。在图A中，使用Glas-Col雾化室使BALB/c小鼠(有免疫活性的)组暴露于1×10³CFU(通过处死一组小鼠并且确定第1天的肺CFU计数来确认)的BCG-WT或BCG-disA-OE。在4周后，将来自每组的小鼠处死，取出它们的肺，匀浆，并且铺板在7H11琼脂板上。该图示出了BCG-WT和BCG-disA-OE感染的小鼠肺的平均CFU计数。如可以观察到的，与BCG-WT相比，观察到BCG-disA-OE的统计学上显著更低的肺CFU负荷。在图B中，使用Glas-Col雾化室使SCID小鼠(免疫抑制的)组暴露于1×10²CFU(通过处死一组小鼠并且确定第1天的肺CFU计数来确认)的BCG-WT或BCG-disA-OE。第三组未感染。该图示出了小鼠组的Kaplan-Meier存活曲线。如可以观察到的，BCG-disA-OE感染的小鼠具有比BCG-WT感染的小鼠统计学上显著更长的存活时间。

图20示出了在CD14⁺人类单核细胞中，BCG-disA-OE引发比BCG-WT统计学上显著更高水平的“训练免疫免疫学和表观遗传学标志(Trained Immunity immunological andepigenetic marks)”。“训练免疫”是指第一种免疫刺激物诱导针对随后给予的第二种不同抗原性的刺激物的增强免疫应答的能力。在本实验中，CD14⁺人类单核细胞从通过单采血液成分术(apheresis)收集的LeukoPak制备。在第0天，将CD14⁺人类单核细胞用BCG-WT或BCG-disA-OE以5:1的MOI感染3小时。第三组细胞未被感染。在感染后，将细胞洗涤多于一次(每两天一次)。在6天的静息时间(rest period)后，将单核细胞用TLR1/2激动剂PAM3CSK4再刺激2小时。将细胞重复地洗涤，并且随后孵育24h。通过ELISA测量培养物上清液中的分泌的IL-1β的水平。如可以观察到的，与未感染的细胞相比，虽然BCG-WT本身引发统计学上显著更高水平的针对第二刺激物的免疫应答，但是BCG-disA-OE引发比BCG-WT或未感染的细胞统计学上显著更高的应答。

图21示出了BCG-disA-OE引发比BCG-WT更大的在IL6和TNF基因启动子区域中的组蛋白活化标志(H3K4-三甲基化)。“训练免疫”是指第一种免疫刺激物诱导针对随后给予的第二种不同抗原性的刺激物的增强免疫应答的能力。训练免疫与细胞因子和其他免疫介导物的启动子区域中的表观遗传修饰诸如组蛋白甲基化相关。图21中所示的实验在相同的细胞组中进行，并且其方式与图20中描述的完全相同，但以下除外：在用TLR1/2激动剂PAM3CSK4(缩写为PAM3)进行第二次刺激后，收获固定的细胞，使染色质交联，并且收集DNA用于使用对H3K4-me3组蛋白甲基化标志特异性的抗体的染色质免疫沉淀分析(ChIP)。已知H3K4-me3是基因活化标志。该图示出了免疫沉淀的DNA的丰度的相对倍数变化，如使用用于IL6和TNF基因启动子区域的引物通过定量PCR测量的。如可以观察到的，在用第二种刺激物PAM3CSK4攻击后，BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE两者均导致IL6和TNF启动子区域中H3K4组蛋白三甲基化水平比它们相应的BCG-WT菌株显著更大。

图22示出了BCG-Tice-disA-OE的成功构建。本发明人先前的工作已经利用BCG-Pasteur来构建BCG-Pasteur-disA-OE。该菌株由Frank Collins博士于1995年提供给本发明人中的一位。该菌株是被称为BCG-Pasteur-Aeras的同一菌株。BCG-Tice由Merck制造和销售，并且是美国唯一一种可得的经FDA批准的BCG。本发明人购买BCG-Tice，制备了电感受态BCG-Tice，并且将pSD5-hsp60-MT3692质粒电穿孔到BCG-Tice中。该图示出了转化的BCG-Tice的5个卡那霉素抗性候选物克隆的菌落PCR的结果，并且确认了通过将pSD5-hsp65-MT3692质粒电穿孔到BCG-Tice中成功地制备了BCG-Tice-disA-OE。注意命名法，本发明人先前提及了该相同的质粒pSD5-hsp60-MT3692。然而，该菌株中的实际启动子是麻风分枝杆菌(M.leprae)的hsp65基因的启动子。因此，本发明人现在更正确地将质粒称为pSD5-hsp65-MT3692。

图23示出了来自图22中所示的转化实验的BCG-Tice-disA-OE的克隆2强表达disA基因。实时PCR用于示出四个不同BCG-Tice-disA-OE克隆中的差异disA表达。使用基于SYBRgreen的定量实时PCR，使用对数期培养物在从对数晚期培养物分离的总RNA中测量基因表达。图解的数据点代表3个独立实验的平均值±平均值标准误差(SEM)。结核分枝杆菌sigA(Rv2703)用作内部对照。使用2^-ΔΔCT方法进行数据分析。学生t检验后进行Welch校正(***P<0.001；**P<0.01)。本发明人产生了BCG-Tice-disA-OE克隆2的种子批，并且在随后的所有工作中将该克隆简称为“BCG-Tice-disA-OE”。

图24示出了与BCG-Pasteur-WT相比，用BCG-Pasteur-disA-OE感染的小鼠骨髓来源的巨噬细胞中有效的、统计学上显著增强的IRF3诱导。将小鼠(C57BL/6)骨髓来源的巨噬细胞用BCG Pasteur的野生型和disA过表达的菌株(20MOI)感染3h。用温的DPBS洗涤细胞以去除未内化的杆菌(bacilli)，并且随后孵育另外3小时。使用基于SYBR green的定量实时PCR，在从细胞裂解物中分离的总RNA中测量IRF3表达。图解的数据点代表3个独立实验的平均值±平均值标准误差(SEM)。小鼠β-肌动蛋白用作内部对照。使用2^-ΔΔCT方法进行数据分析。学生t检验后进行Welch校正(***P<0.001；**P<0.01)。

图25示出了STING是响应于BCG-WT和BCG-disA-OE增强的I型IFN(IFN-β)诱导所必需的。用不同的BCG菌株(MOI＝1:20)感染来自STING消融(STING-KO)的野生型动物的小鼠(C57BL/6)骨髓来源的巨噬细胞3h。使用温的DPBS洗涤细胞以去除未内化的杆菌，并且随后孵育另外24h，然后收获培养物上清液。按照制造商的说明，在培养物上清液中进行针对IFN-β的ELISA。数据点代表3个独立生物实验的平均值±平均值标准误差(S.E.M.)。学生t检验后进行Welch校正(**P<0.01)。

图26示出了干扰素-β在鼠BMDM、BMDC和J774.1巨噬细胞中在暴露于disA过表达的BCG菌株时被诱导，并且对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的IFN-β应答在统计学上显著大于相应的BCG-WT菌株。使用不同的BCG菌株(MOI:20)感染小鼠(C57BL/6)骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和J774.1巨噬细胞3h。使用温的DPBS洗涤未内化的杆菌，并且将细胞孵育另外24小时。按照制造商的说明，使用ELISA对培养物上清液中的IFN-β水平进行定量。数据点代表3个独立生物实验±平均值标准误差(S.E.M.)。使用未配对t检验进行数据分析(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

图27示出了IL-6在小鼠BMDM、BMDC和J774.1巨噬细胞中响应于暴露于disA过表达的BCG菌株被诱导，并且对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的IL-6应答在统计学上显著大于相应的BCG-WT菌株。使用不同的BCG菌株(MOI:20)感染小鼠(C57BL/6)骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和J774.1巨噬细胞3h。使用温的DPBS洗涤未内化的杆菌，并且将细胞孵育另外24小时。按照制造商的说明，使用ELISA对培养物上清液中的IL-6水平进行定量。数据点代表3个独立生物实验±平均值标准误差(S.E.M.)。使用未配对t检验进行数据分析(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

图28示出了TNF在小鼠BMDM、BMDC和J774.1巨噬细胞中响应于暴露于disA过表达的BCG菌株被诱导，并且对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的应答在统计学上显著大于相应的BCG-WT菌株。使用不同的BCG菌株(MOI:20)感染小鼠(C57BL/6)骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和J774.1巨噬细胞3h。使用温的DPBS洗涤未内化的杆菌，并且将细胞孵育另外24小时。按照制造商的说明，使用ELISA对培养物上清液中的TNF水平进行定量。数据点代表3个独立生物实验±平均值标准误差(S.E.M.)。使用未配对t检验进行数据分析(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

图29示出了TNF和IFN-γ在大鼠膀胱癌NBT-II细胞系中响应于暴露于disA过表达的BCG菌株被诱导，并且对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的两种应答在统计学上显著大于相应的BCG-WT菌株。用BCG的野生型和重组菌株感染NBT-II细胞3h。使用温的DPBS重复洗涤未内化的杆菌，并且将细胞孵育另外24h。培养物上清液用于定量TNF和IFN-γ。数据点代表3个独立生物实验±平均值标准误差(S.E.M.)。使用未配对t检验进行数据分析(***P<0.0001；**P<0.001；*P<0.05)。

图30示出了IFN-β、IFN-γ、TNF和IL-1β在人类移行细胞乳头瘤RT4膀胱癌细胞系中响应于暴露于disA过表达的BCG菌株被诱导，并且对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的四种应答大于相应的BCG-WT菌株。用BCG的野生型和重组菌株感染RT4细胞3h。使用温的DPBS重复洗涤未内化的杆菌，并且将细胞孵育另外24h。按照制造商的说明，培养物上清液用于定量细胞因子。数据点代表2个独立生物实验±平均值标准误差(S.E.M.)。使用未配对t检验进行数据分析(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

图31示出了BCG-disA-OE比BCG-WT更大程度地刺激多于一个膀胱癌细胞系中增加的IFN-β水平。该图示出了暴露于BCG-WT、BCG-disA-OE和LPS后的IFN-βmRNA的水平(通过2^-ΔΔCT方法的相对表达)。5637细胞是人类肌层浸润性膀胱癌细胞，RT4细胞是人类移行细胞乳头瘤膀胱癌细胞，并且NBT-II细胞是通过N-丁基-N-(-4-羟丁基)亚硝胺诱导的大鼠膀胱癌细胞。

图32示出了在气溶胶感染后的不同时间点，BCG-WT和BCG-disA-OE感染的小鼠肺中IFN-β、IFN-γ、IL-6和TNF的细胞因子应答。该图揭示了对于大多数细胞因子在大多数时间点，对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的应答大于相应的BCG-WT菌株。BALB/c小鼠通过气溶胶途径感染，如图19中描述的。在感染后2周、4周和6周处死各组小鼠。制备肺匀浆，并且按照制造商的方案使用ELISA对细胞因子水平进行定量(n＝4只动物/治疗组±S.E.M.)。使用配对t检验进行数据分析(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

图33示出了在气溶胶感染后4周，BCG-WT和BCG-disA-OE感染的小鼠脾中IFN-β、IFN-γ、IL-6和TNF的细胞因子应答。该图揭示了对于大多数细胞因子，对BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE的应答大于相应的BCG-WT菌株。BALB/c小鼠通过气溶胶途径感染，如图19中描述的。在感染后4周处死各组小鼠。制备脾匀浆，并且按照制造商的方案使用ELISA对细胞因子水平进行定量(n＝4只动物/治疗组±S.E.M.)。使用配对t检验进行数据分析(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

图34示出了产生过表达STING-激动剂的无抗生素抗性基因的重组BCG的方法。在给定的实例中，一种遗传修饰的、无抗生素抗性基因的BCG被创建以过表达BCG disA基因并且释放过量的c-di-AMP(一种已知的STING激动剂)。然而，相同的策略可以用于过表达Rv1354c(产生另一种已知的STING激动剂c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶)、DncV(来自霍乱弧菌的产生另一种已知的STING激动剂3’-3’-cGAMP的环状GMP-AMP合酶，)、cGAS(来自人类的产生另一种已知的STING激动剂2’-3’cGAMP的环状GMP-AMP合酶)，或另一种产生STING激动剂的类似酶基因。

在步骤1中，BCG-WT菌株通过质粒pJV53(SEQ ID NO:32)的电穿孔并且在含有卡那霉素的7H11琼脂板上选择来转化。pJV53携带来自分枝杆菌噬菌体Che9c的gp60和gp61基因，它们分别编码RecE和RecT的同源物。Che9c gp60和gp61分别编码核酸外切酶和DNA结合活性，并且这些蛋白质的表达显著升高了分枝杆菌的同源重组能力(homologousrecombination proficiency)。步骤1产生如图中所示的“有重组能力的BCG(recombination proficient BCG)”。在确认转化体后，阳性克隆将在卡那霉素的存在下扩增，并且将用于制备电感受态细胞。为了制备这些电感受态细胞，细菌生长至对数中期，用0.2％乙酰胺诱导(以上调Che9c gp60和Che9c gp61重组工程基因的表达)24小时，然后被制备成电感受态。

在步骤2中，产生对应于SEQ ID NO:33的线性化等位基因交换底物(AES)构建体。AES(SEQ ID NO:33)包含一侧侧翼为500bp的panCD操纵子的5’UTR并且另一侧为500bp的panCD操纵子的3’UTR的dif-Hyg-dif盒(SEQ ID NO:34)序列。AES(SEQ ID NO:33)通过将500bp的panCD操纵子的5’UTR和500bp的panCD操纵子的3’UTR克隆到pUC-Hyg质粒(SEQ IDNO:35)产生质粒pUC-Hyg-panCD-KO(SEQ ID NO:36)来构建。pUC-Hyg-panCD-KO(SEQ IDNO:36)通过用NruI和NcoI消化来裂解，以产生对应于SEQ ID NO:33的线性AES。可选择地，引物SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29可以用于扩增线性AES(SEQ ID NO:33)。然后将对应于SEQ ID NO:33的线性化等位基因交换底物(AES)构建体电穿孔到“有重组能力的BCG”中，并且在含有潮霉素和卡那霉素的7H11琼脂板上选择克隆。该步骤产生了“携带panCD KO盒的BCG”，其中AES(SEQ ID NO:33)已经通过同源重组整合到染色体的panCD操纵子中。

在步骤3中，将“携带panCD KO盒的BCG”的几百个菌落复制铺板在(i)含有卡那霉素的7H11琼脂板和(ii)补充有泛酸盐(24μg/ml)的含有卡那霉素的7H11琼脂两者上。选择Kan抗性的泛酸盐营养缺陷型克隆，所述克隆仅在补充有泛酸盐(24μg/ml)的含有卡那霉素的7H11琼脂上生长，而不能在缺乏泛酸盐的含有卡那霉素的7H11琼脂板上生长。在此步骤期间，分枝杆菌Xer重组酶(其在dif位点识别和重组)的天然作用导致产生克隆的潮霉素盒的切除和缺失，该克隆是如所示的“携带pJV53的泛酸盐营养缺陷型”。

在步骤4中，将“携带pJV53的泛酸盐营养缺陷型”铺板在含有蔗糖的7H11琼脂板上，以选择携带sacB基因(在蔗糖的存在下赋予致死性)的pJV53的缺失。选择蔗糖耐受性克隆，并且确认这些克隆是卡那霉素敏感的。这产生了是“不含pJV53的泛酸盐营养缺陷型”的克隆。

在步骤5中，制备电感受态“不含pJV53的泛酸盐营养缺陷型”。质粒“pSD5.phsp65-disA.panCD—无Kan”(SEQ ID NO:31)如图36中描述的产生。将SEQ ID NO:31电穿孔到“不含pJV53的泛酸盐营养缺陷型”中，并且将克隆铺板在不含泛酸盐的7H11琼脂上，以产生期望的“携带disA-OE质粒的泛酸盐营养缺陷型”。候选克隆通过相关基因的PCR和通过全基因组测序来确认。

图35示出了含有panCD等位基因交换底物(AES)(其是SEQ ID NO:33)的DNA片段的分子结构。

图36示出了用于产生“pSD5.hsp65-disA.panCD--无Kan”(SEQ ID NO:31)的策略。该方案用panCD操纵子置换Kan盒“pSD5.hsp65-disA.Kan”(SEQ ID NO:30)以产生"pSD5.hsp65-disA.panCD--无Kan"(SEQ ID NO:31)。

图37示出了pJV53的分子结构，pJV53是为SEQ ID NO:32的重组工程质粒。

图38示出了pUC-Hyg的分子结构，pUC-Hyg是一种具有侧翼为dif位点的Hyg盒的质粒，为SEQ ID NO:35。pUC-Hyg用于产生质粒“pUC-Hyg-panCD-KO”(SEQ ID NO:36)。

图39示出了为SEQ ID NO:36的质粒“pUC-Hyg-panCD-KO”的分子结构。“pUC-Hyg-panCD-KO”通过在Hyg盒的一个侧翼上克隆500bp的panCD 5’UTR，并且在另一个侧翼上克隆500bp的panCD 3’UTR来产生。

图40示出了为SEQ ID NO:30的质粒“pSD5.hsp65-disA.Kan”的分子结构。

图41示出了为SEQ ID NO:31的质粒“pSD5.hsp65-disA.panCD—无Kan”的分子结构。该质粒使用图36中图示的方案产生。

图42示出了在本发明中使用的一些核酸和蛋白质序列。

图43示出了在本发明中使用的核酸和蛋白质序列的描述。

图44示出了阳性样本的数量。

发明详述

在一些实施方案中，本发明涉及牛分枝杆菌BCG(下文中，“BCG”)的遗传改变，这产生重组BCG(下文中，“rBCG”)菌株。这些菌株具有作为(i)结核疫苗和/或(ii)用于非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)的免疫疗法的更大潜力。本发明的一些实施方案涉及合成和分泌高水平的环状二核苷酸(CDN)的BCG菌株，已知其引发来自人类吞噬细胞诸如巨噬细胞、树突状细胞和其他细胞的有价值的免疫调节应答。本发明的另一种实施方案是将BCG的遗传修饰组合以产生多价CDN-过表达修饰，包括新的合成CDN的遗传物质的添加和/或将增强CDN的积累和释放的内源BCG磷酸二酯酶基因或遗传结构域的突变。

BCG

BCG(卡介苗)是由法国微生物学家Calmette和Guerin在1921年通过13年连续传代有毒力的牛分枝杆菌而产生的突变体形式的牛分枝杆菌。在1921年和1960年之间，BCG在世界上许多实验室中进行了连续传代，直到建立确定的种子批并储存在参考实验室中。因此，BCG的许多变体在世界范围内存在，诸如BCG Pasteur、BCG Tice、BCG Tokyo、BCG Danish、BCG Montreal等。大多数现有BCG菌株现在已经通过全基因组测序确定。有毒力的牛分枝杆菌和多种BCG菌株之间的主要差异包括与有毒力的结核分枝杆菌相比，BCG中缺失至少15个包含基因组缺失的差异区域。BCG发育中的关键差异区域是RD1(9.5kb的缺失，导致Esx-1分泌系统的损失和不能释放抗原ESAT-6和CFP-10)和RD3(9.2kb的缺失)。与有毒力的结核分枝杆菌相比，所有BCG菌株中都不存在RD4-RD11差异区域。

自20世纪20年代以来，BCG一直被用作预防结核病(TB)的疫苗。在2004年，估计BCG被给予约1亿名儿童，因此自其初次投入使用以来，BCG已经被给予约50亿人，并且因此是历史上最广泛使用的疫苗。出生时最常见的是皮内给予，并且迄今为止，除了美国、加拿大和欧洲部分地区，在大多数国家它仍然被给予。已经表明BCG降低儿童播散性TB的发病率，但接种BCG的个体不能完全被保护免于TB的风险。

自1977年以来，BCG还作为用于非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)的癌症免疫疗法获得了广泛的使用。BCG被每周膀胱内给予持续六周，并且在一些情况诸如高风险疾病中，在初始疗法后的3个月、6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月，BCG作为维持疗法被每周给予，持续三周。已经表明膀胱内BCG(i)诱导主要包含CD4 T细胞和巨噬细胞的单核细胞浸润，(ii)增加膀胱中干扰素γ(IFNγ)的表达，并且(iii)增加尿细胞因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IFNγ和TNFα的水平。

尽管BCG在全球广泛用作(i)用于TB的疫苗和(ii)用于NMIBC的免疫疗法，但其功效存在相当大的提高空间。对于TB，BCG仅主要针对儿童播散性结核病提供部分保护。对于NMIBC，约30％的患者患有BCG耐受性疾病。这些个体需要较高风险的全身化疗的治疗，并且具有进展为更有浸润性的形式的膀胱癌的较高比率。

尿路上皮癌

膀胱的尿路上皮癌是最常见的尿道恶性肿瘤。尿路上皮癌是男性中第四常见的癌症，并且是女性中第十一常见的癌症。估计在2017年美国将诊断出约79,000例膀胱癌的新病例，与19,870例死亡相关。虽然膀胱癌患者的估计五年存活率为78％，但对于患有局部晚期或转移性疾病的患者，存活率显著下降。约75％的患有膀胱癌的患者呈现出局限于粘膜(Ta期，原位癌)或粘膜下层(T1期)的疾病，被称为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)。经尿道切除术是NMIBC的初始治疗选择。对于患有肌层浸润性膀胱癌(MIBC；T2或更晚期)的患者，一线治疗选择是含铂化疗，随后是膀胱移除。对于那些不响应于膀胱内治疗的患有NMIBC的患者，存在进展成MIBC的高风险。因此，高复发率和显著的进展风险要求实施另外的疗法。因此，改善患有高风险NMIBC的患者的临床结果需要开发新的治疗。

在20世纪70年代被开发用于NMIBC的卡介苗(BCG)的膀胱内施用提供了第一种成功的针对已确立的实体癌的免疫疗法，并且它仍是用于患有NMIBC的患者的护理标准。(Askeland EJ,Newton MR,O'Donnell MA,Luo Y.Bladder Cancer Immunotherapy:BCGand Beyond.Adv Urol.2012；2012:181987.PMID:22778725.Morales A.BCG:A throwbackfrom the stone age of vaccines opened the path for bladder cancerimmunotherapy.Can J Urol.2017；24:8788-8793.PMID:28646932)。牛分枝杆菌的减毒菌株BCG的抗肿瘤作用的确切机制尚不清楚，但据信BCG通过纤连蛋白和整合素α5β1与尿路上皮结合后，协调强的免疫细胞和体液免疫应答，主要是Th1应答(Redelman-Sidi G,Glickman MS,Bochner BH.The mechanism of action of BCG therapy for bladdercancer--a current perspective.Nat Rev Urol.2014；11:153-62.PMID:24492433)。然而，BCG治疗对乳头状肿瘤的典型完全应答率为55％-65％，并且对原位癌(CIS)为70％-75％。(Askeland EJ,Newton MR,O'Donnell MA,Luo Y.Bladder Cancer Immunotherapy:BCG and Beyond.Adv Urol.2012；2012:181987.PMID:22778725.Morales A.BCG:Athrowback from the stone age of vaccines opened the path for bladder cancerimmunotherapy.Can J Urol.2017；24:8788-8793.PMID:28646932)。因此，患有BCG无应答和复发疾病的患者以及对治疗不耐受的患者的负担促进了对于进一步提高BCG针对NMIBC的功效的需要。

CDN是产生针对TB和NMIBC的有价值的免疫应答的重要PAMP和DAMP。

细菌病原体相关分子模式(PAMP)。人类细胞利用一种被称为胞质监控程序(cytosolic surveillance program，CSP)的先天免疫监控系统来检测胞质中的核酸，包括环状二核苷酸。CSP最初被表征为病毒防御系统，现在已经表明CSP在抗细菌防御中是重要的，特别是针对细胞内细菌，诸如结核分枝杆菌、单核细胞性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌属(Salmonella)物种以及其他细菌。胞质模式识别受体(PRR)(包括STING、cGAS、DDX41和许多其他)能够与胞质CDN和核酸结合导致其活化。关键的信号传导事件是STING活化，它导致TBK1和IRF3的活化以及随后的I型干扰素表达的上调。由环状二核苷酸引起的STING活化也导致STAT6的诱导，STAT6不依赖于TBK1-IRF3途径诱导趋化因子诸如CCL2和CCL20。STING活化也被认为是通过IκB激酶(IKK)活化来活化转录因子NFκB。

人类危险相关分子模式(DAMP)。环状cGAMP(cGAS)合酶是一种识别胞质DNA的胞质PRR。环状cGAMP(cGAS)合酶在与DNA结合后，经历构象变化，这活化其核心酶活性，催化2’3’cGAMP的形成。2’3’cGAMP继而是一种活化STING-TBK1-IRF3轴(axis)的有效DAMP，导致1型干扰素表达增加，以及STAT6活化和IKK活化。

STING介导的CDN触发的免疫应答的机制。已知由肿瘤微环境中的先天免疫细胞和由肿瘤细胞自身两者产生的I型IFN介导针对几种恶性肿瘤的抗肿瘤作用，因为它们有干预癌症免疫编辑的所有阶段的能力。(Zitvogel L,Galluzzi L,Kepp O,Smyth MJ,KroemerG.Type I interferons in anticancer immunity.Nat Rev Immunol.2015；15:405-14.PMID:26027717)。STING(干扰素基因的刺激物)，是一种在通过传感器环状GMP-AMP合酶(cGAS)识别溶质DNA后对病原体的I型IFN先天免疫应答的主要调控物。cGAS催化环状GMP-AMP(cGAMP)的合成，环状GMP-AMP继而作为结合并活化STING的第二信使起作用。(Zhao GN,Jiang DS,Li H.Interferon regulatory factors:at the crossroads of immunity,metabolism,and disease.Biochim Biophys Acta.2015；1852:365-78.PMID:24807060)。因此，基于重组I型IFN、I型IFN编码载体、I型IFN表达细胞和STING激动剂的新型抗癌免疫疗法目前正被开发为新型肿瘤免疫疗法。

PAMP免疫调节剂3’-5’c-di-AMP的过表达。3’-5’c-di-AMP是STING-TBK1-IRF3轴的强诱导物。3’-5’c-di-AMP由分枝杆菌包括BCG通过编码DisA蛋白(BCG中的BCG蛋白WP_010950916.1、结核分枝杆菌蛋白Rv3586或P9WNW5.1)的disA基因产生。结核分枝杆菌(M.tb)合成并分泌c-di-AMP，c-di-AMP通过STING信号传导和cGAS活化干扰素调控因子(IRF)途径和I型IFN应答。(Ahmed D,Cassol E.Role of cellular metabolism inregulating type I interferon responses:Implications for tumour immunology andtreatment.Cancer Lett.2017；409:20-29.PMID:28888999)。c-di-AMP过表达的结核分枝杆菌菌株在小鼠模型中示出TB的减弱。作为粘膜佐剂，c-di-AMP发挥免疫刺激作用，导致树突细胞的成熟、共刺激分子的上调和促炎性细胞因子的产生，以及针对病原体的强Th1、Th17和CD8 T细胞应答。c-di-AMP过表达的BCG菌株(rBCG-disA或BCG-disA-OE)已经被构建并且令人惊讶地发现它产生了比BCG本身显著更高的IRF和IFN-β应答，表明尽管缺乏ESX-1蛋白分泌系统，细菌来源的c-di-AMP进入宿主细胞胞质。(Ahmed D,Cassol E.Role ofcellular metabolism in regulating type I interferon responses:Implicationsfor tumour immunology and treatment.Cancer Lett.2017；409:20-29.PMID:28888999)。这些发现表明，被修饰以过表达c-di-AMP的rBCG菌株可以诱导比BCG本身更佳的对膀胱肿瘤的保护性免疫。

小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中响应于过表达结核分枝杆菌disA(MT3692)的BCG的促炎性Th1细胞因子的诱导：结核分枝杆菌基因组编码从ATP或ADP合成c-di-AMP的二腺苷酸环化酶(DisA，也被称为DacA,是UniProtKB/Swiss-Prot数据库中的P9WNW5.1)。BCG蛋白WP_010950916.1(NCBI参考号)与结核分枝杆菌DisA 100％相同。过表达disA的结核分枝杆菌菌株通过释放过量的c-di-AMP来使巨噬细胞中毒，c-di-AMP是一种独特的活化STING依赖性IFN-β产生的细菌PAMP。(Ahmed D,Cassol E.Role of cellular metabolismin regulating type I interferon responses:Implications for tumour immunologyand treatment.Cancer Lett.2017；409:20-29.PMID:28888999)。为了扩大非致病性疫苗菌株的抗原库(antigenic repertoire)，用赋予卡那霉素抗性(Kan-R)的质粒转化BCGPasteur，该质粒携带与强分枝杆菌启动子P_hsp60融合的来自结核分枝杆菌的disA基因(结核分枝杆菌Rv3586或MT3692)(结核分枝杆菌和BCG的disA基因是100％相同的)。将该质粒添加到BCG-Pasteur使disA mRNA的水平增加了50倍(图1b)。与野生型结核分枝杆菌相比，密切相关的M.tb-disA-OE菌株向巨噬细胞胞质中释放多15倍的c-di-AMP(图1a)，并且因此预期BCG-disA-OE也向宿主胞质中释放显著更多的c-di-AMP。与亲本菌株相比，这些disA过表达重组体(rBCG或BCG-disA-OE)是更好的STING依赖性IFN-β诱导物。最重要地，如在2016年2月10日提交的PCT/US2016/017248中报道的，接种rBCG的豚鼠显著更好地被保护免于有毒力的结核分枝杆菌的气溶胶感染，表明相比于现有的BCG菌株提高的保护功效。

如图2中所示，在体外巨噬细胞感染模型中测试由BCG-Pasteur disA-OE引发的免疫应答。与未感染的巨噬细胞或野生型BCG感染的巨噬细胞相比，来自用BCG-PasteurdisA-OE感染的C57BL/6小鼠的BMDM示出了IFN-β、TNF-α、IL-6和IL-2的显著上调。

如图3中所示，确认了RAWBlue ISG巨噬细胞中增强的基于c-di-AMP的STING活化。与亲本对照相比，当用BCG-Pasteur disA-OE感染时，RAWBlue巨噬细胞示出了增加的IRF3水平。

如图4中所示，在BCG-Pasteur-disA-OE感染的小鼠BMDM的培养物上清液中发现分泌的促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的显著增加。这些发现表明，具有增加的抗原库的BCG-Pasteur-disA-OE表现得类似于STING激动剂，并且因此是STING依赖性I型IFN的有效诱导物。此外，在巨噬细胞中响应于BCG-Pasteur disA-OE的免疫应答倾向于Th1，Th1是一种在很大程度上造成BCG免疫疗法对NMIBC的控制的表型。

如图5中所示，BCG-disA-OE在人类膀胱癌(RT4)细胞中引发抗肿瘤免疫应答。测试BCG-Pasteur-disA-OE，以确定与WT菌株BCG-Pasteur和OncoTICE(目前的免疫治疗BCG菌株)相比，BCG-Pasteur-disA-OE是否在膀胱癌(BC)细胞中引发类似的免疫应答。用野生型(Pasteur和TICE两者)菌株和重组BCG Pasteur disA-OE菌株以1:20(RT4::BCG)攻击来源于人类NMIBC肿瘤的人类RT4 BC细胞3h，并且与未感染的细胞相比，确定差异基因表达谱。发现与对野生型菌株的应答相比，在暴露于BCG-Pasteur-disA-OE的膀胱癌细胞中关键免疫介导物诸如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)/CCL2、IFN-β和IL-1β显著增加。

如图6中所示，建立了一个实验系统来测试膀胱内BCG-disA-OE免疫疗法是否在NMIBC的MNU致癌模型中导致升高的Th1应答和抗肿瘤功效。来自上文提及的使用RT4细胞的实验的结果鼓励本发明人在体内大鼠NMIBC模型中测试BCG-Pasteur disA OE的相对治疗功效，该模型在Bivalacqua实验室中首创。(Kates M,Nirschl T,Sopko NA,Matsui H,Kochel CM,Reis LO,Netto GJ,Hoque MO,Hahn NM,McConkey DJ,Baras AS,Drake CG,Bivalacqua TJ.Intravesical BCG Induces CD4(+)T-Cell Expansion in an ImmuneCompetent Model of Bladder Cancer.Cancer Immunol Res.2017；5:594-603.PMID:28588015)。在该模型中，一种致癌的烷化剂N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)用于诱导雌性Fischer大鼠中的尿路上皮癌。

如图7中可以观察到的，BCG-disA-OE在大鼠膀胱癌模型中具有显著的免疫治疗作用。尿路上皮发育异常在MNU滴注的8周内发展，并且到第一次滴注后的第16周，所有大鼠都显示出原位癌、乳头状Ta或高等级T1尿路上皮癌，其中组织病理学和免疫表型特征与在人类尿路上皮癌中观察到的类似。使用该模型，Bivalacqua实验室示出了膀胱内BCG免疫疗法导致尿路上皮中CD4⁺T细胞群体的大量瞬时升高。(Kates M,Nirschl T,Sopko NA,MatsuiH,Kochel CM,Reis LO,Netto GJ,Hoque MO,Hahn NM,McConkey DJ,Baras AS,Drake CG,Bivalacqua TJ.Intravesical BCG Induces CD4(+)T-Cell Expansion in an ImmuneCompetent Model of Bladder Cancer.Cancer Immunol Res.2017；5:594-603.PMID:28588015)。BCG-disA-OE菌株的膀胱内滴注在MNU处理的大鼠中进行，从MNU诱导后8周当肿瘤可见时开始，每周连续施用，持续6周。根据WHO-ISUP分类，由GU病理学家对膀胱肿瘤进行分期，根据如所描述的标准计算每组的肿瘤受累百分比(Ta、T1和CIS的和)。(Kates M,Nirschl T,Sopko NA,Matsui H,Kochel CM,Reis LO,Netto GJ,Hoque MO,Hahn NM,McConkey DJ,Baras AS,Drake CG,Bivalacqua TJ.Intravesical BCG Induces CD4(+)T-Cell Expansion in an Immune Competent Model of Bladder Cancer.Cancer ImmunolRes.2017；5:594-603.PMID:28588015)。发现与来自未治疗的大鼠或BCG-Pasteur治疗的大鼠的膀胱相比，用BCG-Pasteur disA-OE治疗的大鼠中的肿瘤受累指数显著降低。

如图8中可以观察到的，BCG-disA-OE在经历免疫疗法的大鼠膀胱中诱导特征性细胞因子和趋化因子特征(characteristic cytokine and chemokine signature)。与未治疗的大鼠或BCG-Pasteur治疗的大鼠相比，来自用BCG-disA-OE治疗的大鼠的大鼠尿道膀胱示出了对IFN-α/β、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、TGF-β、iNOS、IP-10、MCP-1和MIP-1α的显著诱导。

如图9中所示，在用BCG-Pasteur-disA-OE治疗的大鼠的膀胱中发现了CCL2⁺巨噬细胞、Nos2⁺和IL-1β⁺M1巨噬细胞的浸润增加的证据，这伴随着IL-6和IFN-表达的增加。有趣地，发现增加的IP-10水平，已知这与增加的IFN-γ一起促进感染和炎症部位的强T细胞募集。

图10示出了在原代细胞、癌细胞系和在大鼠膀胱癌组织中观察到的BCG-disA-OE对比BCG-WT的细胞因子表达水平变化的总结。如可以观察到的，在这些细胞、细胞系和组织中，与BCG-WT相比，BCG-disA-OE显著上调了与Th1 T细胞和M1巨噬细胞扩增相关的细胞因子、两种1型干扰素和三种促炎性趋化因子(2倍至30倍)。相比之下，与BCG-WT相比，BCG-disA-OE通常下调了与Th2 T细胞和M2巨噬细胞扩增相关的细胞因子(1倍至10倍)。

如图11中所示，BCG免疫疗法可能经由三种免疫机制有效：(i)增加的肿瘤特异性细胞毒性CD8 T细胞的产生，(ii)细胞因子环境，该环境促进巨噬细胞介导的CD4细胞针对肿瘤抗原的活化，以及(iii)促进增强的杀肿瘤活性的巨噬细胞M1转变。本文报告的发现有力地表明，过表达c-di-AMP的BCG被膀胱肿瘤细胞和髓细胞吸收，这些细胞驻留在或被募集到肿瘤微环境，并且BCG诱导宿主免疫应答，包括STING和I型IFN应答的活化，以及促进细胞因子和趋化因子的分泌、巨噬细胞募集和凋亡机制的NF-κB信号传导的活化，所有这些都共同地降低了肿瘤进展。

如图12中所示，除了disA的过表达产生增加水平的PAMP分子c-di-AMP之外，还存在可以对BCG进行的另外的重组DNA修饰，以增强其他PAMP和DAMP分子的产生。如图12中所示，其他CDN环化酶的基因--(i)BCG_RS07340蛋白或结核分枝杆菌Rv1354c蛋白的GGDEF结构域(彼此100％相同)，(ii)霍乱弧菌DncV蛋白，其是Swiss-Prot中的Q9KVG7，是2’-5’c-GAMP合酶，以及(iii)Swiss-Prot中的人类cGAS蛋白Q8N884，其是2’-3’cGAMP合酶--可以被添加到BCG中。这些添加的CDN环化酶基因可以单独添加或组合地添加。这样的组合将代表多价CDN过表达BCG。此外，如图13中所示，BCG具有几个CDN磷酸二酯酶基因或含有磷酸二酯酶结构域的基因。使用重组技术方法去除以下这些内源磷酸二酯酶基因和基因内磷酸二酯酶结构域：(i)BCG WP_003414507基因，该基因编码BCG中与结核分枝杆菌Rv2837c(也被称为CdnP或CnpB)100％相同的CDN PDE，(ii)编码蛋白BCG_RS07340(先前的BCG_1416c)的EAL结构域的DNA，该蛋白与已知的CDN PDE结核分枝杆菌Rv1354c蛋白100％相同，以及(iii)编码BCG AHM07112的基因，该基因与已知的CDN PDE结核分枝杆菌Rv1357c同源。去除编码这些PDE的基因将用于进一步增加由本文公开的rBCG菌株产生的CDN PAMP和DAMP分子的水平。

SEQ ID NO:1

来自BCG和其他相关分枝杆菌的二腺苷酸环化酶DisA，氨基酸序列(358个氨基酸；BCG蛋白AOQ92_RS18745；NCBI参考序列：NZ_CUWL01000001.1)。相同的序列存在于其他BCG菌株中，例如作为蛋白Rv3586或MT3692存在于结核分枝杆菌中，以及作为蛋白Mb3617存在于牛分枝杆菌中。

SEQ ID NO:2

来自BCG和其他相关分枝杆菌的二腺苷酸环化酶disA，DNA序列(1077个核苷酸[358个密码子，1个终止密码子]；编码BCG基因AOQ92_RS18745；NCBI参考序列：NZ_CUWL01000001.1)。相同的序列存在于其他BCG菌株中，例如作为基因Rv3586或MT3692存在于结核分枝杆菌中，作为基因Mb3617存在于牛分枝杆菌中。

SEQ ID NO:3

质粒pSD5B-P_hsp60::disA是一种附加型复制的大肠杆菌(E.coli)-分枝杆菌穿梭质粒，从P_hsp60启动子过表达BCG disA基因，DNA序列(7742个核苷酸；将包含麻风分枝杆菌hsp65基因核苷酸13至180的一部分的启动子P_hsp60 DNA加下划线；disA编码序列核苷酸242至1318；ATG起始密码子和TAA终止密码子以粗体、加下划线示出)。

过表达disA的分枝杆菌毒力减弱。如图14中所示，当通过气溶胶途径用3.5log₁₀单位的携带pSD5B P_hsp60::disA质粒的结核分枝杆菌(M.tb-disA-OE或Mtb-OE)或野生型结核分枝杆菌(Mtb-CDC1551)感染小鼠时，动物的中值死亡时间(MTD)存在明显差异。如可以观察到的，野生型结核分枝杆菌(Mtb-CDC1551)给出150.5天的MTD，而携带pSD5B P_hsp60::disA质粒的结核分枝杆菌(M.tb-disA-OE或Mtb-OE)是一种显著较弱的病原体，给出321.5天的MTD。与BCG-WT相比，预期了BCG-disA-OE的致病性的类似降低。因此，可能的是如果BCG-disA-OE用作癌症免疫疗法，人们将预期与BCG-WT相比，血流播散速率降低、排尿困难减少、尿急减少和乏力减少。

向rBCG添加除disA以外的CDN环化酶基因

PAMP免疫调节剂3’-5’c-di-GMP通过过表达蛋白BCG_RS07340的GGDEF结构域而过 表达。3’-5’c-di-GMP是STING-TBK1-IRF3轴的强诱导物。3’-5’c-di-GMP由分枝杆菌(包括BCG)通过蛋白BCG_RS07340(先前为BCG_1416c)的GGDEF结构域和通过结核分枝杆菌Rv1354c基因产生。BCG_RS07340蛋白(与结核分枝杆菌Rv1354c蛋白100％相同)编码双功能二鸟苷酸环化酶/二鸟苷酸磷酸二酯酶。因此，作为二鸟苷酸环化酶起作用的部分是BCG中的内源CDN产生酶。全长BCG_RS07340多肽的长度为623个氨基酸，并且其结构域结构为：N-末端-GAF-GGDEF-EAL-C-末端，如图11中所示。GAF结构域(约氨基酸1-190)是影响其他结构域活性的调控结构域。GGDEF结构域(约氨基酸190-350)是催化反应2GTP→c-di-GMP+2焦磷酸的二鸟苷酸环化酶。EAL结构域(约氨基酸350-623)是催化反应c-di-GMP→2GMP的二鸟苷酸磷酸二酯酶。通过遗传上去除编码C末端EAL结构域的DNA序列，可以使用编码GGDEF结构域的DNA产生重组BCG，该重组BCG将过表达二鸟苷酸环化酶活性。这可以通过还缺失编码调控-传感器GAF结构域的DNA和/或使用编码GAF结构域的DNA中的突变来减轻其可具有的任何环化酶抑制活性来完成。这样的产生BCG_RS07340蛋白的组成性活性重组形式的技术将在重组BCG中产生高水平的c-di-GMP。

SEQ ID NO:4

来自BCG和其他相关分枝杆菌的双功能二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶BCG_RS07340，氨基酸序列(623个氨基酸；BCG蛋白BCG_RS07340；NCBI参考序列：NC_008769.1；蛋白质ID WP 003898837.1；旧基因座标签BCG_1416c)。相同的序列存在于其他BCG菌株中，例如作为蛋白Rv1354c或MT1397存在于结核分枝杆菌中，以及作为蛋白Mb1389c存在于牛分枝杆菌中。EAL结构域是氨基酸354至623，并且被加下划线。

SEQ ID NO:5

来自BCG和其他相关分枝杆菌的双功能二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶BCG_RS07340，DNA序列(1872个核苷酸[623个密码子+1个终止密码子]；编码BCG蛋白BCG_RS07340；NCBI参考序列：NC_008769.1；蛋白质ID WP 003898837.1；旧基因座标签BCG_1416c；来自NC_008769.1:c1548390-1546519牛分枝杆菌BCG Pasteur 1173P2的DNA)。相同的序列存在于其他BCG菌株中，例如作为蛋白Rv1354c或MT1397存在于结核分枝杆菌中，以及作为蛋白Mb1389c存在于牛分枝杆菌中。EAL结构域由核苷酸1060至1872编码，并且被加下划线。

SEQ ID NO:6

来自BCG和其他相关分枝杆菌的修饰的双功能二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶，其EAL结构域缺失，使得其充当单功能二鸟苷酸环化酶，氨基酸序列(353个氨基酸；BCG蛋白BCG_RS07340的片段；NCBI参考序列：NC_008769.1；蛋白质ID WP 003898837.1；旧基因座标签BCG_1416c)。相同的序列片段存在于其他BCG菌株中，例如作为蛋白Rv1354c或MT1397存在于结核分枝杆菌中，以及作为蛋白Mb1389c存在于牛分枝杆菌中。

SEQ ID NO:7

来自BCG和其他相关分枝杆菌的修饰的双功能二鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶，其中编码其EAL结构域的序列缺失，使得其编码单功能二鸟苷酸环化酶，DNA序列(1059个核苷酸[353个密码子+0个终止密码子]；编码BCG蛋白BCG_RS07340的片段；NCBI参考序列：NC_008769.1；蛋白质ID WP 003898837.1；旧基因座标签BCG_1416c；来自NC_008769.1:c1548390-1546519牛分枝杆菌BCG Pasteur 1173P2的DNA)。相同的序列存在于其他BCG菌株中，例如作为基因Rv1354c或MT1397的片段存在于结核分枝杆菌中，以及作为基因Mb1389c的片段存在于牛分枝杆菌中。

PAMP免疫调节剂2’-5’c-GAMP合酶的过表达：Q9KVG7(Swiss-Prot)。2’-5’c-GAMP是STING-TBK1-IRF3轴的强诱导物。由dncV基因编码的霍乱弧菌Q9KVG7蛋白(436个氨基酸)是一种已知的2’-5’c-GAMP合酶。可以产生对于BCG密码子优化的重组dncV基因。密码子优化的结构基因可以通过融合到强启动子(诸如Phsp60)或条件性活性强启动子诸如PTET-off而在BCG中过表达。这样的产生Q9KVG7蛋白的组成性活性重组形式的技术将在重组BCG中产生高水平的2’-5’c-GAMP。

SEQ ID No:8

来自霍乱弧菌的环状GMP-AMP合酶，DncV，氨基酸序列(436个氨基酸；UniProtKB/Swiss-Prot蛋白ID Q9KVG7.1)。

SEQ ID No:9

来自霍乱弧菌的环状GMP-AMP合酶，DncV，DNA序列(1311个核苷酸[436个密码子+1个终止密码子]；编码UniProtKB/Swiss-Prot蛋白质ID Q9KVG7.1；NCBI参考序列：NC_002505.1:霍乱弧菌O1 biovar El Tor str.N16961染色体I，完整序列，以及核苷酸180419-181729)

DAMP免疫调节剂2’-3’cGAMP合酶的过表达：Q8N884(Swiss-Prot)。2’-3’cGAMP是STING-TBK1-IRF3轴的强诱导物。cGAS蛋白由人类cGAS基因产生，以产生一种522个氨基酸的多肽，该多肽感知胞质DNA并且作为2’-3’cGAMP合酶起作用。当cGAS与DNA结合时，cGAS的合酶或环化酶结构域变得被活化。可以产生仅含有环化酶结构域并且因此是组成性活性的重组cGAS基因。该重组基因还可以针对BCG被密码子优化。密码子优化的结构基因可以通过融合到强启动子(诸如Phsp60)或条件性活性强启动子诸如PTET-off而在BCG中过表达。这样的产生cGAS蛋白的组成性活性重组形式的技术将在重组BCG中产生高水平的2’-3’c-GAMP。

SEQ ID No:10

来自智人的环状2’3’-GMP-AMP合酶cGAS，氨基酸序列(522个氨基酸，UniProtKB/Swiss-Prot蛋白质ID Q8N884.2)。

SEQ ID No:11

来自智人的环状2’3’-GMP-AMP合酶cGAS，用核苷酸T代替U的mRNA的DNA序列(1802个核苷酸；编码UniProtKB/Swiss-Prot蛋白质ID Q8N884.2；NCBI参考序列：NM_138441.2。编码序列为1569个核苷酸[522个密码子，1个终止密码子]，起始密码子ATG[粗体，加下划线]在核苷酸140；终止密码子TGA(粗体，加下划线)在核苷酸1706)。

SEQ ID NO:12

来自智人的环状2'3'-GMP-AMP合酶cGAS，具有分枝杆菌密码子优化，DNA序列。(1569个核苷酸[522个密码子，1个终止密码子]；编码UniProtKB/Swiss-Prot蛋白质IDQ8N884.2)。

SEQ ID NO:13

质粒pMH94H-P_hsp60::disA::hcGASco::mCherry是一种大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒，从P_hsp60启动子过表达BCG disA基因、人类cGAS基因(具有分枝杆菌密码子优化)和mCherry，DNA序列。当被引入BCG、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或高度相关的菌株中时，该质粒以单拷贝整合到分枝杆菌染色体中(10842个核苷酸；将包含麻风分枝杆菌hsp65基因核苷酸901至1068的一部分的启动子P_hsp60 DNA加下划线；disA编码序列为核苷酸1069-2145；具有分枝杆菌密码子优化序列的人类cGAS是核苷酸2158至3726；ATG起始密码子和TAA或TGA终止密码子以粗体、加下划线示出)。

敲除内源BCG磷酸二酯酶基因和编码磷酸二酯酶结构域的基因内区段，以增加CDN PAMP和DAMP水平

通过敲除内源BCG磷酸二酯酶WP_003414507过表达CDN。

BCG AHM08589.1蛋白在BCG中编码316个氨基酸的内源双功能c-di-AMP和cGAMP磷酸二酯酶，该酶与结核分枝杆菌Rv2837c在C末端上的316个氨基酸(也被称为CdnP、CnpB、3’-至-5’寡核糖核酸酶A、双功能寡核糖核酸酶或PAP磷酸酶NrnA)100％相同。已知结核分枝杆菌Rv2837c蛋白水解3’-5’c-di-AMP(细菌PAMP分子)和2’-3’cGAMP(宿主DAMP分子)两者。由于BCG蛋白在C末端上的315个氨基酸100％相同，因此BCG AHM08589.1蛋白的敲除(基因置换)将导致重组BCG中CDN(3’-5’c-di-AMP和2’-3’cGAMP)水平的增加。

SEQ ID No:14

来自BCG的双功能c-di-AMP和cGAMP磷酸二酯酶CdnP(也被称为CnpB、3′-至-5′寡核糖核酸酶A、双功能寡核糖核酸酶、PAP磷酸酶NrnA)，氨基酸序列(316个氨基酸；BCG蛋白AHM08589.1；NCBI参考DNA序列：CP003494.1，来自BCG菌株ATCC 35743；NCBI参考蛋白质标识符WP_003414507)。类似的序列作为蛋白Rv2837c或MT2903存在于结核分枝杆菌中，以及作为蛋白Mb2862c存在于牛分枝杆菌中。

SEQ ID No:15

来自BCG的双功能c-di-AMP和cGAMP磷酸二酯酶基因cdnP(也被称为cnpB或3′-至-5′寡核糖核酸酶A、双功能寡核糖核酸酶或PAP磷酸酶NrnA的基因)，DNA序列(951个核苷酸[316个密码子和1个终止密码子]；编码BCG蛋白AHM08589.1；NCBI参考序列：CP003494.1，来自BCG菌株ATCC 35743)。类似的序列存在于结核分枝杆菌中，编码蛋白Rv2837c或MT2903，以及存在于牛分枝杆菌中，编码蛋白Mb2862c。

SEQ ID No:16

来自结核分枝杆菌的双功能c-di-AMP和cGAMP磷酸二酯酶CdnP(也被称为CnpB、Rv2837c、或MT2903、3'-至-5'寡核糖核酸酶A、双功能寡核糖核酸酶、PAP磷酸酶NrnA)，氨基酸序列(336个氨基酸；结核分枝杆菌蛋白WP_003905944.1；NCBI/GenBank参考序列：AL123456，来自结核分枝杆菌菌株H37Rv)。与BCG蛋白(SEQ ID No:14)相比，结核分枝杆菌蛋白在其N-末端具有20个另外的氨基酸，将另外的氨基酸加下划线并加粗。

通过敲除内源BCG磷酸二酯酶结构域过表达CDN：蛋白BCG_RS07340(先前为BCG_ 1416c)的EAL结构域。BCG_RS07340蛋白(SEQ ID No:4)由SEQ ID No:5中所示的DNA序列编码。BCG_RS07340蛋白与结核分枝杆菌Rv1354c蛋白100％相同，并且是BCG中的内源CDNPDE。全长多肽的长度为623个氨基酸，并且它编码双功能二鸟苷酸环化酶/二鸟苷酸磷酸二酯酶。结构域结构是：N-末端-GAF-GGDEF-EAL-C-末端，如图11中所示。GAF结构域(约氨基酸1-190)是影响其他结构域活性的调控结构域。GGDEF结构域(约氨基酸190-350)是催化反应2GTP→c-di-GMP+2焦磷酸盐的二鸟苷酸环化酶。EAL结构域(氨基酸354至623，在SEQ IDNo:4中突出显示)是催化反应c-di-GMP→2GMP的二鸟苷酸磷酸二酯酶。由于该蛋白质的EAL结构域已知裂解3’-5’c-di-GMPP，因此敲除该内源环状二核苷酸磷酸二酯酶结构域将增加由BCG产生的c-di-GMP的水平。EAL结构域的靶向敲除可以通过用仅编码氨基酸1-353(GAF-GGDEF结构域)的基因对全长WT BCG_RS07340基因进行基因置换来完成，即截短基因的编码序列以去除编码氨基酸354-623的序列(如SEQ ID No:5中加下划线的DNA序列所示)并且纳入合适的终止密码子和转录终止序列。缺乏BCG_RS07340的EAL结构域的重组BCG将导致升高的CDN PAMP c-di-GMP水平。

通过敲除内源BCG磷酸二酯酶过表达CDN：BCG AHM07112。 BCG_AHM07112蛋白是BCG中的内源二鸟苷酸磷酸二酯酶(与307个氨基酸的结核分枝杆菌Rv1357c蛋白同源)。一些BCG菌株完全缺乏BCG_AHM07112，而其他BCG菌株诸如BCG Tice携带BCG_AHM07112。在具有该多肽的BCG菌株中，该蛋白质可以是288个氨基酸的长度(诸如在BCG ATCC 35743中)或307个氨基酸的长度(诸如在BCG Pasteur 1173P2中)。来自BCG ATCC 35743的BCG_AHM07112蛋白是288个氨基酸的长度，并且在其C末端287个氨基酸上与结核分枝杆菌Rv1357c蛋白100％相同。BCG_AHM07112的结构域结构是单个EAL结构域的结构(图11)。由于结核分枝杆菌Rv1357c蛋白已知裂解3'-5'c-di-GMP，因此非常可能的是BCG蛋白进行相同的反应。敲除BCG中的该内源环状二核苷酸磷酸二酯酶预期增加由BCG产生的c-di-GMP的水平。EAL结构域的靶向敲除可以通过全长WT BCG_AHM07112基因的基因置换和随后产生无标记的缺失来完成。

SEQ ID No:17

来自BCG和其他相关分枝杆菌的二鸟苷酸磷酸二酯酶AHM07112.1，氨基酸序列(288个氨基酸；GenBank参考序列：CP003494.1；来自BCG菌株ATCC 35743)。AHM07112.1与结核分枝杆菌蛋白Rv1357c或MT1400和牛分枝杆菌如蛋白Mb1392c的二鸟苷酸磷酸二酯酶的C末端287个氨基酸100％相同。

SEQ ID No:18

来自BCG和其他相关分枝杆菌的二鸟苷酸磷酸二酯酶AHM07112.1，DNA序列(867个核苷酸[288个密码子，1个终止密码子]；GenBank参考序列：CP003494.1；来自BCG菌株ATCC35743)。AHM07112.1与结核分枝杆菌蛋白Rv1357c或MT1400和牛分枝杆菌如蛋白Mb1392c的二鸟苷酸磷酸二酯酶的C末端287个氨基酸100％相同。

SEQ ID No:19

来自结核分枝杆菌和BCG Pasteur 1173P2的二鸟苷酸磷酸二酯酶Rv1357c或MT1400，氨基酸序列(307个氨基酸，NCBI/GenBank参考序列：AL123456；来自结核分枝杆菌菌株H37Rv)。19个氨基酸的N-末端延伸存在于结核分枝杆菌和BCG Pasteur菌株1173P2中，但不存在于其他几种BCG菌株中。将19个氨基酸的N-末端延伸加下划线且加粗。结核分枝杆菌Rv1357c的C-末端287个氨基酸与BCG二鸟苷酸磷酸二酯酶AHM07112.1 100％相同。

本申请中引用的序列总结在下表1中。

表1

在一些实施方案中，本发明涉及表达盒或表达载体，该表达盒或表达载体包含编码Rv1354c蛋白或其功能部分的核酸序列；编码环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的核酸序列；编码环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的核酸序列；或它们的组合。在一些实施方案中，表达载体或表达盒还包含编码作为二腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分的核酸序列。在一些实施方案中，编码Rv1354c蛋白的核酸序列不包含磷酸二酯酶基因或磷酸二酯酶结构域。在一些实施方案中，表达载体或表达盒不包含磷酸二酯酶基因或磷酸二酯酶结构域。

已经描述了用于产生表达载体和表达盒、转化分枝杆菌和分离分枝杆菌的方法。在一些实施方案中，本发明的表达载体或表达盒包含可操作地连接至本发明的核酸的一个或更多个调控序列，例如启动子和/或增强子元件，所述调控序列控制或影响核酸的转录。在一些实施方案中，本发明的表达载体或表达盒包含可操作地连接至本发明的核酸的一个或更多个序列，所述序列指导转录的终止、转录后裂解和/或多腺苷酸化。在一些实施方案中，本发明的表达载体或表达盒包含可操作地连接至本发明的核酸的可变长度的间插序列和/或可选择的标志物基因。

在一些实施方案中，本发明涉及包含本文描述的本发明的表达载体或表达盒的分枝杆菌菌株。在一些实施方案中，分枝杆菌菌株是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或其组合。在一些实施方案中，分枝杆菌菌株是BCG。在一些实施方案中，菌株包含SEQ ID NO:13的质粒。

在一些实施方案中，本发明涉及表达或过表达二腺苷酸环化酶和/或表达或过表达一种或更多种其他环化酶基因或结构域(例如，本文描述的那些)的分枝杆菌菌株。在一些实施方案中，表达或过表达导致一种或更多种STING激动剂(例如，c-di-AMP、c-di-GMP、2'-3'cGAMP和/或3'-3'cGAMP)的释放。在一些实施方案中，本发明涉及表达或过表达二腺苷酸环化酶和/或不表达使STING激动剂水解的磷酸二酯酶(PDE)的分枝杆菌菌株(例如，含有使STING激动剂水解的PDE基因的缺失)。参见，例如图12。在一些实施方案中，分枝杆菌菌株是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或其组合。在一些实施方案中，分枝杆菌菌株是BCG。

BCG-disA-OE在大鼠MNU膀胱癌模型中的统计学上显著的抗肿瘤作用

大鼠MNU膀胱癌模型是一种经验证的膀胱癌模型，其中膀胱内施用BCG可以显示出治疗性(图6和Kates等人.PMID 28588015)。本发明人扩展了在图7中示出的他们先前关于BCG-disA-OE对比BCG-WT的治疗效果的发现。本发明人现在已经进行了两次16周大鼠MNU模型。图7基于实验1，并且示出了BCG-disA-OE相比BCG-WT显示出向着更好结果的趋势。在进行实验2并且将其数据与实验1组合后，本发明人现在示出了BCG-disA-OE在统计学上显著优于无治疗(p＝0.048)，而BCG-WT未在统计学上显著优于无治疗(数据在图17中示出)。

通过BCG-disA-OE在鼠同基因膀胱癌肿瘤模型中减少肿瘤抑制性Treg细胞。

在MNU大鼠膀胱癌模型中，在16周实验结束时膀胱组织的量不足以进行流式细胞术。为了研究由BCG-disA-OE引发的细胞群体变化，本发明人使用BBN975细胞开发了鼠同基因膀胱癌肿瘤模型。该模型允许在小鼠肋腹上发展大肿瘤(直径>1.5cm)。小鼠通过肿瘤内注射用BCG-disA-OE和BCG-WT进行治疗。如图18中所示，使用BCG-disA-OE导致降低的肿瘤相关的CD4+Treg细胞、肿瘤相关的CD8+Treg细胞和脾CD4+Treg细胞的水平。

BCG-disA-OE 从细胞内区室(intracellular compartment)递送持续的STING激 动剂。

BCG在膀胱中的持久性。

Bowyer等人(The persistence of bacilli Calmette-Guerin in the bladderafter intravesical treatment for bladder cancer.Brit J Urol.1995；75:188-192.PMID 7850324)评估了1986年-1992年接受膀胱内BCG的125名膀胱癌患者。要求患者每月提供尿液样品，然后将尿液样品送去进行分枝杆菌培养。90名患者存活并且遵守每月提供尿液样品。4/90的患者(4.4％)在其尿液中具有持续的BCG，一名患者持续长达16.5个月。第五名患者在完成膀胱内BCG治疗后7周需要进行膀胱切除术，并且通过显微术发现膀胱中具有抗酸杆菌的显微镜证据。

Durek等人.(The fate of bacillus Calmette-Guerin after intravesicalinstillation.J Urol.2001；165:1765-1768.PMID 11342972)研究了49名患者，进行膀胱内BCG后的连续尿液培养。在滴注后2小时后在96.4％的样本中检测到尿液中的BCG，并且在滴注后24小时后在67.9％的样本中检测到尿液中的BCG。阳性样本的数量减少，并且在紧接着下一次滴注前第7天为27.1％(图44)。研究者还通过PCR评估了在第6次滴注(每月给予滴注)后1周内的膀胱活组织检查的分枝杆菌DNA。在44个膀胱活组织检查中有14个(31.8％)发现了分枝杆菌核糖体DNA。此外，在4.2％和37.5％之间的研究的活组织检查中，分枝杆菌DNA的阳性PCR在长达24个月内是明显的。

已知BCG在膀胱组织中持续存在的事实代表了BCG-disA-OE策略用于在癌症中递送STING激动剂的重要优势。虽然许多技术集中于产生小分子STING激动剂，但是这样的剂具有相对短的暴露时间。相比之下，作为细胞内微生物并且如Bowyer和Durek的研究所证明的，BCG在细胞和组织中持续数周。BCG-disA-OE在组织中的持久性提供了STING激动剂在肿瘤微环境中的持续的长期递送。

在两个单独的小鼠模型中，BCG-disA-OE比BCG-WT更安全

在人类中，膀胱内BCG治疗与受治疗的患者的排尿困难、疲劳和乏力相关。另外的更严重的不良作用是BCG的持续性膀胱炎和播散性BCG病(BCGosis)。BCG的患者安全性在O’Donnell等人中被广泛地综述(截至2019年)。估计在膀胱内滴注后BCG向血流中播散的发病率为1/15,000名患者。

为了测试BCG-disA-OE与BCG-WT相比的安全性，本发明人使用了两种BCG感染的小鼠模型，其中BCG菌株被雾化吸入免疫活性BABL/c小鼠或免疫抑制的SCID小鼠的肺中。如图19中所示，BCG-disA-OE与BCG-WT相比不太能够在免疫活性小鼠肺中增殖，并且在免疫抑制的小鼠中，BCG-disA-OE在死亡时间测定中不太致命。

已经示出BCG引发训练免疫，所述训练免疫与BCG在实体瘤和液体瘤以及糖尿病中 的治疗益处相关。过表达STING激动剂的BCG菌株比BCG-WT引发更强的训练免疫变化

训练免疫。训练免疫是指一种抗原刺激物引发更强的针对第二种不同的抗原的免疫应答的能力。训练免疫是不依赖抗原的、基于异源CD4和CD8记忆活化的、细胞因子介导的，并且与表观遗传和代谢变化相关。BCG是一种有效工具，作为第一种抗原刺激物引发对后续的抗原刺激(诸如肿瘤、病毒感染或药物耐受性细菌感染)的训练免疫(Netea等人.Trained immunity:a program of innate immune memory in health anddisease.Science 2016.PMID 27102489；和Arts等人.BCG vaccination protectsagainst experimental viral infection in humans through the induction ofcytokines associated with trained immunity.Cell Host Microbe 2018.PMID29324233)。

用于实体瘤和液体瘤的BCG。BCG作为用于人类中的实体瘤和液体瘤两者的免疫疗法具有悠久的治疗益处历史(Hersh等人.BCG as adjuvant immunotherapy forneoplasia.Annu Rev Med 1977.PMID 324372)。BCG已经全身性和肿瘤内用于恶性肿瘤，恶性肿瘤包括黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和急性淋巴母细胞白血病(ALL)。最近已经存在BCG和检查点抑制剂一起用于各形式的膀胱癌的试验。

用于糖尿病的BCG。最近已经示出BCG疫苗接种对多种形式的糖尿病(包括1型糖尿病)的血糖控制具有治疗益处(Stienstra和Netea.Firing up glycolysis:BCGvaccination effects on Type 1diabetes mellitus.Trends Endoc Metab 2018.PMID:30327169)。该作用被认为由BCG的训练免疫作用介导，已经示出BCG的训练免疫作用导致表观遗传修饰，这促进促炎性细胞因子表达以及代谢酶诸如用于糖酵解的那些代谢酶的表达。

BCG-disA-OE和训练免疫。为了研究过表达STING激动剂的BCG菌株刺激训练免疫的能力，本发明人测试了BCG-WT对比BCG-disA-OE在六天前暴露于BCG菌株后的静息的人类单细胞中引发第二种抗原刺激的增强。第一种抗原是第0天的BCG菌株，并且在静息6天后，第二种抗原是不相关的TLR-1/2抗原PAM3CSK4。如图20中可以观察到的，在接受第二种刺激物后，测试的免疫应答(IL-1β的分泌)被BCG-WT和BCG-disA-OE两者增强，但是被BCG-disA-OE刺激的程度在统计学上显著大于没有第一种BCG刺激物或BCG-WT作为第一种刺激物的刺激程度。这揭示了过表达STING的BCG菌株诸如BCG-disA-OE是比BCG-WT更有效的训练免疫刺激物。

在相关的实验中，本发明人用人类单核细胞进行了相同的BCG-第一次刺激/6天静息/用PAM3CSK4的TLR-1,2第二次抗原刺激的实验。在实验结束时，收集细胞DNA并且使用针对H3K4组蛋白甲基化标志的抗体进行染色质免疫沉淀(ChIP)。H3K4标志是一种已知的转录活化标志。在对免疫沉淀的DNA的IL-6启动子区进行定量PCR扩增后，结果示出了BCG-Pasteur-disA-OE和BCG-Tice-disA-OE比其各自BCG-WT菌株统计学上显著更有效地引发IL-6启动子(IL-6是一种促炎性细胞因子)中的H3K4标志。这些结果示出，过表达STING的BCG菌株诸如BCG-disA-OE是比BCG-WT更有效的与训练免疫相关的表观遗传变化的刺激物。

BCG-Tice-disA-OE表达比BCG-WT高得多水平的disA基因

如图23中可以观察到的，使用2^-ΔΔCT比较方法，BCG-Tice-disA-OE克隆2(其被选择用于种子批制备和储存)的相对表达为300:1。这指示通过在多拷贝质粒上并且由pSD5-hsp65-MT3692质粒中的麻风分枝杆菌hsp65启动子驱动，disA被强有力地过表达。该强有力的过表达导致高得多的STING激动剂c-di-AMP释放水平。

STING激动剂过表达BCG菌株诸如BCG-disA-OE在多于一个模型系统中引发信号传 导途径和细胞因子分泌谱的促炎性变化。

本发明人在多于一个模型系统中测试了与BCG-WT相比的过表达STING激动剂的菌株，诸如BCG-disA-OE，以评估其引发促炎性细胞因子变化的相对能力。在其大多数测试中，BCG-disA-OE在统计学上显著优于BCG-WT。并且当比较在统计学上不显著时，BCG-disA-OE给出了两种应答中更强的一种。

图25还示出了，BCG-disA-OE和BCG-WT两者中1型IFN分泌的升高是STING依赖性的。

总之，BCG-disA-OE是比BCG-WT更有效的促炎性细胞因子表达和促炎途径诱导的刺激物。

下表总结了数据：

一种产生过表达STING激动剂生物合成基因的无抗生素基因盒的重组BCG的方法。

disA过表达质粒pSD5-hsp65-MT3692携带赋予对抗生素卡那霉素的抗性的Kan抗性基因盒。本发明人公开了一种产生过表达STING激动剂生物合成基因的无抗生素基因盒的重组BCG的方法。

分枝杆菌遗传操纵子panCD编码生物合成基因panC(泛酸-β-丙氨酸连接酶基因)和panD(天冬氨酸1-脱羧酶基因)。基因产物PanC和PanD是也被称为维生素B₅(一种B族维生素)的泛酸的生物合成必需的。泛酸是一种水溶性维生素，是分枝杆菌诸如BCG的必需营养素。动物需要泛酸以合成辅酶A (CoA)以及合成和代谢蛋白质、碳水化合物和脂肪。阴离子被称为泛酸盐。

已经示出分枝杆菌中panCD的遗传缺失产生突变体菌株，所述突变体菌株仅可以在存在添加的泛酸盐的情况下生长。因此，所述突变体菌株是泛酸盐的营养缺陷型。结核分枝杆菌的ΔpanCD突变体已经示出在动物感染中高度减毒，被迅速清除，因为其不能在其不可获得泛酸盐的哺乳动物组织中生长。

本发明人公开了一种用于产生BCG的无标志(无抗生素基因盒)的ΔpanCD缺失突变体的详细方法。该突变体将仅能够在泛酸盐存在的情况下生长，并且不预期在感染期间存活，或者不能作为STING激动剂表达的有效递送载体。

本发明人公开了一种用于产生穿梭质粒的详细方法，该穿梭质粒携带分枝杆菌panCD基因以及用于生物合成STING激动剂的过表达构建体(诸如Phsp65::disA构建体，其过表达disA基因并且释放过量的STING激动剂c-di-AMP)。穿梭质粒能够在大肠杆菌或分枝杆菌中复制。它携带抗生素盒，抗生素盒可以通过用一种罕见切割限制性酶来裂解并再连接来方便地移除。可选择地，穿梭质粒可以通过以下产生：PCR扩增不含抗生素抗性盒的质粒的主链在末端处产生限制性位点，并连接到在其末端具有相同的独特限制性位点的由扩增的panCD操纵子组成的PCR产物中。以任一种方式，可以将无抗生素抗性基因的穿梭质粒(连接产物)电穿孔到BCG或大肠杆菌营养缺陷型中，并且在无泛酸盐的琼脂板上选择。

在本公开内容的最后的表现形式中，本发明人示出了一种将携带分枝杆菌panCD基因的无抗生素盒的质粒以及用于生物合成STING激动剂的过表达构建体(诸如Phsp65::disA构建体)引入无标志的BCGΔpanCD突变体中的方法。最终结果是不携带抗生素抗性基因且强有力地过表达一种或多于一种STING激动剂生物合成基因的BCG菌株。在哺乳动物宿主或人类中，这样的BCG菌株会在强选择性压力下保留质粒，因为它需要来自质粒的panCD补偿。

在本公开内容的另一种表现形式中，panCD盒和用于生物合成STING激动剂的构建体(诸如Phsp65::disA构建体)可以被引入染色体整合载体诸如pMH94中。使用类似的方法，抗生素盒可以从pMH94中消除。将该染色体整合质粒引入无标志的BCGΔpanCD突变体也会产生不携带抗生素抗性基因且强有力地过表达一种或多于一种STING激动剂生物合成基因的BCG菌株。该策略的缺点是，过表达构建体在细菌染色体上为单拷贝，而不是在质粒上为多拷贝，并且这可能导致较低水平的STING激动剂释放。

BCG-Tice(ATCC 35743)是一种天然泛酸盐营养缺陷型。

本发明人公开了牛分枝杆菌BCG Tice菌株(ATCC 35743)是一种天然泛酸盐营养缺陷型。该菌株在其panC基因中在碱基对739-743处携带5bp的DNA插入。该插入突变改变导致在PanC的第246个氨基酸后的移码突变(野生型PanC的长度是309个氨基酸)。由于5bp插入突变，牛分枝杆菌BCG Tice菌株(ATCC 35743)中的突变体PanC多肽在其N-末端包含野生型PanC序列的246个氨基酸，随后在其C-末端包含478个氨基酸的无义多肽。该突变体PanC多肽非常不可能保留任何功能泛酸-β-丙氨酸连接酶活性(PanC的正常酶功能)。此外，BCGTice(ATCC 35743)中的PanD多肽非常不可能被翻译，因为panC基因的终止密码子(其与野生型序列中panD翻译起始的ATG重叠)不符合读框(out of frame)。在野生型panCD操纵子中，PanC翻译的核糖体终止与PanD翻译的核糖体起始相结合。由于紧接在panD起始密码子的上游不存在核糖体终止，因此panD基因翻译的核糖体起始非常不可能发生。

本发明人公开了该天然营养缺陷型使得能够更快速地构建无抗生素基因盒的重组BCG，该重组BCG过表达STING激动剂生物合成基因。

本发明人公开了一种用于将携带分枝杆菌panCD基因的无抗生素盒的质粒以及用于生物合成STING激动剂的过表达构建体(诸如Phsp65::disA构建体)直接引入BCG-Tice(ATCC 35743)中的方法。

请注意，pSD5-hsp60-MT3692与pSD5-hsp65-MT3692相同。本发明人先前提及了这种与pSD5-hsp60-MT3692相同的质粒。然而，该菌株中的实际启动子是麻风分枝杆菌的hsp65基因的启动子。因此，本发明人可以将质粒pSD-hsp60-MT3692称为pSD5-hsp65-MT3692。

在一些实施方案中，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含本文描述的本发明的表达载体、表达盒或菌株以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防癌症的方法和/或组合物，该方法和/或组合物包括向受试者施用本文描述的表达载体、表达盒、菌株或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌(例如，非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC))、乳腺癌或实体瘤。本公开内容的另外的实施方案考虑用于治疗和/或预防膀胱癌的方法和/或组合物，其中1型干扰素(IFN)应答的调节直接或间接相关。在某些实施方案中，患有膀胱癌诸如NMIBC的个体用1型干扰素应答的调节剂治疗，并且在具体实施方案中，患有膀胱癌的个体被提供1型干扰素表达的调节剂，诸如其表达诱导物。

在某些实施方案中，1型干扰素表达诱导物增加1型干扰素表达的水平可以是任何水平，只要它提供膀胱癌包括非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)的至少一种症状的改善。在至少一些情况下，与标准物中的表达水平相比，1型干扰素的表达水平可以增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、1000倍或更多倍。个体可以使用本领域的标准方法，诸如例如RNA测定(northern测定)或定量PCR，来监测1型干扰素的表达水平。

已知患有膀胱癌、怀疑患有膀胱癌或处于患有膀胱癌风险的个体可以被提供有效量的1型干扰素表达诱导物，包括含有本发明的表达载体的本发明的BCG菌株。表达载体表达RV1354c蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分；作为腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分；或它们的组合。优选的是将包含本发明的表达载体的本发明的BCG菌株施用至受试者的膀胱中，并且所表达的一种或多于一种蛋白质增强膀胱中的1型干扰素表达。例如，处于膀胱癌风险的那些个体可以是具有一种或更多种遗传因素的个体，可以是高龄的个体，和/或可以具有家族史。

在本公开内容的特定实施方案中，除了本发明的一种或更多种1型干扰素诱导物之外，个体被给予用于膀胱癌疗法的剂。这样的另外的疗法可以包括膀胱内化疗，诸如例如丝裂霉素C、环磷酰胺或其组合。当联合疗法与一种或更多种1型干扰素诱导物(诸如表达以下蛋白中的一种或更多种的BCG菌株：RV1354c蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分；作为腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分)一起使用时，可以在1型干扰素诱导物之前、与1型干扰素诱导物同时和/或在1型干扰素诱导物之后给予另外的疗法。

在一些实施方案中，与非重组BCG相比，本文描述的本发明的表达载体、表达盒、菌株、药物组合物和/或方法具有增加的安全性、增加的耐受性(例如，减少的排尿困难、尿急或乏力)和/或降低的引起血流感染或播散性血流感染的可能性。

在一些实施方案中，本发明涉及一种治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文描述的本发明的表达载体、表达盒、菌株和/或药物组合物，其中与非重组BCG相比，施用导致增加的安全性谱、增加的耐受性(例如，减少排尿困难、尿急或乏力)，和/或降低的血流感染或播散性血流感染的可能性。在一些实施方案中，癌症是例如膀胱癌(例如，非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC))、乳腺癌或实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是例如肉瘤、癌或淋巴瘤。

在一些实施方案中，本发明涉及一种与非重组BCG相比增加安全性、增加耐受性(例如，减少排尿困难、尿急或乏力)和/或降低引起血流感染或播散性血流感染的可能性的方法，该方法包括向受试者施用本文描述的本发明的表达载体、表达盒、菌株和/或药物组合物。

药物制剂

本发明的药物组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体中的有效量的一种或更多种1型干扰素表达诱导物，诸如表达以下蛋白中的一种或更多种的BCG菌株：RV1354c蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分；作为腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分。措辞“药学上可接受的或药理学上可接受的”是指当视情况施用至动物诸如例如人类时不产生不良反应、过敏反应或其他异常反应(untoward reaction)的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含至少一种1型干扰素表达诱导物或另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的，如由Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第21版.Lippincott Williams and Wilkins,2005例示的，该文献通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人类)施用，将理解制剂应满足如FDA生物标准品办公室(FDAOffice of Biological Standards)要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、这样的类似物质及其组合，如将对本领域普通技术人员已知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，该文献通过引用并入本文)。除非达到任何常规的载体与活性成分不相容的程度，否则预期其在药物组合物中的使用。

1型干扰素表达诱导物(诸如表达以下蛋白中的一种或更多种的BCG菌株：RV1354c蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分；作为腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分)可以包含不同类型的载体，取决于它是以固体、液体还是气雾剂(aerosol)形式施用，以及它是否需要在这样的施用途径(如注射)中是无菌的。在一些实施方案中，本发明(例如，表达载体、菌株或药物组合物)可以静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、膀胱内(例如，诸如通过注射或通过膀胱内滴注直接施用至膀胱中)、肿瘤内、局部、肌肉内、皮下、粘膜、口服、局部(topically)、局部(locally)、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注，经由导管、经由灌洗以乳油、以液体组合物(例如，脂质体)直接局部灌注浸浴(localized perfusion bathing)靶细胞，或者通过如本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合来施用(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.Mack Printing Company,1990,和Francica等人.TNFαand radio-resistantstromal cells are essential for therapeutic efficacy of cyclic dinucleotideSTING agonists in non-immunogenic tumors.Cancer Immunol Res.2018年2月22日.PMID:29472271，该文献通过引入并入本文)。

药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基基团形成的盐，或与无机酸诸如例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。与游离羧基基团形成的盐还可以来源于无机碱，诸如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物；或有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。在配制后，溶液会以与剂量制剂相容的方式且以诸如治疗有效的量被施用。制剂易于以多种剂型施用，诸如被配制成用于肠胃外施用，诸如可注射溶液或用于递送至肺的气雾剂，或者被配制成用于消化道施用，诸如药物释放胶囊等。

此外，根据本公开内容，适于施用的本发明的组合物在有或没有惰性稀释剂的药学上可接受的载体中提供。载体应是可吸收的，并且包括液体、半固体(即糊剂)或固体载体。除非达到任何常规介质、剂、稀释剂或载体对接受者或对其中所包含的组合物的治疗效果有害的程度，否则将其用于在实施本发明的方法中使用的可施用组合物中是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等或其组合。组合物还可以包含多种抗氧化剂以延缓一种或更多种组分的氧化。此外，可以通过防腐剂带来防止微生物的作用，防腐剂诸如多种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

根据本发明，组合物以任何方便和可实践的方式与载体组合，即通过溶液、悬浮液、乳化、混合、包封、吸收等。这样的程序对本领域技术人员是常规的。

在本发明的具体实施方案中，组合物与半固体载体或固体载体充分地组合或混合。混合可以以任何方便的方式进行，诸如研磨。还可以在混合过程中添加稳定剂，以保护组合物免于治疗活性的损失，即在胃中变性。用于在组合物中使用的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。

在另外的实施方案中，本发明包括使用药物脂质媒介物组合物，该组合物包含1型干扰素表达诱导物、一种或更多种脂质和水性溶剂。如本文使用的，术语“脂质”包括特征性地不溶于水且可用有机溶剂提取的任何宽范围的物质。该宽类别的化合物是本领域技术人员熟知的，并且如本文使用的术语“脂质”不限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人设计或产生的)。然而，脂质通常是一种生物物质。生物脂质是本领域熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫酸酯、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质，及其组合。当然，本发明的组合物和方法还涵盖除了本文具体描述的化合物之外的被本领域技术人员理解为脂质的化合物。

本领域普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在脂质媒介物中的技术的范围。例如，本发明的1型干扰素表达诱导物可以被分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价结合、作为悬浮液被包含在脂质中、与胶束或脂质体包含或复合，或者通过本领域普通技术人员已知的任何手段与脂质或脂质结构缔合。分散体可能导致或可能不导致脂质体的形成。

被施用至动物患者的本发明的组合物的实际剂量的量(dosage amount)可以通过身体和生理因素诸如体重、状况的严重程度、被治疗的疾病类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发症和施用途径来确定。根据剂量和施用途径，优选的剂量和/或有效量的施用次数可以根据受试者的应答而变化。在任何情况下，负责施用的医师将确定组合物中一种或更多种活性成分的浓度和用于个体受试者的一种或更多种适当剂量。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含，例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，例如，活性化合物可以构成单元重量的约2％至约75％之间、或约25％至约60％之间、和可从其中得出的任何范围。自然地，每种治疗有用的组合物中一种或更多种活性化合物的量可以以这样的方式制备，即合适的剂量将在化合物的任何给定单位剂量中获得。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品货架寿命以及其他药理学考虑的因素将被制备这样的药物制剂的本领域的技术人员考虑，并且因此，多种剂量和治疗方案可以是合意的。

在其他非限制性实例中，剂量还可以包括每次施用从约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000mg/kg/体重或更多，以及可从其中得出的任何范围。在可从本文列出的数值得出的范围的非限制性实例中，基于上文描述的数值，约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围可以被施用。

A.消化组合物(Alimentary Composition)和制剂

在本公开内容的一种实施方案中，本发明的1型干扰素表达诱导物被配制成经由消化途径施用。消化途径包括组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。具体地，本文公开的药物组合物可以口服、含服、直肠或舌下施用。因此，这些组合物可以与惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起配制，或者它们可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它们可以压制成片剂，或者它们可以直接掺入饮食的食物中。

在某些实施方案中，活性化合物可以掺入赋形剂中，并且以可摄入片剂、含服片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄饼(wafer)等形式使用(Mathiowitz E,Jacob JS,Jong YS,Carino GP,Chickering DE,Chaturvedi P,Santos CA,Vijayaraghavan K,Montgomery S,Bassett M,Morrell C.Biologically erodable microspheres aspotential oral drug delivery systems.Nature.1997；386:410-4.PMID:9121559；HwangMJ,Ni X,Waldman M,Ewig CS,Hagler AT.Derivation of class II forcefields.VI.Carbohydrate compounds and anomeric effects.Biopolymers.1998；45:435-68.PMID:9538697；Hwang JS,Chae SY,Lee MK,Bae YH.Synthesis of sulfonylureaconjugated copolymer via PEO spacer and its in vitro short-term bioactivityin insulin secretion from islets of Langerhans.Biomaterials.1998；19:1189-95.PMID:9720902；Hwang SJ,Park H,Park K.Gastric retentive drug-deliverysystems.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1998；15:243-84.PMID:9699081；美国专利第5,641,515号；第5,580,579号；和第5,792,451号，每一篇都具体地通过引用以其整体并入本文)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含以下物质：粘合剂，诸如例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如薄荷、冬青油、樱桃味剂(cherry flavoring)、橙味剂(orange flavoring)等。当剂量单位形式是胶囊时，它除了以上类型的物质之外还可以包含液体载体。多种其他物质可以存在，作为包衣或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。当剂量形式是胶囊时，它除了以上类型的物质之外还可以包含载体诸如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以被肠溶包衣。肠溶衣防止组合物在胃或上部肠道(upperbowel)(其中pH为酸性)中变性。参见，例如，美国专利第5,629,001号。在到达小肠后，其中的碱性pH溶解包衣，并且允许组合物释放和被特化细胞吸收，特化细胞例如肠上皮细胞(epithelial enterocyte)和派尔斑M细胞(Peyer's patch M cell)。糖浆剂或酏剂可以含有作为甜味剂的活性化合物蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃味剂或橙味剂。当然，在制备任何剂量单位形式中使用的任何物质应是药学上纯的且在所采用的量基本上无毒的。此外，活性化合物可以掺入持续释放的制剂(preparation)和制剂(formulation)中。

对于口服施用，本公开内容的组合物在漱口水、洁齿剂、含服片剂、口腔喷雾剂或舌下口服施用的制剂的形式中可以可选择地掺入一种或更多种赋形剂。例如，可以制备漱口水，将所需量的活性成分掺入适当的溶剂中，诸如硼酸钠溶液(Dobell溶液)中。可选择地，活性成分可以掺入口服溶液中，诸如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液中，或分散在洁齿剂中，或以治疗有效量添加到可包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂和润湿剂的组合物中。可选择地，组合物可以被制成可被放置于舌下或以其他方式溶解在口中的片剂或溶液形式。

适于其他消化施用模式的另外的制剂包括栓剂。栓剂是多种重量和形状的固体剂型，通常加了药物，用于插入直肠中。在插入后，栓剂软化、融化或溶解在腔流体中。通常，对于栓剂，传统的载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以由包含例如约0.5％至约10％、以及优选地约1％至约2％范围内的活性成分的混合物形成。

B.肠胃外组合物和制剂

在另外的实施方案中，本发明的1型干扰素表达诱导物可以经由肠胃外途径施用。如本文使用的，术语“肠胃外”包括绕过消化道的途径。具体地，本文公开的药物组合物可以例如静脉内、皮内、肌肉内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内施用。参见，例如，美国专利第6,7537,514号；第6,613,308号；第5,466,468号；第5,543,158号；第5,641,515号；和第5,399,363号(每一篇都具体地通过引用以其整体并入本文)。

活性化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可以在水中合适地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合制备。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，具体地通过引用以其整体并入本文)。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须就存在易于注射的程度来说是流体的。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(即，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持要求的粒径和通过使用表面活性剂来维持。防止微生物作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来引起，所述多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选地包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可以通过使用延迟吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶的组合物来引起。

例如，对于以水溶液肠胃外施用，如果需要，溶液应被合适地缓冲，并且首先使液体稀释剂与足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以被溶解在等渗NaCl溶液中，并且添加皮下灌注液，或注射到建议的输注部位(参见，例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。根据被治疗的受试者的状况，一定会出现剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足如FDA生物标准品办公室要求的无菌性、热原性、和一般安全性以及纯度标准。

无菌可注射溶液通过以下来制备：将所需量的活性化合物根据需要与上文列举的其他成分中的几种一起掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将多种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的期望成分的粉末。粉末化的组合物在有或没有稳定剂的情况下与液体载体诸如例如水或盐溶液组合。

C.其他药物组合物和制剂

在本发明的其他优选的实施方案中，本发明的活性化合物(1型干扰素表达诱导物)可以被配制成经由多种其他途径施用，例如局部(即经皮)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。用于局部施用的药物组合物可以包含被配置成用于含药物的应用的活性化合物，所述含药物的应用诸如软膏、糊剂、霜剂或粉末。软膏包括所有用于局部应用的油质组合物、吸附组合物、乳液组合物和基于水溶性的组合物，而霜剂和洗剂是仅包含乳液基质的那些组合物。局部施用的药物可以含有渗透增强剂，以促进活性成分通过皮肤的吸收。合适的渗透增强剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和月桂氮酮(luarocapram)。用于局部应用的组合物的可能基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜剂和凡士林以及任何其他合适的吸收、乳液或水溶性软膏基质。局部制剂还可以根据需要包括乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂，以保存活性成分并提供均匀的混合物。本发明的经皮施用还可以包括使用“贴剂”。例如，贴剂可以在固定的时间段内以预定的速率和连续的方式提供一种或更多种活性物质。

在某些实施方案中，药物组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气雾剂递送媒介物递送。经由鼻气雾喷雾剂将组合物直接递送至肺的方法已经例如在美国专利第5,756,353号和第5,804,212号中描述(每一篇都具体地通过引用以其整体并入本文)。类似地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga M,Serizawa Y,Azechi Y,Ochiai A,Kosaka Y,Igarashi R,Mizushima Y.Microparticle resins as a potential nasal drugdelivery system for insulin.J Control Release.1998；52:81-7.PMID:9685938)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利第5,725,871号，具体地通过引用以其整体并入本文)的药物递送也是制药领域中熟知的。类似地，以聚四氟乙烯支持物基质形式的经粘膜药物递送在美国专利第5,780,045号中描述(具体地通过引用以其整体并入本文)。术语气雾剂是指分散在液化或加压的气体推进剂中的液体颗粒的细分固体的胶体系统。本发明用于吸入的典型气雾剂将由活性成分在液体推进剂或液体推进剂和合适溶剂的混合物中的悬浮液组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力要求而变化。气雾剂的施用将根据受试者的年龄、体重以及症状的严重程度和应答而变化。

本公开内容的试剂盒

本文描述的任何组合物可以包含在试剂盒中。在非限制性实例中，本发明的1型干扰素表达诱导物(诸如表达以下蛋白中的一种或更多种的BCG菌株：RV1354c蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分；环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分；作为腺苷酸环化酶起作用的DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分)可以包含在试剂盒中。

试剂盒可以包含合适地等分的本发明的1型干扰素表达诱导物，以及在一些情况下，一种或更多种另外的剂。试剂盒的一种或更多种组分可以包装在水性介质中或呈冻干形式。试剂盒的容器装置将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，在它们中可以放置组分，并且优选地被合适地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒将通常还包含第二容器、第三容器或其他另外的容器，在这些容器中可以单独放置另外的组分。然而，组分的多种组合可以包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包含用于容纳本发明的1型干扰素表达诱导物的装置和处于封闭限制中的任何其他试剂容器用于商业销售。这样的容器可以包括在其中保存期望的小瓶的注射或吹-塑模制的塑料容器。

当试剂盒的组分被提供在一种和/或更多种液体溶液中时，液体溶液是水溶液，特别优选的是无菌水溶液。一种或更多种本发明组合物的1型干扰素表达诱导物可以被配制成可注射的组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其他这样的类似装置，制剂可以从该装置应用到身体的感染区域，注射到动物中，和/或甚至应用到试剂盒的其他组分和/或与试剂盒的其他组分混合。

然而，试剂盒的组分可以作为一种或更多种干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。设想了，溶剂也可以被提供在另一个容器装置中。

上文的实施例已经被包括以向本领域普通技术人员提供用于实施本发明公开的主题的代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域技术的一般水平，本领域技术人员可以理解，上文的实施例意图仅是示例性的，并且可以使用许多变化、修改和改变而不偏离本发明公开的主题的范围。上文的实施例通过说明的方式而不是通过限制的方式被提供。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均在此通过引用并入，其程度如同每一个参考文献被单独和具体地指出通过引用并入并且以其整体在本文中陈述一样。

除非本文另外指示，否则提及本文中的值的范围仅仅意图用作单独提及落在该范围内的每个单独的值的简略表达方法，并且每个单独的值被并入本说明书，如同其在本文被单独提及一样。除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地说明本发明且不对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实践必不可少。

本文描述了本发明的优选的实施方案，包括本发明人已知用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述描述后，那些优选的实施方案的变化形式对于本领域普通技术人员可以变得明显。本发明人预期技术人员视需要利用这样的变化形式，并且本发明人预期本发明以不同于本文具体描述的方式被实施。因此，本发明包括被适用法律允许的在此所附的权利要求书中列出的主题的所有修改和等同形式。此外，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾，否则上文描述的要素以其所有可能的变化形式的任何组合被本发明涵盖。

Claims (35)

1.一种载体，所述载体包含表达蛋白质或其功能部分的核酸序列，所述蛋白质或其功能部分产生STING激动剂。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述STING激动剂选自由以下组成的组：3’-5’c-di-AMP(也被称为c-di-AMP)；3’-5’c-di-GMP(也被称为c-di-GMP)；3’-3’cGAMP；2’-3’cGAMP及其组合。

3.根据权利要求2所述的载体，所述载体包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码Rv1354c蛋白或其功能部分的第一核酸序列；编码3’-3’环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的第二核酸序列；编码2’-3’环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的第三核酸序列；编码DNA完整性扫描(disA)蛋白或其功能部分的第四核酸序列，及它们的组合。

4.根据权利要求1所述的载体，所述载体还包含编码PanC和PanD蛋白或其功能部分的第五核酸序列。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述载体不含抗生素抗性基因。

6.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：稳定整合到细菌的基因组中的载体、在细菌内以多于一个拷贝稳定附加型复制的载体和/或其组合。

7.根据权利要求3所述的载体，所述载体还包含编码将分枝杆菌(Mycobacterium)的磷酸二酯酶基因或磷酸二酯酶结构域的表达敲除的蛋白质或核酸序列的第五核酸序列。

8.根据权利要求3所述的载体，其中所述第三核酸序列过表达所述环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白的环化酶结构域。

9.根据权利要求3所述的载体，其中所述第三核酸序列表达非功能性的具有识别调控DNA的能力的环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白。

10.一种分枝杆菌菌株，所述菌株包含载体，所述载体包含表达蛋白质或其功能部分的核酸序列，所述蛋白质或其功能部分产生STING激动剂。

11.根据权利要求10所述的菌株，其中所述STING激动剂选自由以下组成的组：3’-5’c-di-AMP(也被称为c-di-AMP)；3’-5’c-di-GMP(也被称为c-di-GMP)；3’-3’cGAMP；2’-3’cGAMP及其组合。

12.根据权利要求10所述的菌株，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：编码Rv1354c蛋白或其功能部分的第一核酸序列；编码3’-3’环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的第二核酸序列；编码2’-3’环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的第三核酸序列；编码DNA完整性扫描(DisA)蛋白或其功能部分的第四核酸序列，及它们的组合。

13.根据权利要求12所述的菌株，其中所述分枝杆菌菌株是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)或其组合。

14.根据权利要求13所述的菌株，其中所述分枝杆菌菌株是卡介苗分枝杆菌(Mycobacterium bacillus Calmette Guerin)(BCG)。

15.根据权利要求14所述的菌株，其中所述菌株是BCG的泛酸盐(panCD突变体)营养缺陷型，并且所述载体包含编码PanC蛋白或其功能部分的panCD核酸和编码PanD蛋白或其功能部分的核酸序列。

16.根据权利要求16所述的菌株，其中所述菌株不含抗生素抗性基因组基因。

17.根据权利要求16所述的菌株，其中所述载体不含抗生素抗性基因。

18.根据权利要求10所述的菌株，其中所述载体选自由以下组成的组：整合到所述分枝杆菌的染色体中的载体、在所述分枝杆菌内以多于一个拷贝稳定附加型复制的载体及其组合。

19.根据权利要求10所述的菌株，其中所述菌株不含抗生素抗性基因。

20.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求10-19所述的分枝杆菌菌株中的任一种和(ii)药学上可接受的载体。

21.一种在受试者中引发1型干扰素应答、增强促炎性细胞因子的表达和/或引发训练免疫的方法，所述方法包括以下步骤：

施用包含权利要求10-19所述的分枝杆菌菌株中的任一种的药物组合物；和

在所述受试者中引发1型干扰素应答、增强促炎性细胞因子的表达和/或引发训练免疫。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物通过导管被施用至所述受试者的膀胱中。

23.一种使用分枝杆菌菌株治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质的载体，所述方法包括以下步骤：

将包含分枝杆菌菌株的药物组合物施用至患有癌症的受试者，所述分枝杆菌菌株包含表达产生STING激动剂的蛋白质或其功能部分的载体；和

治疗或预防所述受试者中的癌症。

24.根据权利要求23所述的载体，其中所述STING激动剂选自由以下组成的组：3’-5’c-di-AMP(也被称为c-di-AMP)；3’-5’c-di-GMP(也被称为c-diGMP)；3’-3’cGAMP；2’-3’cGAMP及其组合。

25.根据权利要求24所述的载体，所述载体包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码Rv1354c蛋白或其功能部分的第一核酸序列；编码3’-3’环状GMP-AMP合酶(DncV)蛋白或其功能部分的第二核酸序列；编码2’-3’环状GMP-AMP合酶(cGAS)蛋白或其功能部分的第三核酸序列；编码DNA完整性扫描(DisA)蛋白或其功能部分的第四核酸序列，及它们的组合。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：上皮癌、乳腺癌、非肌层浸润性膀胱癌及其组合。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症是非肌层浸润性膀胱癌，并且是BCG无应答的非肌层浸润性膀胱癌(BCG无应答的NMIBC)，并且所述药物组合物通过膀胱内滴注施用。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症是非肌层浸润性膀胱癌，并且是BCG未治疗的非肌层浸润性膀胱癌(BCG未治疗的NMIBC)，并且所述药物组合物通过膀胱内滴注施用。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述上皮癌选自由以下组成的组：结肠癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、鼻咽癌、支气管癌及其组合，并且所述药物组合物被施用至所述上皮癌的腔表面。

30.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症选自实体瘤、液体瘤。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述药物组合物通过肿瘤内注射施用。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述药物组合物通过全身输注施用。

33.根据权利要求23所述的方法，所述方法包括施用检查点抑制剂的步骤。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的组：伊匹单抗(抗CTLA-4)、纳武单抗(抗PD-1)、派姆单抗(抗PD-1)、西米普利单抗(抗PD-1)、阿特珠单抗(抗PD-L1)、阿维鲁单抗(抗PD-L1)、德瓦鲁单抗(抗PD-L1)及其组合。

35.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌，并且导管施用所述药物组合物。

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