CN112592836A - 一株天坑深色内生真菌(dse)菌株的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,特别涉及内生真菌菌株LY112及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.21071的新菌株Byssolophis sp.LY112,该菌株能有效促进铁皮石斛和甘蔗生长,同时还具有防治香蕉枯萎病的作用:接种该菌株后,铁皮石斛的组培苗干重较对照组提高了102.70%,盆栽苗干重较对照组增加了66.67%;甘蔗盆栽苗株高、鲜重和干重分别较对照增加了18.17%、50.57%和31.32%,促生效果显著;对香蕉枯萎病的室内防治效果达71.76%,防效优良,是一株对多种植物有良好促生、防病效果的内生真菌菌株,具有良好的开发价值。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域,特别涉及内生真菌菌株LY112及其应用。
【背景技术】
深色有隔内生真菌(DSE)是植物内生真菌的主要类群,其主要特征是菌丝颜色较深,具有明显隔膜,定殖于植物的根、表皮、皮层甚至纤维管束组织的细胞内或细胞间隙,能与植物共生,而不会引起植物病变,DSE可以在不同生境植物中定殖,同时,还可以和ECM 和AM在植物根系中共同生存,没有宿主特异性,因此,对DSE菌株的研究开发能有效提升微生物的生物促生和生物防治应用能力,申请人团队一直致力于DSE的筛选和研究,研究过程中发现了很多具有优异性能的DSE菌株。在研究过程中,申请人发现,这类微生物不同菌株之间差异巨大,有的DSE菌株能促进植物生长,有的DSE菌株却抑制植物生长,有的DSE 菌株的生物防治效果明显,有的DSE菌株却防效较差或者没有效果,因此,为了加强对此类微生物的利用,有必要坚持不懈的在此领域不断的进行菌株鉴定和筛选等工作,筛选出更多性促生、生防效果更好的菌株,有助于为内生真菌的开发利用提供丰富的种质资源保障。
目前,申请人团队研发并获得了多株新种DSE菌株的授权,例如:申请号为201910884589.9发明名称为《枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用》的内生真菌,该真菌由申请人柳州地区甘蔗围土壤分离而得,属于Cladophiaphora属新种,具有促进铁皮石斛、西红柿生长的作用,且具有防治香蕉枯萎病的作用;申请号为202010164610.0发明名称为《新属内生真菌TK815及其应用》的内生真菌,该真菌由申请人从广西百色市乐业县大石围天坑群白洞天坑的土壤中分离获得,具有促进铁皮石斛生长的作用;申请号为201911188968.0发明名称为《新种内生真菌LZ3及其应用》的内生真菌,该菌株具有促进香蕉生长,和防治香蕉枯萎病的作用;由此可见,内生真菌在农业自然环境保护中具有广阔的开发利用前景,但是目前的难点还是在于DSE涉及的微生物种类繁多,且多数为罕见稀少的新物种,其分类鉴定比较困难,且筛选工作繁琐和缓慢,为此,为了丰富具有促生、防效作用的内生真菌,从生物防治角度减少对化学农药和化肥的依赖,有必要坚持不懈的开展此项研究。
【发明内容】
鉴于上述内容,筛选出更多性状优良促生内生真菌,促进内生真菌种质资源的开发利用,本发明目的在于提供内生真菌菌株LY112及其应用及其在促进甘蔗和铁皮石斛生长、防治香蕉枯萎病上的应用。
为达到上述目的,本发明筛选出一株内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112,其保藏编号为 CGMCC NO.21071。属于真菌界,Byssolophis属,未知种。所述内生真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC NO.21071,保藏日期为2020年11月27日。
本发明还包括所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112在促进铁皮石斛和/或甘蔗生长上的应用。
本发明还包括一种应用所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112促进铁皮石斛和/或甘蔗生长的方法,所述方法为:将菌株LY112直接接种到植物组培苗和/或植株中。
本发明还包括所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112在提高香蕉对香蕉枯萎病防治上的应用。
本发明还包括一种应用所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112对香蕉枯萎病进行防治的方法,所述方法为:将菌株LY112直接接种到香蕉组培苗和/或植株中。
本发明具有以下有益效果:
本申请的新菌株Byssolophis sp.LY112能够有效促进铁皮石斛和甘蔗生长,同时还具有防治香蕉枯萎病的作用:该菌株接种铁皮石斛组培苗后的干重较对照组提高了102.70%,接种铁皮石斛盆栽苗干重比对照组增加了66.67%,促生效果相当明显,且其对甘蔗的促生效果也非常明显,经过盆栽实验处理组的株高比对照组增加了18.17%;鲜重比对照组增加了50.57%;干重比对照组增加了31.32%;促生效果显著;对香蕉枯萎病的室内防治效果达71.76%;防效明显,是一株对多种植物有良好促生、防病效果的内生真菌菌株;在农业生物菌肥和病害生物防治领域具有很好的应用前景。
【附图说明】
图1为本发明LY112菌株在CMMY培养基上的菌落形态;
图2为本发明菌株LY112的ITS系统发育树;
图3为接种本发明菌株LY112对铁皮石斛组培苗生长的影响,图中左边平皿为不接种LY112的对照组,右边平皿为接种LY112的处理组;
图4为接种本发明菌株LY112对甘蔗盆栽苗生长的影响图中左边盆栽为接种LY112的处理组,右边盆栽为不接种LY112的对照组。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1:
本发明筛选出一株内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112,其保藏编号为CGMCCNO.21071。属于真菌界,Byssolophis属,未知种。所述内生真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCCNO.21071,保藏日期为2020年11月27日。
菌株LY112采用诱捕法分离自广西百色市乐业县大石围天坑群的原始森林。
对菌株LY112进行研究后,认为其属于新种菌株,其分类标准如下:
1、菌株的形态学分类
该菌株在CMMY培养基上长速较慢,28℃下培养两周后菌落形态如图1所示:直径达45mm,气生菌丝浓密,菌落浅灰色,近圆形,绒毡状,菌落边缘平整。菌丝有隔,褐色, 1.5-4.8μm。未观察到分生孢子和厚垣孢子。
2、分子生物学鉴定
该菌株的ITS序列NCBI网上比对结果与uncultured Ascomycota相似性最高(99%); LSU序列与Byssolophis sphaerioides相似性最高(99%);SSU序列与包括Byssolophis sphaerioides在内的多个属种的相似性都高达99%。基于这3个基因,在网上下载相似性较高的序列分别构建了系统发育树,结果显示ITS进化树与unculturedAscomycota单独聚为一支,支持率为84%;结果显示三个系统树的拓扑结构差异较大,其中只有LSU进化树上LY112 菌株与Byssolophis sphaerioides以93%的支持率单独聚为一支,基于目前所掌握的鉴定信息,将LY112菌株鉴定为Byssolophis属下的未知种Byssolophis sp.,其基于LSU序列构建的系统发育树如图2所示。图中可见,LY112与Byssolophis sphaerioides的亲缘关系较近,单独聚类为一支。基于目前所掌握的鉴定信息,将LY112菌株鉴定为Byssolophis属下的未知种 Byssolophis sp.。
实施例2:
对铁皮石斛组培苗的促生长作用:
(1)将LY112菌株活化后接种于燕麦培养基上,每皿接种3个菌块,培养得到LY112菌落平皿;
(2)选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至菌落上,在每皿的3个菌落上分别移栽 3株组培苗,将接种了LY112菌株的培养皿命名为处理组;同时,同步将无菌苗接种到不接种LY112的空白燕麦培养基上,并命名为CK组;
(3)将步骤(2)的处理组和CK组一起放入培养箱中进行共培养,培养条件为23℃,光照强度为180μmol m-2s-2,光照时间为16h。
上述步骤(2)进行4个重复的处理,培养60d后,将铁皮石斛的根部培养基洗净后在50℃烘箱中烘烤3d以上称量干重。得到结果如表1所示:
表1接种LY112对石斛干重的影响
处理 | LY112 | 对照(CK) |
重复1 | 0.1138 | 0.0567 |
重复2 | 0.1512 | 0.0638 |
重复3 | 0.1176 | 0.0682 |
平均值 | 0.1275 | 0.0629 |
由表1可知,处理组铁皮石斛组培苗接种了LY112菌株后其干重相对于对照CK组提高了102.70%,增重效果相当明显。
其平皿接种培养图如图3所示,图3是菌株LY112对铁皮石斛组培苗生长的影响,图中左边平皿为不接种LY112的对照组,右边平皿为接种LY112的实验组,图中明显可见右边平皿的铁皮石斛明显比左边要粗壮,长势优于左边平皿。
实施例3:
菌株LY112对铁皮石斛盆栽苗的促生长作用:
(1)配置菌液:将菌株在CMMY平板上培养约10d后,转接于PDB培养基中振荡培养(28℃,120r/min)10~15d;用灭菌纱布过滤收集菌丝体,用无菌水冲洗数次,将菌丝团打碎,配成5×105cfu/mL的菌液备用;
(2)施菌:选取生长较一致的铁皮石斛组培苗,3株/杯,铁皮石斛苗先种植一个月,在此期间,所有的管理、施肥方法均相同,设置3个重复,每个重复9杯,然后向种植杯中浇灌步骤(1)配制好的菌液。每个种植杯浇灌30mL,每隔15d灌根一次,总共灌根3次。另以未浇菌液为对照组(CK);
测定指标:第一次浇菌6个月后,测定铁皮石斛苗的株高、茎宽、根长、鲜重、干重,具体情况如表2所示:
表2 LY112对铁皮石斛盆栽苗生长的影响
处理 | 株高(cm) | 茎宽(mm) | 根长(cm) | 鲜重(g) | 干重(g) |
LY112 | 5.2 | 4.40 | 2.9 | 1.35 | 0.12 |
LY112 | 4.4 | 4.10 | 2.8 | 0.96 | 0.09 |
LY112 | 4.0 | 3.64 | 2.0 | 1.05 | 0.09 |
平均 | 4.53 | 4.05 | 2.57 | 1.12 | 0.10 |
对照 | 3.7 | 2.64 | 2.8 | 0.66 | 0.06 |
由上表可见,接种6个月后,LY112的铁皮石斛盆栽苗其株高、茎宽、鲜重、干重均远远大于CK组,根长略低于对照组,说明菌株LY112主要是对盆栽苗的地上部分有明显的促生作用,对根部的促生效果不明显;以平均值记,处理组的株高比对照组增加了22.43%;茎宽比对照组增加了53.41%;鲜重比对照组增加了69.70%;干重比对照组增加了66.67%。
实施例4:
菌株LY112对甘蔗盆栽苗的促生长作用:
(2)配置菌液:将菌株在CMMY平板上培养约10d后,转接于PDB培养基中振荡培养(28℃,120r/min)10~15d;用灭菌纱布过滤收集菌丝体,用无菌水冲洗数次,将菌丝团打碎,配成5×105cfu/mL的菌液备用;
(2)施菌:选取生长较一致的甘蔗组培苗,1株/杯,甘蔗苗先种植一个月,在此期间,所有的管理、施肥方法均相同,设置3个重复,每个重复12杯,然后向种植杯中浇灌步骤(1) 配制好的菌液。每个种植杯浇灌30mL,每隔15d灌根一次,总共灌根3次。另以未浇菌液为对照组(CK);
测定指标:第一次浇菌60d后,测定甘蔗苗的株高、鲜重、干重,具体情况如表2所示:
表3 LY112对甘蔗盆栽苗生长的影响
处理 | 株高(cm) | 鲜重(g) | 干重(g) |
LY112 | 116.8 | 939.1 | 419.2 |
LY112 | 118.3 | 925.9 | 362.0 |
LY112 | 123.3 | 596.0 | 466.5 |
平均 | 119.47 | 820.33 | 415.90 |
对照 | 101.1 | 544.8 | 316.7 |
由上表可见,接种60d后,LY112的3组甘蔗盆栽苗其株高、鲜重、干重均远远大于CK组,以平均值记,处理组的株高比对照组增加了18.17%;鲜重比对照组增加了50.57%;干重比对照组增加了31.32%。
其甘蔗盆栽接种培养图如图4所示,图中左边为接种了菌株LY112的甘蔗盆栽,右边为未接种菌株LY112的甘蔗盆栽,明显可见左边的甘蔗盆栽长势要优于右边的对照(CK)组盆栽。
实施例5:
菌株LY112对香蕉枯萎病的防治作用:
(1)LY112与香蕉组培苗的共培养:
处理组设置:将菌株LY112活化后接种到培养基平皿上,使得每个平皿有3个菌落;选择长势一致的无菌香蕉组培苗移栽至平皿上,每个菌落上种植1株组培苗,每皿种植3株苗,共设3皿3个重复;
空白(CK)组设置:CK组不接种菌株,而是直接将无菌香蕉组培苗种植在培养基平皿上,每皿种植3株石斛苗,共设3皿3个重复。
将处理组和空白组在同等条件下移入组培箱中进行共培养,培养10d备用。
(2)培养致病菌:
将镰刀菌(病原菌)活化后接于水琼脂培养基上,每皿接种3个菌块,28℃培养4d待用。
(3)平皿防效实验:
将步骤(1)获得的LY112共生香蕉组培苗(处理组)和未接种LY112的香蕉组培苗(CK 组)一同移栽至步骤(2)的培养好致病菌的平板上。观察并记录各处理的病级情况,计算病情指数和防治效果。
对病情分级标准如下:
0级-外观无可见症状;
1级-香蕉植株长势无明显受阻,全株黄萎面积不超35%;
2级-香蕉植株弱小,全株黄萎面积达35%-80%;
3级-香蕉植株全株黄萎面积达80%以上,甚至全株枯死。
对处理组和对照组进行观察,对病情指数和防治效果进行计算,具体如下:
通过上述公式的计算,本申请实验菌株LY112对香蕉枯萎病的防治效果如表4所示:
表4菌株LY112对香蕉枯萎病的防治效果
处理 | 平均平皿防治效果 |
LY112 | 71.76% |
对照 | - |
由表4可见,在香蕉中接种LY112菌株后能提高香蕉对香蕉枯萎病的抗性,平皿共生实验中防治效果达71.76%,效果较为显著。
综上所述,本申请的内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112属于Byssolophis属的未知种,属于新种菌株,其对植物有良好的促生效果,特别是能促进铁皮石斛和甘蔗生长,同时还具有良好的生物防效,对香蕉枯萎病有较强的防效,是一株兼具抗病和促生功能的新种内生真菌。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明,但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围,凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更,均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (5)
1.内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112,其保藏编号为CGMCC NO.21071。
2.如权利要求1所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112在促进铁皮石斛和/或甘蔗生长上的应用。
3.一种应用如权利要求1所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112促进铁皮石斛和/或甘蔗生长的方法,其特征在于,所述方法为:将菌株LY112直接接种到植物组培苗和/或植株中。
4.如权利要求1所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112在提高香蕉对香蕉枯萎病防治上的应用。
5.一种应用如权利要求1所述内生真菌菌株Byssolophis sp.LY112对香蕉枯萎病进行防治的方法,其特征在于,所述方法为:将菌株LY112直接接种到香蕉组培苗和/或植株中。
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