CN112592394A

CN112592394A - 水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的应用

Info

Publication number: CN112592394A
Application number: CN202110019560.1A
Authority: CN
Inventors: 田晓杰; 卜庆云; 王臻昱; 李秀峰
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2041-01-07
Also published as: CN112592394B

Abstract

水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的应用，本发明的目的是提供一种水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的新应用，对提高水稻低温胁迫下的产量提供了重要理论依据。本发明发现OsWRKY53参与调控水稻孕穗期耐冷性的新功能，解析OsWRKY53负向调控水稻孕穗期耐冷性的分子机制。低温处理会导致水稻花药中的GA含量下降，但oswrky53突变体中的GA含量显著高于野生型。实验表明OsWRKY53能够直接结合并抑制GA相关生物合成基因OsGA20ox1、OsGA20ox3、OsGA3ox1的转录活性，从而负调控水稻花药中的GA含量，负调控水稻孕穗期耐冷性。

Description

水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的应用

技术领域

本发明涉及一种水稻转录因子OsWRKY53的新用途。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以其为主食。近年来，由于气候异常，本应炎热的夏季经常出现低温等恶劣天气，孕穗期冷害已经成为了主要的自然灾害。因此，解决孕穗期冷害问题，挖掘耐冷基因及解析其功能，对于提高水稻的产量，保证粮食安全具有十分重要的现实意义。GA，即赤霉素，是常见的植物激素，参与调控水稻孕穗期耐冷性，低温处理会导致水稻花药中的GA含量下降，花粉育性变差，结实率下降，而外源施加GA会一定程度的恢复结实率下降的表型，GA信号突变体slr1-d1、slr1-d3、gid1-8在低温处理后结实率相比于对照材料显著下降，充分说明GA与水稻的孕穗期耐冷性调控之间存在着直接的关系。

水稻在孕穗期若遇上低温冷害，枝梗及颖花分化不良，每穗粒数减少，结实率大幅下降，容易造成水稻减产。因此研究孕穗期低温胁迫对于水稻产量具有重要的影响，对培育耐低温水稻品种以保障我国粮食高产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的新应用，对提高水稻低温胁迫下的产量提供了重要理论依据，具有广阔的应用前景。

本发明提供水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的应用。

进一步的，转录因子OsWRKY53基因负调控GA生物合成基因GA20ox1、GA20ox3、GA3ox1的转录。

进一步的，OsWRKY53基因过表达转基因水稻花粉育性变差、结实率下降。

进一步的，oswrky53突变体低温处理后花粉育性及结实率都高于野生型。

进一步的，oswrky53突变体花药中的GA含量高于野生型。

进一步的，将转录因子OsWRKY53基因敲除，得到水稻孕穗期耐冷性能提高的转基因植物。

本发明的有益效果：

本发明的OsWRKY53基因敲除突变体转基因水稻能够显著提高水稻孕穗期耐冷性，经过一系列实验分析发现，OsWRKY53能够负向调控水稻花药中的GA含量，从而负调控水稻孕穗期耐冷性，这一发现在之前从未被报道。

本发明发现OsWRKY53基因过表达转基因水稻花粉育性变差、结实率下降，低温处理后结实率显著下降，表现出GA缺失的表型；oswrky53突变体低温处理后花粉育性及结实率都显著高于野生型；GA含量的定发现，oswrky53突变体花药中的GA含量显著高于野生型，生化实验表明，OsWRKY53通过与GA20ox1、GA20ox3、GA3ox1基因的启动子相结合抑制它们的转录，负向调控花药GA水平，最终负向调控水稻孕穗期耐冷性。

水稻转录因子OsWRKY53作为水稻孕穗期耐冷性负调控因子的这一发现，挖掘了OsWRKY53的新功能，对提高水稻低温胁迫下的产量提供了重要理论依据，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为龙粳11、OsWRKY53过表达转基因水稻穗型图

图2为龙粳11、OsWRKY53过表达转基因水稻结实率统计结果

图3为龙粳11、oswrky53突变体穗型图

图4为龙粳11、oswrky53突变体结实率统计结果

图5为龙粳11、oswrky53突变体、OsWRKY53过表达转基因水稻正常条件及15℃低温处理后的穗型图

图6为龙粳11、oswrky53突变体、OsWRKY53过表达转基因水稻正常条件及15℃低温处理后的结实率统计结果

图7为龙粳11、oswrky53突变体、OsWRKY53过表达转基因水稻在15℃低温处理后的相对结实率统计结果

图8为龙粳11、oswrky53突变体、OsWRKY53过表达转基因水稻在15℃低温处理后的花药活力图

图9为龙粳11、oswrky53突变体、OsWRKY53过表达转基因水稻在15℃低温处理后的花药活力统计结果

图10为龙粳11、oswrky53突变体正常条件及18℃低温处理后花药中GA含量的检测结果

图11为龙粳11、oswrky53突变体正常条件及15℃低温处理后幼穗中GA生物合成基因的表达量检测结果

图12为OsGA20ox1、OsGA20ox3、OsGA3ox1启动子序列分析结果，图中黑色长方形图标代表W-box基序。

图13为EMSA实验证明OsWRKY53可以直接结合OsGA20ox1、OsGA20ox3、OsGA3ox1启动子结果

图14为原生质体瞬时表达实验验证OsWRKY53抑制OsGA20ox1的转录活性结果

图15为稻花香2号及其遗传背景下oswrky53突变体植株正常条件及15℃低温处理后的穗型图

图16为稻花香2号及其遗传背景下oswrky53突变体植株正常条件及15℃低温处理后结实率统计结果

图17为稻花香2号及其遗传背景下oswrky53突变体植株在15℃低温处理后相对结实率统计结果

图18为龙稻16号及其遗传背景下oswrky53突变体植株正常条件及15℃低温处理后的穗型图

图19为龙稻16号及其遗传背景下oswrky53突变体植株正常条件及15℃低温处理后结实率统计结果

图20为龙稻16号及其遗传背景下oswrky53突变体植株正常条件及15℃低温处理后结实率统计结果

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

对对照材料及相应的oswrky53突变体植株及OsWRKY53过表达转基因植株进行孕穗期低温处理，并统计其结实情况。

通过分子生物学、生物化学、遗传学等手段验证OsWRKY53能够直接结合GA相关生物合成基因的启动子并抑制其转录，从而负调控水稻花药中的GA含量，负调控水稻孕穗期耐冷性。

实施例1：水稻孕穗期负调控因子OsWRKY53的生物学功能验证

观察野生水稻品种龙粳11、龙粳11背景下的oswrky53突变体植株及OsWRKY53过表达转基因植株发现，OsWRKY53过表达植株相比于对照材料龙粳11结实率显著下降(如图1、2所示)。而oswrky53突变体植株与对照材料龙粳11相比结实率基本一致(如图3、4所示)。这暗示着OsWRKY53极有可能参与水稻孕穗期耐冷性的调控。

以野生水稻品种龙粳11、龙粳11背景下的oswrky53突变体植株及过表达转基因植株为实验材料，在水稻主蘖生长到水稻的剑叶与倒二叶叶枕距为-5～0cm(即花药处于减数分裂期至单核期)时对水稻进行15℃低温处理4天、5天后转移回正常的生长条件，在成熟时统计主穗的总粒数、实粒数、结实率。结果如图5、6、7所示(图6和7中□表示龙粳11，■表示oswrky53突变体植株，

表示OsWRKY53过表达转基因植株)，oswrky53突变体植株相比于对照材料在低温处理后结实率显著提高。

在同样的处理条件下，处理4天、5天后转移回正常的生长条件，在开花的前一天(即花药处于三核期)取样，将其固定在FAA固定液中，用1％I₂-KI染色并将花药夹断释放花粉粒，在Olympus BX53显微镜下观察花粉的活力。结果如图8、9所示(图9中□表示龙粳11，■表示oswrky53突变体植株，

表示OsWRKY53过表达转基因植株)，oswrky53突变体植株在低温处理后花粉活力显著好于其对照材料。

以上结果表明，OsWRKY53能够负向调控水稻孕穗期耐冷性。

实施例2：OsWRKY53负调控水稻花药中GA含量检测

(1)龙粳11、oswrky53突变体植株在正常及低温处理后的花药中GA含量的测定

以野生水稻品种龙粳11、及其遗传背景下的oswrky53突变体植株为实验材料在水稻主蘖生长到水稻的剑叶与倒二叶叶枕距为-8～-6cm(即花药处于减数分裂期)时对水稻进行18℃低温处理15天(花药处于三核期)，取样大约30株水稻主蘖的花药在武汉绿剑公司通过Thermo Scientific Ultimate 3000 UHPLC及TSQ Quantiva检测花药中的GA含量。

结果如图10所示，□表示LJ11-NC，■表示oswrky53-NC，

表示LJ11-LT，

表示oswrky53-LT。低温胁迫会导致水稻花药中GA含量下降，但是在oswrky53突变体植株中下降的不明显，导致oswrky53突变体植株花药中GA含量显著高于对照材料。

(2)龙粳11、oswrky53突变体植株在正常及低温处理后花药中GA相关基因的表达模式检测

一、以野生水稻品种龙粳11、及其遗传背景下的oswrky53突变体植株为实验材料在水稻主蘖生长到水稻的剑叶与倒二叶叶枕距为-5～0cm(即花药处于减数分裂期至单核期)时对水稻进行15℃低温处理4天，取样其主蘖的幼穗及相同叶枕距的在正常条件下生长的水稻主蘖的幼穗，参照购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取幼穗总RNA；

二、采用DNaseⅠ处理步骤一提取的总RNA；

三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciences Clontech公司的BD SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行；

四、以获得的cDNA为模板通过3个GA生物合成基因及在花药中特异表达的OsGAMYB基因引物：OsGA20ox1基因(正向引物F1与反向引物R1)、OsGA20ox3基因(正向引物F2与反向引物R2)、OsGA3ox1基因(正向引物F3与反向引物3)、OsGAMYB基因(正向引物F4与反向引物4)及水稻内参actin(正向引物F5与反向引物R5)，采用SYBR Green PCR master mix(TransStart)进行Quantitative real-time PCR；数据从Bio-Rad chromo 4real-timePCR detector上获得；用2^-△△CT方法分析倍数变化。

正向引物F1：5'-ATCGGCTGGAGATGAAGAGG-3'

反向引物R1：5'-CGGCTCATCTCGTGGCAGTA-3'

正向引物F2：5'-AATACCGCCACATGGGGGAGGT-3'

反向引物R2：5'-GTAGTGGTTCAGCCGCATCACC-3'

正向引物F3：5'-GACGATTCACCTCAACATGTTCCCT-3'

反向引物R3：5'-GGCTCTGCAGGATGAAGGTGAA-3'

正向引物F4：5'-GGAGGACGGACAACGAGAT-3'

反向引物R4：5'-GAGTGCGGGAACTGGAAGA-3'

正向引物F5：5'-AGACCTTCAACACCCCTGCTATG-3'

反向引物R5：5'-TCACGCCCAGCAAGGTCG-3'

如图11所示(□表示LJ11-NC，■表示oswrky53-NC，

表示LJ11-LT，

表示oswrky53-LT)，是3个GA生物合成基因GA20ox1、GA20ox3、GA3ox1及OsGAMYB基因在OsWRKY53基因敲除突变体水稻及其对照材料在正常及低温处理条件下的表达特征。结果显示，低温处理会导致GA相关基因表达下降，敲除突变体水稻中3个GA生物合成基因及GAMYB基因在低温处理条件下的表达量均显著高于对照材料，初步说明OsWRKY53基因能够负向调控GA信号。

实施例3：OsWRKY53直接结合并抑制GA相关生物合成基因转录活性的验证：

(1)GA相关生物合成基因序列分析

根据Rice Genome Annotation Project中公布的OsGA20ox1、OsGA20ox3、OsGA3ox1启动子区2000bp的序列找到OsGA20ox1基因2000bp启动子区内存在2个W-box(TTGACC)、OsGA20ox3基因2000bp启动子区内存在1个W-box(TTGACC)、OsGA3ox1基因2000bp启动子区内存在1个W-box(TTGACC)如图12所示。

(2)EMSA实验验证OsWRKY53直接结合GA相关生物合成基因

一、纯化带有Mbp标签的OsWRKY53蛋白，将质粒转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆与3ml含卡那抗生素的液体LB培养基中，37℃震荡过夜。将活化好的菌液按1：100的比例接入新的含卡那抗生素的液体LB培养基中，37℃震荡，培养至菌液OD值为0.5时，加入IPTG至终浓度0.5mM，然后转入18℃120rpm震荡培养12～14h。4000rpm，4℃离心15min，收集菌体，弃掉上清，用column buffer悬浮，大约500ml菌液加入10ml column buffer，加入PMSF至终浓度为1mM，冰上放置30min。将悬浮好的菌液进行超声波破裂，加入终浓度为1％的TritionX-100，12000rpm，4℃离心1h，留上清。将洗好的Mbp的beads与上清共同4℃孵育2-3h，然后1000rpm，4℃离心2min，留下beads，再将beads用wash buffer清洗7-8次，然后加入到可溶的溶剂麦芽糖中，孵育30min。加入1×loading buffer，煮沸5min，高速离心10min；上样，进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，考马斯亮蓝染色进行检测。

二、根据OsGA20ox1(正向引物F6与反向引物R6、正向引物F7与反向引物R7)、OsGA20ox3(正向引物F8与反向引物R8、正向引物F9与反向引物R9)、OsGA3ox1(正向引物F10与反向引物R10、正向引物F11与反向引物R11)启动子区的W-box基序设计相应的结合探针与突变探针,参照购买自碧云天公司的EMSA探针生物素标记试剂盒的操作手册标记生物素探针。

三、然后参照购买自碧云天公司的化学发光法EMSA试剂盒的操作手册进行实验。

结果如图13所示，OsWRKY53可以通过W-box基序直接结合OsGA20ox1、OsGA20ox3、OsGA3ox1的启动子。

正向引物F6：5'-TTCTAGGTCTCTCTAGAGTAACATGACCTTATTGCGGAGTTGTTTGTCCAG-3'

反向引物R6：5'-CTGGACAAACAACTCCGCAATAAGGTCATGTTACTCTAGAGAGACCTAGAA-3'

正向引物F7：5'-TTCTAGGTCTCTCTAGAGTAACAAAAAATTATTGCGGAGTTGTTTGTCCAG-3'

反向引物R7：5'-CTGGACAAACAACTCCGCAATAATTTTTTGTTACTCTAGAGAGACCTAGAA-3'

正向引物F8：5'-TTCCTCTGACTCAACCGCTCATGTTGACCGGCCATTTTTTTTAAAGAAAAAG-3'

反向引物R8：5'-CTTTTTCTTTAAAAAAAATGGCCGGTCAACATGAGCGGTTGAGTCAGAGGAA-3'

正向引物F9：5'-TTCCTCTGACTCAACCGCTCATGAAAAAAGGCCATTTTTTTTAAAGAAAAAG-3'

反向引物R9：5'-CTTTTTCTTTAAAAAAAATGGCCTTTTTTCATGAGCGGTTGAGTCAGAGGAA-3'

正向引物F10：5'-TTGACTTTTTAGCACATGTTTGACCGTTCGTCTTATTCAAAAAC-3'

反向引物R10：5'-GTTTTTGAATAAGACGAACGGTCAAACATGTGCTAAAAAGTCAA-3'

正向引物F11：5'-TTGACTTTTTAGCACATGTAAAAAAGTTCGTCTTATTCAAAAAC-3'

反向引物R11：5'-GTTTTTGAATAAGACGAACTTTTTTACATGTGCTAAAAAGTCAA-3'

(3)原生质体瞬时表达实验验证OsWRKY53能够抑制GA相关生物合成基因的转录活性

分别将OsGA20ox1启动子2.0kb构建到pGreenⅡ0800-LUC上作为报告载体(正向引物F12与反向引物R12)，将oswrky53和OsWRKY53的CDS序列构建到PRT107上作为对照及效应载体(正向引物F13与反向引物R13)。

一、原生质体制备：

将培养2-3周的水稻苗从茎基部截断后，用刀片切成0.5mm薄片，将切好的水稻细条迅速转移入0.6M D-Mannitol溶液中，在常温下60-80rpm培养30min。

用滤布(Miracloth)过滤后，将水稻薄片转移入含有酶液的250mL三角瓶中(三角瓶需用锡箔纸包住，避免见光)。放入28℃摇床，在黑暗条件下60-80rpm酶解4-5h。(健康的原生质体为边缘清晰的圆形游离态)然后加入与酶液等体积的W5 Solution，用力摇晃15s，充分释放原生质体。用W5 Solution润洗灭菌过的网筛(35μm,100目),将酶解的原生质体通过网筛，过滤到新的50mL管。再用少量W5 Solution冲洗网筛，充分洗脱网筛上的原生质体。450g(大约1500rpm)离心3min(注意调整升降速为3)，小心去除上清。加入1mL W5 Solution重悬原生质体，并于450g离心3min。小心去除上清后，重悬原生质体于1mL MMg Solution中，使细胞的终浓度为1-5×10⁶cell/mL。

二、原生质体转化：

1)在2mL离心管中加入6μg效应载体、报告载体质粒及6μg对照、报告载体质粒，再加入100μL制备好的原生质体，并轻柔地吸打混匀。

2)加入110μL 40％PEG，并迅速轻柔混匀，勿使原生质体成团。

3)置于28℃水浴15min，加入1.8mL W5 Solution重悬，并终止反应。

4)将2mL离心管套在10mL离心管中，水平转子450g离心3min。

5)用移液器小心吸除上清后，重悬原生质体于750μL W5 Solution中。

6)转移原生质体到24孔细胞培养板里，用封口膜包好后，于28℃避光培养12-16h。

三、荧光素酶活性测定

450g离心3min，收集水稻原生质体，加入80μL SDS裂解原生质体提取蛋白，吸取相同体积上清液与新的1.5mL离心管中，通过双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行双萤光素酶报告基因检测。先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Fireflyluciferase)，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renillaluciferase)。在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来验证OsWRKY53是否可以抑制GA20ox1的转录活性。

如图14所示，OsWRKY53可以抑制OsGA20ox1的转录活性，抑制了50％左右。

正向引物F12：5'-GGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGTAGAAGAAGCGGGAGAAGAG-3'

反向引物R12：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCGGAGATATGATAGATGCAACC-3'

正向引物F13：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGGCGTCCTCGACGGGG-3'

反向引物R13：5'-TTTGCGGAGTACCCGGGTACCCTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'

实施例4：在不同背景下敲除OsWRKY53基因能够提高水稻孕穗期耐冷性

以黑龙江主栽水稻品种稻花香2号、龙稻16号为背景，获得了OsWRKY53基因的敲除突变体植株(w53-DHX、W53-LD16)。以其为实验材料，在水稻主蘖生长到水稻的剑叶与倒二叶叶枕距为-5～0cm(即花药处于减数分裂期至单核期)时对水稻进行15℃低温处理4天，然后转移回正常的生长条件，在成熟时统计主穗的总粒数、实粒数、结实率。

结果如图15、16、18、19，oswrky53突变体植株在稻花香2号及龙稻16号背景下相比于对照材料结实率显著提高。如图17、20所示，oswrky53突变体植株在稻花香2号及龙稻16号背景下相比于对照材料在低温处理4天后，相对结实率显著提高。稻花香2号、龙稻16号背景下的OsWRKY53基因敲除突变体植株相比于对照材料孕穗期耐冷性显著提高。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的应用

<160> 26

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F1

<400> 1

atcggctggagatgaagagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R1

<400> 2

cggctcatctcgtggcagta 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F2

<400> 3

aataccgccacatgggggaggt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R2

<400> 4

gtagtggttcagccgcatcacc 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F3

<400> 5

gacgattcacctcaacatgttccct 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R3

<400> 6

ggctctgcaggatgaaggtgaa 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F4

<400> 7

ggaggacggacaacgagat 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R4

<400> 8

gagtgcgggaactggaaga 19

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F5

<400> 9

agaccttcaacacccctgctatg 23

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R5

<400> 10

tcacgcccagcaaggtcg 18

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F6

<400> 11

ttctaggtctctctagagtaacatgaccttattgcggagttgtttgtccag 51

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R6

<400> 12

ctggacaaacaactccgcaataaggtcatgttactctagagagacctagaa 51

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F7

<400> 13

ttctaggtctctctagagtaacaaaaaattattgcggagttgtttgtccag 51

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R7

<400> 14

ctggacaaacaactccgcaataattttttgttactctagagagacctagaa 51

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F8

<400> 15

ttcctctgactcaaccgctcatgttgaccggccattttttttaaagaaaaag 52

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R8

<400> 16

ctttttctttaaaaaaaatggccggtcaacatgagcggttgagtcagaggaa 52

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F9

<400> 17

ttcctctgactcaaccgctcatgaaaaaaggccattttttttaaagaaaaag 52

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R9

<400> 18

ctttttctttaaaaaaaatggccttttttcatgagcggttgagtcagaggaa 52

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F10

<400> 19

ttgactttttagcacatgtttgaccgttcgtcttattcaaaaac 44

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R10

<400> 20

gtttttgaataagacgaacggtcaaacatgtgctaaaaagtcaa 44

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F11

<400> 21

ttgactttttagcacatgtaaaaaagttcgtcttattcaaaaac 44

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R11

<400> 22

gtttttgaataagacgaacttttttacatgtgctaaaaagtcaa 44

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F12

<400> 23

gggccccccctcgaggtcgacgtagaagaagcgggagaagag 42

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R12

<400> 24

cgctctagaactagtggatccggagatatgatagatgcaacc 42

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物F13

<400> 25

cgctctagaactagtggatccatggcgtcctcgacgggg 39

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R13

<400> 26

tttgcggagtacccgggtaccctagcagaggagcgactcgacg 43

Claims

1.水稻转录因子OsWRKY53在负调控水稻孕穗期耐冷性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于转录因子OsWRKY53基因负调控GA生物合成基因GA20ox1、GA20ox3、GA3ox1的转录。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于OsWRKY53基因过表达转基因水稻花粉育性变差和结实率下降。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于oswrky53突变体低温处理后花粉育性及结实率都高于野生型。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于oswrky53突变体花药中的GA含量高于野生型。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将转录因子OsWRKY53基因敲除，得到水稻孕穗期耐冷性能提高的转基因植物。