CN112588212A - 一种用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法 - Google Patents

一种用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，制备定向碳纳米管水凝胶模具，在两个载玻片的间隙沿着定向碳纳米管的方向往水凝胶模具中注入水凝胶前聚体；通过紫外照射固化水凝胶前聚体；将水凝胶模具放置于超纯水中，分离载玻片和经固化的水凝胶后，即得到定向碳纳米管复合的水凝胶薄膜；再在定向碳纳米管面上再铺一层生物相容性薄层。本发明的定向碳纳米管水凝胶薄膜具有良好的电传导特性，可用于心肌细胞的培养和检测，加强心肌细胞间电信号的传导，增加心肌细胞起搏率的一致性；具有可重复利用、成本低廉、可实现细胞生理传感等优点。

Description

一种用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备 方法
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种超顺定向碳纳米管水凝胶的制备方法，该水凝胶可应用于心肌细胞培养、生理信号转化、细胞实时检测传感等技术领域中。
背景技术
心脏是人体最重要的器官之一，其为全身器官、组织提供充足的血流量，维持器官、组织细胞的正常代谢和功能。心肌细胞的周期性收缩是心脏发挥功能的重要前提，如果心肌细胞有损，则会导致心脏功能缺陷。近年来，心脏病对人类威胁日益加重，针对心肌细胞药物的研发、筛选和评估成为生物医学领域急需解决的问题之一。
目前，药物开发主要通过体外细胞培养和动物体内实验，检测药物作用及其对细胞、组织、器官等生理结构的影响，综合评估药物效果。然而，体外细胞培养通常是平面二维培养，不能真实有效的模拟体内微环境和细胞生理状态，无法重现各组织和器官之间的复杂生理过程；动物体内实验也存在动物模型不确定性、种族差异性和人道主义因素的限制。因此，在细胞或组织水平上构建体外模型来模拟生理过程、进行药物筛选和评估已成为主流趋势。在心脏及心肌细胞的研究中，心肌细胞的收缩和跳动频率是极为重要的评测参数，是用于评价心肌细胞活性的重要指标。体外心脏芯片的构建是目前的一个热点研究方向，因其具有三维细胞培养环境、体内微环境可模拟性、体内组织器官功能可重现性等优点而受到广泛关注。其中，增加心肌细胞间信号传导、增强心肌细胞收缩一致性是心脏芯片研发过程中亟待解决的问题之一。因此，具有快速信号传导能力、实时反馈心肌细胞起搏和频率的传感材料仍有待开发。
受石墨烯及碳纳米管的良好电导率启发，我们构建了一种具有电信号快速传导的水凝胶薄膜，可用于心肌细胞的体外培养、起搏频率控制及细胞生理的检测传感。
发明内容
为了解决心肌细胞体外培养跳动节律不一、细胞间电信号传导受限的缺点，本发明提供了一种定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法及其心肌细胞培养方法。本发明通过碳纳米管的良好电导率实现心肌细胞间电信号的快速传导，实现心肌细胞起搏节律的统一。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用铺展有定向碳纳米管的载玻片作为水凝胶模具的底层，在底层载玻片的两侧放置具有一定厚度的间隔物，在两个间隔物上再搭上一片载玻片，得到水凝胶模具；
(2)在两个载玻片的间隙沿着定向碳纳米管的方向往水凝胶模具中注入水凝胶前聚体；通过紫外照射固化水凝胶前聚体；
(3)将水凝胶模具放置于超纯水中，分离载玻片和经固化的水凝胶后，即得到定向碳纳米管复合的水凝胶薄膜；
(4)在定向碳纳米管面上再铺一层生物相容性薄层，提高定向碳纳米管水凝胶的细胞粘附性。
步骤(1)中，以铺展有碳纳米管的载玻片为底层的水凝胶模具，其长度、宽度、高度根据需要选择；其中长度和宽度取决于铺展有碳纳米管的载玻片，高度取决于间隔物高度。
以铺展有碳纳米管的载玻片为底层的水凝胶模具的长度为0.5-7cm，宽度为0.5-2.5cm，高度为100-1000μm。
在铺展有定向碳纳米管的载玻片上，定向碳纳米管的层数为1-4层。
所述的定向碳纳米管为由酒精辅助铺展在载玻片上的超顺定向碳纳米管。
步骤(2)中，所述的水凝胶前聚体选自聚乙二醇双丙烯酸酯PEGDA、甲基丙烯酸酯化明胶GelMA、丙烯酰胺AAm、异丙基丙烯酰胺NIPAM、透明质酸中的一种或两种以上材料。
步骤(4)中，所述的生物相容性薄层选自甲基丙烯酸酯化明胶GelMA、层粘连蛋白laminin、基质胶matrigel中的一种。
本发明还保护所述方法制备的定向碳纳米管水凝胶薄膜。
本发明还保护定向碳纳米管水凝胶薄膜用于心肌细胞培养的方法，将制备的定向碳纳米管水凝胶薄膜用作心肌细胞培养基底，由于碳纳米管具有很好的导电性，可以增加心肌细胞间的电信号传导；当心肌细胞恢复自主跳动后，最先自主起搏的心肌细胞的电信号会通过碳纳米管迅速传递到整个基底上的心肌细胞中，从而得到统一心肌细胞起搏点及频率。
其中，心肌细胞种植密度为1*10^5-9*10^6个/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明以铺展有定向碳纳米管的载玻片为底层构建水凝胶模具，方法简单，操作方便，价格低廉，不需要很高的技术要求，且易对水凝胶薄膜的尺寸形貌进行控制。
(2)本发明制备的定向碳纳米管复合水凝胶，可以增加心肌细胞间的信号传导，统一心肌细胞体外起搏节律，增强心肌细胞收缩一致性，为心脏芯片提供优化的细胞培养基底。
(3)本发明制备的定向碳纳米管复合水凝胶，可以诱导心肌细胞定向生长，沿碳纳米管方向排列，进一步增加心肌细胞收缩一致性。
附图说明
图1：定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备过程示意图。
图中：1-铺展有碳纳米管的载玻片，2-间隔物，3-载玻片，4-组装成形的水凝胶模具，5-用于灌注的水凝胶前聚体溶液，6-紫外固化光源，7-制备得到的碳纳米管水凝胶薄膜。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
基于碳纳米管-甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)水凝胶薄膜的心肌细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)碳纳米管GelMA水凝胶薄膜的制备
将铺展有2层定向碳纳米管的玻片用玻璃刀切割成2cm*1cm大小，在碳纳米管两侧放置高度为200μm的间隔物后，在间隔物上再放置尺寸为2cm*1cm的载玻片，作为水凝胶模具。配置15％(w/v)的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)水溶液，加入1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2甲基苯丙酮)配置成水凝胶前聚体，将GelMA前聚体从模具间隙沿着碳纳米管排列方向注入模具，如图1所示。当GelMA前聚体灌满整个模具，使用365nm的紫外光照射45s，使GelMA水凝胶固化成形。将模具转移至盛有超纯水的烧杯中，用刀片撬开模具，分离玻片，得到厚度为200μm的碳纳米管GelMA水凝胶薄膜。
(2)基于碳纳米管GelMA水凝胶薄膜的心肌细胞培养
提取新生乳大鼠心肌细胞，配置成密度为10^6个/mL的细胞悬液。制备所得碳纳米管GelMA水凝胶薄膜经75％酒精浸泡、紫外照射充分灭菌后，将其放置在细胞瓶培养皿中，并加入心肌细胞悬液。待细胞贴壁后，用平头镊子轻轻夹起水凝胶薄膜，将其转移至新的培养皿中，每天更换预热的培养基。当心肌细胞恢复周期性收缩后，每天观察记录碳纳米管GelMA水凝胶薄膜上的心肌细胞起搏节律。
实施例2
基于碳纳米管-丙烯酰胺(AAm)水凝胶薄膜的心肌细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)碳纳米管AAm水凝胶薄膜的制备
将铺展有4层定向碳纳米管的玻片用玻璃刀切割成3cm*2cm大小，在碳纳米管两侧放置高度为500μm的间隔物后，在间隔物上再放置尺寸为3cm*2cm的载玻片。配置10％(w/v)的丙烯酰胺(AAm)水溶液，加入1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2甲基苯丙酮)配置成水凝胶前聚体，将AAm前聚体从模具间隙沿着碳纳米管排列方向注入模具。当AAm前聚体灌满整个模具，使用365nm的紫外光照射30s，使水凝胶固化成形。将模具转移至装有超纯水的烧杯中，撬开模具分离玻片，得到厚度为500μm的碳纳米管AAm水凝胶薄膜。将碳纳米管AAm水凝胶放置在载玻片上，碳纳米管面朝上。等待水凝胶表面的水分稍微晾干后，在碳纳米管上滴加8％(w/v)GelMA前聚体(含有1％v/v光引发剂)，用滴管将多余的GelMA前聚体吹离碳纳米管表面，只留薄薄的一层；用紫外固化90s后，得到可用于心肌细胞培养的碳纳米管AAm水凝胶薄膜。
(2)基于碳纳米管AAm水凝胶薄膜的心肌细胞培养
复苏由诱导多能干细胞分化的心肌细胞(iPSC-CMs)，配置成密度为8*10^5个/mL的细胞悬液。制备所得碳纳米管AAm水凝胶薄膜充分灭菌后，将其放置在细胞培养皿中，并加入细胞悬液。待细胞贴壁后，用平头镊子轻轻夹起水凝胶将其转移至新的培养皿中，每天半换液。当心肌细胞恢复周期性收缩后，每天观察记录碳纳米管AAm水凝胶薄膜上的心肌细胞起搏节律及跳动频率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采用铺展有定向碳纳米管的载玻片作为水凝胶模具的底层，在底层载玻片的两侧放置具有一定厚度的间隔物，在两个间隔物上再搭上一片载玻片，得到水凝胶模具；
(2)在两个载玻片的间隙沿着定向碳纳米管的方向往水凝胶模具中注入水凝胶前聚体；通过紫外照射固化水凝胶前聚体；
(3)将水凝胶模具放置于超纯水中，分离载玻片和经固化的水凝胶后，即得到定向碳纳米管复合的水凝胶薄膜；
(4)在定向碳纳米管面上再铺一层生物相容性薄层，提高定向碳纳米管水凝胶的细胞粘附性。
2.根据权利要求1所述的用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，以铺展有碳纳米管的载玻片为底层的水凝胶模具，其长度、宽度、高度根据需要选择；其中长度和宽度取决于铺展有碳纳米管的载玻片，高度取决于间隔物高度。
3.根据权利要求2所述的用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：以铺展有碳纳米管的载玻片为底层的水凝胶模具的长度为0.5-7cm，宽度为0.5-2.5cm，高度为100-1000μm。
4.根据权利要求1所述的用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：在铺展有定向碳纳米管的载玻片上，定向碳纳米管的层数为1-4层。
5.根据权利要求1所述的用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：所述的定向碳纳米管为由酒精辅助铺展在载玻片上的超顺定向碳纳米管。
6.根据权利要求1所述的用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的水凝胶前聚体选自聚乙二醇双丙烯酸酯PEGDA、甲基丙烯酸酯化明胶GelMA、丙烯酰胺AAm、异丙基丙烯酰胺NIPAM、透明质酸中的一种或两种以上材料。
7.根据权利要求1所述的用于心肌细胞培养的定向碳纳米管水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的生物相容性薄层选自甲基丙烯酸酯化明胶GelMA、层粘连蛋白laminin、基质胶matrigel中的一种。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的定向碳纳米管水凝胶薄膜。
9.权利要求8的定向碳纳米管水凝胶薄膜用于心肌细胞培养的方法，其特征在于：将制备的定向碳纳米管水凝胶薄膜用作心肌细胞培养基底，由于碳纳米管具有很好的导电性，可以增加心肌细胞间的电信号传导；当心肌细胞恢复自主跳动后，最先自主起搏的心肌细胞的电信号会通过碳纳米管迅速传递到整个基底上的心肌细胞中，从而得到统一心肌细胞起搏点及频率。
10.根据权利要求9的定向碳纳米管水凝胶薄膜用于心肌细胞培养的方法，其特征在于：心肌细胞种植密度为1*10^5-9*10^6个/mL。
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