CN112557360A - 用于高光谱成像的系统和方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于高光谱成像的系统和方法。一种高光谱成像系统包括：样本架，被配置为保持样本；光源，被配置为发射具有一个或多个波长的激发光；二维成像阵列；和光学系统。光学系统包括：第一光谱分离器，包括第一色散元件或第一衍射元件；和第二光谱分离器，包括第二色散元件或第二衍射元件。其中所述光学系统被配置为使用第一光谱分离器将所述激发光构造成在所述样品中的焦平面或所述焦平面的共轭平面处的光谱色散的二维激发图案；在所述焦平面内使用沿着第一方向色散的具有一个或多个波长的激发图案照射所述样本；从所述样本收集发射光；使用所述第二光谱分离器光谱色散所收集的发射光；以及将所收集的发射光聚焦提供给所述成像阵列，使得所收集的发射光沿着第二方向光谱色散，其中，第一方向不同于第二方向。

Description

用于高光谱成像的系统和方法

本申请是国际申请日为2017年5月27日、中国申请号为201780032763.6、发明名称为“用于4-D高光谱成像的系统和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求保护在2016年5月27日申请的美国临时申请第62/342,252和在2017年5月27日申请的美国非临时申请第15/607,457号的权益，并通过引用并入其内容。

技术领域

本公开总体上涉及成像领域以及显微镜学系统和方法。更具体地且不限于的是，所公开的实施例涉及通过使用空间光调制器和色散元件进行高光谱成像的系统和方法。

背景技术

高光谱成像是一种遥感光谱学方法，通常用于非医学应用，诸如材料鉴定、天文学、监视和地球物理应用。这是一种将成像的空间分辨率与光谱学的化学特异性组合起来的“成像光谱学”方法。从物体收集的光被色散到各个波长的光谱或窄光谱带中，并且在二维(two-dimensional，2-D)成像传感器上作为一组图像被检测，每个图像代表一个波长或光谱带。因此，由高光谱成像系统收集的数据集通常被称为高光谱立方，以三维(three-dimension，3-D)表示：两个空间方向(x方向和y方向)和一个光谱维度(λ)。

高光谱成像是一种新兴的医学应用技术，诸如疾病诊断和外科手术。生物组织具有能够反映其化学、生物物理和/或形态特性的内在和外在光学特征，诸如内源荧光和外源荧光。高光谱成像可用于研究活组织或组织分割中的生理和/或病理变化，并进一步提供关于组织健康或疾病的信息。例如，高光谱成像可以取代活组织检查作为数字病理工具。通常，冷冻分割活组织检查用于获得关于组织样本的信息，以供肿瘤外科医生在手术期间做出决定。这种活组织检查可能花费大约10到20分钟，并且采用快速染色方案，这使得特征清晰度比标准染色方法差。通过对来自组织样本的自体荧光进行成像并解析自体荧光的光谱特征，高光谱成像可以用作一种更快速的、可允许诊断准确性比冷冻分割活组织检查更高的组织病理学分析工具。此外，高光谱成像可以用作研究和临床试验的实验工具，诸如在免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色和荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)中的应用，其中用具有不同光谱特征的各种荧光团标注的分子针对特定的蛋白质和核酸。

高光谱立方的光谱维度中的信息通常反映荧光团或其他类型的光学标签在给定波长被激发时所发射的波长范围内的光强度。然而，如果光强度作为激发波长和发射波长两者的函数来测量，则可以更精确地识别荧光团、光学标签、荧光团标记分子和/或生物组织的光学特性。此外，在许多医疗应用中，可以使用具有不同光谱特征的各种类型的内在或外在标签，包括荧光团、拉曼标签、光致发光标签或量子点(quantum dot，QD)。测量组合的激发光谱和发射光谱可以增强区分、识别和表征给定类型或各种类型标签的不同标签的能力。

获取具有激发光谱和发射光谱两者的高光谱成像数据集通常极其耗时，因为有必要测量多种激发和发射波长下所发射的光的强度。例如，许多宽视场2-D荧光图像可以用不同的滤光器在收集路径上获取，每个滤光器在发射光谱中透射窄光谱带。为了获取额外的激发光谱，那么这个过程需要使用许多不同的激发激光器在不同的激发波长重复。此外，如果一次使用一个窄带滤光器，则大部分收集的荧光将被丢弃。因此，这个过程效率低下，甚至会导致样本中荧光团的光漂白，使得它们永远不能发荧光。因此，需要快速、高效和自动化的方法和系统以获取具有激发光谱和发射光谱两者的高光谱成像数据集。

发明内容

本公开的实施例包括用于实现允许获取具有激发光谱和发射光谱两者的高光谱成像数据集的高光谱成像的系统和方法。有利地，示例性实施例允许快速、高效和自动化地获取四维(four-dimensional，4-D)高光谱成像数据集，包括两个空间维度(水平方向x和垂直方向y)、一个激发光谱维度(λ_a)和一个发射光谱维度(λ_b)。

根据本公开的示例性实施例，描述了一种高光谱成像系统，包括：样本架，被配置为保持样本；光源，被配置为发射具有一个或多个波长的激发光；二维成像阵列；和光学系统，包括：第一光谱分离器，包括第一色散元件或第一衍射元件；和第二光谱分离器，包括第二色散元件或第二衍射元件；其中所述光学系统被配置为(i)使用第一光谱分离器将所述激发光构造成在所述样品中的焦平面或所述焦平面的共轭平面处的光谱色散的二维激发图案；(ii)在所述焦平面内使用沿着第一方向色散的具有一个或多个波长的激发图案照射所述样本；(iii)从所述样本收集发射光；(iv)使用所述第二光谱分离器光谱色散所收集的发射光；以及(v)将所收集的发射光聚焦提供给所述成像阵列，使得所收集的发射光沿着第二方向光谱色散，其中，第一方向不同于第二方向。

根据本公开的另一示例性实施例，描述了一种用于高光谱成像的方法，所述方法包括：从光源提供具有一个或多个波长的激发光；通过第一光谱分离器将来自所述光源的激发光构造成在样品中的焦平面或所述焦平面的共轭平面处的预定二维激发图案；光谱色散所述激发图案；在所述焦平面内使用沿着第一方向色散的具有一个或多个波长的激发图案照射所述样本；光谱色散从所述样本收集的发射光；和使用二维成像阵列对光谱色散的发射光进行成像，其中所述光谱色散的发射光被所述成像阵列聚焦地接收，使得所述光谱色散的发射光沿着第二方向光谱色散，其中第一方向不同于第二方向。

根据本公开的另一示例性实施例，描述了一种高光谱成像系统。该系统可以包括被配置为保持样本的样本架(sample holder)、照明系统和检测系统。

照明系统可以包括被配置为发射具有一个或多个波长的激发光的光源和第一组光学元件。第一组光学元件可以包括第一空间光调制器(spatial light modulator，SLM)、至少一个透镜和至少一个色散元件。照明系统可以被配置为将激发光构造成在样本中的焦平面的共轭平面处的预定二维图案，在第一横向方向上光谱色散所构造的激发光，以及用在第一横向方向上色散的具有一个或多个波长的激发图案照射样本。

检测系统可以包括二维成像器件和第二组光学元件。第二组光学元件可以包括至少一个透镜和至少一个色散元件。检测系统可以被配置为在第二横向方向上光谱色散从样本收集的发射光，并将光谱色散的发射光成像到成像器件。

根据本公开的另一示例性实施例，描述了一种用于高光谱成像的方法。该方法包括以下步骤：提供发射具有一个或多个波长的激发光的光源；通过第一空间光调制器(SLM)将来自光源的激发光构造成在样本中的焦平面的共轭平面处的预定二维图案；通过第一色散元件在第一横向方向上光谱色散所构造的激发光；用在第一横向方向上色散的具有一个或多个波长的激发图案照射样本；通过第二色散元件在第二横向方向上光谱色散从样本收集的发射光；以及将光谱色散的发射光成像到成像器件。

根据本公开的又一示例性实施例，描述了一种用于配置显微镜以获得样本的高光谱成像数据集的方法。该方法包括以下步骤：提供发射具有一个或多个波长的激发光的光源；通过第一空间光调制器(SLM)将来自光源的激发光构造成在样本中的焦平面的共轭平面处的预定二维图案；通过第一色散元件在第一横向上光谱色散所构造的激发光；用在第一横向方向上色散的具有一个或多个波长的激发图案照射样本；通过第二色散元件在第二横向方向上光谱色散从样本收集的发射光；以及将光谱色散的发射光成像到成像器件。

所公开的实施例的附加特征和优点部分将在下面的描述中阐述，部分将从描述中显而易见，或者可以通过实践所公开的实施例来了解。所公开的实施例的特征和优点将通过所附权利要求中特别指出的元件和组合来实现和获得。

应该理解的是，前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例和说明性的，而不是对所要求保护的公开实施例的限制。

附图构成本说明书的一部分。附图示出本公开的几个实施例，并且与说明书一起用于解释所公开的实施例的原理，如所附权利要求中所阐述的。

附图说明

图1是根据本公开实施例的用于获取高光谱成像数据集的示例性方案的图示。

图2是根据本公开实施例的用于获取高光谱成像数据集的另一示例性方案的图示。

图3是根据本公开实施例的示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图4是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图5是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图6是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图7是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图8是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图9是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图10是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图11是根据本公开实施例的另一示例性高光谱成像系统的示意图表示。

图12是根据本公开实施例的示例性衍射元件的示意图表示。

图13是根据本公开实施例的另一示例性衍射元件的示意图表示。

图14是根据本公开实施例的用于高光谱成像的示例性方法的流程图。

具体实施方式

所公开的实施例涉及用于实现允许获取具有激发光谱和发射光谱两者的高光谱成像数据集的高光谱成像的系统和方法。本公开的实施例可以使用具有一个或多个2-D成像器件(例如，CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合器件)或CMOS(Complementary MetalOxide Semiconductor，互补金属氧化物半导体)传感器或相机)的显微镜来实现，诸如荧光显微镜、共焦显微镜(具有沿着至少一个维度的共焦)、透射显微镜(transmissionmicroscope)或反射显微镜。或者，根据本公开的实施例，可以使用合适的光学元件来构建光学系统。

不是使用为每个激发波长获取高光谱立方的耗时过程，本公开的实施例允许获取与样本上的区域子集的多余一个的激发波长相对应的发射光谱的2-D图像。可以获取和从计算方面重建多个2-D图像，以获得样本的4-D高光谱成像数据集。

根据本公开的一方面，具有一个或多个波长的激发光可用于激发样本中的荧光团。激发光可以由发射具有一个或多个波长的光的多色光源生成。在一些实施例中，多色光源可以具有连续光谱。例如，多色光源可以是宽带光源，诸如超连续光谱激光器、白色光源(例如高压汞灯、氙灯、卤素灯或金属卤化物灯)或一个或多个LED。在其他实施例中，多色光源可以具有离散光谱。例如，多色光源可以是发射具有窄光谱的光的脉冲的或连续的“单波长”激光器的组合。

根据本公开的一方面，由光源发射的激发光可以被构造，以用于使用空间光调制器(SLM)、用激发图案来激发样本上的区域子集。为了构造激发光，SLM可以通过选择性地启动或切换其像素来调制激发光的相位或幅度。在一些实施例中，SLM可以选自包括数字微镜器件(digital micromirror device，DMD)、衍射光学元件、液晶器件(liquid crystaldevice，LCD)和硅上液晶(liquid crystal-on-silicon，LCOS)器件的一组SLM。

根据本公开的一方面，所构造的激发光可以在第一横向方向(例如，垂直方向y或水平方向x)上光谱色散。激发光的光谱色散可以在第一横向方向上隔开或分裂激发光光谱的一个或多个波长。在一些实施例中，至少一个色散元件可用于在激发光用激发图案照射样本之前光谱色散该激发光。至少一个色散元件可以是衍射光栅或棱镜，或者一个或多个棱镜的组合。因此，可以生成光谱色散的激发图案在不同空间位置照射样本上的区域。

样本中的荧光团或其他类型的光学标签可以被照射样本的激发光激发。当它们松弛到基态时，荧光团或光学标签可以发射一个波长范围(称为发射光谱)内的光。荧光团或光学标签可以具有与激发光的不同波长相对应的不同发射光谱。

如本文所述，荧光团在本公开中用作示例性光学标签。参考荧光团的描述同样适用于符合本公开实施例的其他类型的光学标签。例如，从光源发射的激发光也可以激发其他类型的光学标签，这些光学标记在激发时可以发射具有发射光谱的光。因此，在本公开的描述中使用的荧光和荧光发射光谱也可以用于表示其他光学标签的发射光和发射光谱。

根据本公开的一方面，在样本的给定区域中由激发光激发的荧光团发射的荧光可以在第二横向方向(例如，水平方向x或垂直方向y)上光谱色散。至少一个色散元件可用于将荧光光谱色散成与在该给定区域的激发波长相对应的荧光发射光谱。样本上的区域子集的荧光发射光谱可以在一次曝光中通过2-D成像器件被作为2-D图像获取。

根据本公开的一方面，可以通过在第一和第二横向方向上扫描光谱色散的激发图案并在激发图案的每个空间位置获取荧光发射光谱的2-D图像，来获取样本上或视场上所有区域的荧光激发和发射光谱。

在一些实施例中，通过调制SLM的像素来扫描样本或视场上的激发图案。在其他实施例中，x-y平移台可用于通过在第一和第二横向方向上移动样本或衍射光栅来横向扫描样本或视场上的激发图案。该平移台可以是机动平移台、压电平移台或允许横向线性运动的任何合适的台。

有利地，4-D高光谱成像数据集可以根据发射光谱的2-D图像计算重建，每个2-D图像与样本上不同空间位置的激发图案相对应。

在一些方面，根据本公开的系统和方法允许共焦光学分割。这可以允许沿着样本的轴向为多个焦平面获取高光谱成像数据集。根据本公开的一方面，可以通过在与所选焦平面共轭的平面处实现一个或多个光学针孔来获取焦平面的高光谱成像数据集。光学针孔可以是一个或多个空间针孔，或者由第二SLM的像素形成的可编程人工针孔。

有利地，可以通过改变由SLM形成的人工针孔的尺寸和/或间距来根据需要调节共焦度(degree of confocality)。另外，由SLM通过选择性地调制或切换其像素以匹配激发光的激发图案来形成针孔图案。针孔图案可以有利地允许由激发图案同时照射的样本上的多个区域的共焦成像。与使用顺序逐点扫描的传统共焦显微镜相比，这可以提高在焦平面获取样本上的高光谱成像数据集的速度和/或吞吐量。

现在将详细参考本公开的实施例和各方面，其示例在附图中示出。在可能的情况下，在所有附图中将使用相同的附图标号来指代相同或相似的部件。

如本文所述，为了示出不同波长或频率的光，在附图中使用不同密度的点状纹理。较高的密度对应于较长波长或较低频率的光。另外，垂直和水平方向被用作示出第一和第二横向方向的示例。或者，水平方向可以是第一横向方向，垂直方向可以是第二横向方向。如本文所述，任何两个合适的不同方向或一对非平行的(例如，正交的)方向可以用作第一和第二横向方向。

用于获取高光谱成像数据集的示例性方案

图1图示了用于获取由本公开的方法和系统使用的高光谱成像数据集的示例性方案。如图1所示，具有离散光谱的激发光以激发图案100照射到样本上。激发图案100可以包括激发点的2-D阵列。例如，图1示出了圆形激发点的示例性2-D阵列的一部分。阵列的附加点可以位于示例性阵列的上方、下方、左侧和/或右侧(未示出)。如本文所述，阵列的合适尺寸和点的合适形状、尺寸和/或间距可以根据应用预先确定。

激发光的离散光谱包括多个离散波长或多个窄光谱带。因此，当激发光被色散元件沿着给定横向方向光谱色散时，激发图案100可以被光谱色散，使得不同波长的光被引导到给定横向方向上的不同位置。例如，如图1所示，激发图案100可以包括多个扫描单元110，例如，扫描单元110的2-D阵列。当激发光沿着垂直方向光谱色散时，每个扫描单元110可以包括多个激发点112a、112b、112c、112d、112e和112f，这些激发点彼此垂直偏移，并且与由光谱色散生成的激发光的不同激发波长相对应。

激发点之间的垂直间距可以是均匀的，也可以不是均匀的，并且可以由各种因素来预先确定，诸如激发波长、点的尺寸和激发光的色散量。扫描单元110中垂直色散的激发点的总数可以取决于激发光的离散波长或窄光谱带的数量。

为了在样本上生成给定空间位置的激发光谱，可以在垂直方向上扫描如图1所示的光谱色散激发图案100，使得与不同激发波长相对应的激发点可以移位到该给定空间位置。例如，当激发图案100在垂直方向上移位时，先前由激发点112a、112b、112c、112d、112e和112f照射的每个扫描单元110中的区域可以由这些激发点中的不同激发点照射。例如，通过在一个激发点上移位激发图案100，由激发点112a照射先前由激发点112b照射的区域，由激发点112c照射先前由激发点112b照射的区域，由激发点112d照射先前由激发点112e照射的区域，由激发点112e照射先前由激发点112f照射的区域，并且从位于上方的扫描单元(未示出)移位的激发点112f照射先前由激发点112a照射的区域。

每个扫描单元110内的区域可以通过在垂直和水平方向上移位光谱色散的激发图案100来扫描。例如，通过在垂直方向上在扫描单元110的长度上移位激发图案100，扫描单元110中的给定区域可以由与光源的不同激发波长相对应的不同激发点照射。通过在扫描单元110的长度上以连续方式或以预定间距垂直和/或水平地(例如，基于期望的垂直和/或水平分辨率)移位激发图案100，扫描单元110中的每个给定区域可以由不同的激发点照射。

如图1所示，激发图案100的激发点在给定周期在水平方向上隔开。有利的是，激发点在水平方向上的周期性间距允许测量样本上激发区域的荧光发射光谱。例如，来自由激发点照射的给定区域的所发射的荧光可以在水平方向上光谱色散，而不与另一区域的所发射的荧光重叠。因此，由激发点同时照射的多个区域的荧光发射光谱可以由2-D成像传感器或器件生成和获取。

图1示出了荧光发射光谱的2-D图像200，其中激发波长(λ_a)以垂直方向表示，发射波长(λ_b)以水平方向表示。图1图示出，在2-D图像200中，由与不同激发波长相对应的激发点112a、112b、112c、112d、112e和112f激发的区域可以生成不同的荧光发射光谱212a、212b、212c、212d、212e和212f，这些光谱在水平方向上延伸并且在垂直方向上相应地彼此偏移。因此，可以在2-D图像200中获取多个荧光发射光谱，每个发射光谱与样本上不同空间位置的激发图案100的激发点相对应。

如上所述，每个扫描单元110中的不同区域可以通过在垂直和水平方向上横向地空间移位激发图案100来照射。在激发图案100的每个空间位置，可以在2-D图像200上获取照射区域的荧光发射光谱。因此，可以对应于一系列彼此横向移位的激发图案100来获取荧光发射光谱的多个2-D图像200。

通过组合获取的2-D图像200的数据集，可以为2-D图像200中的每个像素或空间位置获取荧光激发-发射矩阵(excitation-emission matrix，EEM)。荧光EEM可以将荧光强度记录或显示为多个激发波长和发射波长范围的函数。因此，具有激发光谱和发射光谱两者的样本的4-D高光谱成像数据集可以从获取的2-D图像200中收集和重建。

图2图示了用于通过本公开的方法和系统获取高光谱成像数据集的另一示例性方案。如图2所示，当激发光具有连续光谱并且被色散元件沿着垂直方向光谱色散时，激发光的聚焦点可以光谱色散成沿着垂直方向的连续激发线。在这种情况下，如图2所示，激发图案100可以光谱色散成激发线114的2-D阵列，每个激发线表示以连续方式垂直偏移的激发光的波长范围。

图2示出了激发线114的示例性2-D阵列的一部分，其示出了3×3的2-D阵列。该阵列的其它激发线可以位于示例性阵列的上方、下方、左侧和/或右侧(未示出)。如本文所述，可以根据给定的应用选择阵列的合适尺寸、激发线的合适形状、尺寸和/或间距。

每个扫描单元110内的区域可以如上所述通过在垂直和水平方向上移位光谱色散的激发图案100来类似地扫描。可以类似地在2-D图像200上获取与激发图案100的激发线114的阵列相对应的荧光发射光谱214的阵列。2-D图像200中的每个荧光发射光谱214与由激发图案100的激发线114照射的样本上的连续条带相对应。

在图2所示的方案中，在一些实施例中，当在垂直方向上移位光谱色散的激发图案100时，在垂直移位之后，沿着激发线114以第一波长激发的区域然后可以以比第一波长更长或更短的第二波长激发。因此，通过以连续方式或以预定间距垂直地(例如，基于所需垂直分辨率)移位激发图案100，可以光源的不同激发波长来照射由每个扫描单元110中的激发线114照射的区域。类似于图1所示的方案，每个扫描单元110中的样本上的其他区域可以通过在水平方向上移位激发图案100而被不同的激发线照射。

如本文所述，由激发图案100照射的样本上的区域可以基本上由激发图案100的激发点或激发线的尺寸和形状来确定。激发点或激发线的尺寸和形状可以由光学系统的许多因素来确定，包括SLM的像素的尺寸和形状、光学系统的放大倍数以及激发光的光谱色散程度。

激发图案100的激发点或线之间的水平和/或垂直的空间间距可以基于各种因素来预先确定，诸如激发波长、样本的尺寸、光学系统的视场、期望的测量吞吐量、空间分辨率和/或速度、以及激发光和/或所发射的荧光的光谱色散量。

例如，可以基于激发光的光谱色散量来预先确定激发点或线之间在垂直方向上的空间间距，使得激发点或线在垂直方向上不重叠。可以基于水平方向上的荧光发射光谱的范围来预先确定激发点或线之间在水平方向上的空间间距，使得荧光发射光谱在水平方向上彼此不重叠。

在一些实施例中，不同波长的激发点阵列的水平和/或垂直周期可以是相同的。在其他实施例中，不同波长的激发点阵列的水平和/或垂直周期可以不同。在某些情况下，不同的空间周期对于计算重建4-D高光谱成像数据集可能是方便的，例如，在SLM被放置在样本的傅立叶平面处以生成激发图案100的情况下，如下文进一步描述的。

下面参考光学系统和/或组件的示意图表示描述的实施例涉及用于实现用于获取4-D高光谱成像数据集的上述方案的系统和方法。示意图表示应理解为没有按比例绘制。

示例性光学系统和组件

图3是示例性高光谱成像系统300的示意图表示。在一些实施例中，系统300可以是荧光显微镜、透射显微镜、或反射显微镜、或共焦荧光显微镜(具有沿着至少一个维度的共焦性)。本公开的实施例可应用于用于执行高光谱成像的其它合适的显微镜学技术。

如图3所示，系统300可以包括照明系统和检测系统，每个系统都具有多个组件。照明系统可以包括光源310、第一SLM 320a、至少一个透镜(例如，透镜330a)和至少一个色散元件(例如，色散元件340a)。检测系统可以包括2-D成像器件380、至少一个透镜(例如，透镜330b)和至少一个色散元件(例如，色散元件340b)。根据其布局、几何形状和/或应用，系统300可以进一步包括分束器350、物镜360、偏振器390a和/或放置待成像样本的样本架370。系统300可以进一步包括其他光学元件，诸如反射镜、光束收集器(beam dump)等。

如本文所述，系统300的光轴可限定激发光和来自样本的所发射的荧光通过系统300传播的路径。

在照明系统中，如图3所示，光源310发射激发光402，该激发光402被引导到SLM320a。激发光402可以使用一个或两个透镜(未示出)准直和/或扩展。SLM 320a可以经过通过选择性地致动或切换激发光402的像素来调制激发光402的相位或幅度，来构造激发光402。SLM 320a的像素的至少一部分反射激发光402并将其沿着系统300的光轴引导。

如图3所示，所反射的激发光404透射通过透镜330a和色散元件340a。透镜330a可以沿着光轴准直所反射的激发光404。色散元件340a沿着第一横向方向光谱色散所反射的激发光404。例如，色散元件340a可以对反射的激发光404引起小的波长相关的角度偏转。光谱色散的激发光406可以被分束器350反射并被引导到物镜360。物镜360然后将光谱色散的激发光406聚焦到放置在样本架370上的样本上。

在检测系统中，如图3所示，由样本中激发荧光团发射的荧光被物镜360收集和/或准直。荧光408沿着系统300的光轴透射通过分束器350和色散元件340b。色散元件340b如上所述沿着第二横向方向光谱色散荧光408。光谱色散的荧光410透射通过透镜330b并由2-D成像器件380获取。成像器件380可以放置在离透镜330b大约一个焦距的地方，使得透镜330b可以将光谱色散的荧光410成像并聚焦到成像器件380的2-D传感器上。

使用额外的光学元件，诸如反射镜、透镜等，系统300的其他配置也是可能的。如下面进一步描述的。

下面详细描述系统300的各种组件的功能和工作原理。

光源

如上所述，光源310可以具有连续光谱或离散光谱。光源310可以是白色光源，诸如超连续光谱激光器，或者具有离散窄光谱带的“单波长”激光器的组合。在一些实施例中，由光源310发射的激发光402可以直接引导到SLM 320a。在其他实施例中，激发光402可以在入射到SLM 320a上之前被透镜准直和/或扩展。附加地或可替代地，激发光402可以使用漫射器或去斑元件漫射，以减少相干照射的光斑效应。

在一些实施例中，光源310可操作地连接到具有处理器和存储指令或操作步骤的计算机可读介质的控制器(未示出)。当由处理器执行时，这些指令或步骤调制光源310的操作状态。例如，处理器可以激活或停用光源310，当光源310是脉冲光源时调制脉冲的持续时间，和/或切换或调谐光源310的发射波长。

用于调制激发光的空间光调制器

如上所述，为了构造激发光402以用于以激发图案100照射样本，SLM320a可以通过选择性地在操作状态之间调制激发光402的像素来调制激发光402的幅度或相位。

幅度调制

在一些实施例中，激发光402的幅度可以由SLM 320a调制。例如，SLM320a可以是具有多个微镜的阵列(未示出)的数字微镜器件(DMD)。这些反射镜可被单独致动以在两个操作位置(“开”位置和“关”位置)之间切换。当微镜被配置为处于“开”位置时，激发光402被反射以沿着光轴传播，作为被引导到样本的所反射的激发光404。当微镜被配置为处于“关”位置时，激发光402被朝向偏离光轴的方向反射，并且不被引导到样本(未示出)。在一些实施例中，由“关”微镜反射的激发光402可以被引导到其他光学元件，诸如反射镜或光束收集器(未示出)。

在一些实施例中，微镜为边长范围从大约几微米到大约10μm的正方形。微镜的其它形状和尺寸也是可能的，并且可以适当地使用。DMD通常能够非常快速地改变或交替微镜的“开”和“关”位置。

在一些实施例中，DMD的单个微镜可以被称为单个像素。在其他实施例中，多个微镜可以被称为单个像素。例如，一组紧邻的微镜可以被称为单个像素，并且可以被调制或致动到相同的位置。

幅度调制图案可以由处于“开”位置的DMD的微镜或像素形成。幅度调制图案可以通过透镜330a和物镜360成像到样本上作为激发图案100。例如，透镜330a用作管透镜，并与物镜360组合以形成成像配置。DMD被放置在样本的共轭平面上或者透镜330a之前大约一个焦距处。取决于透镜330a和物镜360的焦距，激发图案100可以是幅度调制图案的放大或缩小图像。

在其他实施例中，为了调制激发光402的幅度，SLM 320a可以是液晶器件(LCD)或硅上液晶(LCOS)器件。SLM 320a的像素可以通过操纵入射到像素上的光的偏振来创建幅度调制图案。类似于DMD，LCD或LCOS器件可以放置在样本的共轭平面上。LCD或LCOS器件的像素可以按一个像素接一个像素的方式在“开”状态和“关”状态之间进行电调制。“开”像素可以将线性偏振光的定向旋转大约90°，而“关”像素不执行旋转。在这种情况下，第一线性偏振器(未示出)可用于线性偏振激发光402。第二线性偏振器或偏振分束器(polarizingbeamsplitter，PBS)(未示出)可用于透射由“开”像素反射的激发光404，并阻挡由“关”像素反射的激发光402。

使用SLM 320a调制激发光402的幅度的缺点是调制期间光的损失。这是因为SLM320a的大部分像素通常处于“关”状态。因此，大部分激发光402被转向远离光轴，不会到达样本，且因此会丢失。激发光再循环系统可用于通过将离开光轴的激发光重定向回光轴来减少这种损失，如下面进一步描述的。

相位调制

在一些实施例中，激发光402的相位可以由SLM 320a调制。SLM 320a可以是反射型LCD或LCOS器件。图4是使用LCD或LCOS器件作为SLM320a的示例性系统300的示意图表示。如图4所示，LCD或LCOS器件可以靠近样本的共轭平面322放置。自定义相位调制图案可以由LCD或LCOS器件的像素形成。相位调制图案可以创建离轴透镜相位分布的阵列。激发光402的波前然后可以被相位调制图案调制，并在共轭平面322处形成初步激发图案(例如，衍射图案)。该初步激发图案可以是激发图案100的放大或缩小图像，并且可以包括聚焦点的阵列。

共轭平面322可以位于SLM 320a之外的短距离处。初步激发图案的聚焦点的焦平面可以是波长相关的。因此，不同波长的激发光402可能不会全部聚焦在共轭平面322上。在一些实施例中，激发光402的中心波长的焦平面大约在共轭平面322处。然后通过透镜330a和物镜360将在共轭平面322处或附近形成的初步激发图案成像到样本上作为激发图案100。尽管在该配置中不同波长的激发图案100可能具有略微不同的焦平面，但是与幅度调制相比，调制激发光402的相位增加了使用激发光402的效率。

在其他实施例中，LCD或LCOS器件可以放置在孔径平面上，该孔径平面可以是物镜360的后孔径的共轭平面或者样本的傅立叶平面。例如，系统300的一个示例性配置可以具有放置在SLM 320a和物镜360之间的两个管透镜(未示出)。第一管透镜可以位于SLM 320a后面大约一个焦距处。第二管透镜可以位于第一管透镜后面大约两个焦距处。物镜360可以位于第二管透镜后面大约一个焦距处。

LCD或LCOS器件的像素可以形成自定义相位调制图案来调制激发光402的波前。在LCD或LCOS器件反射激发光402时，反射的激发光404的波前的不同位置处的相位可以根据相位调制图案选择性地改变。在一些实施例中，LCD或LCOS器件的像素可以按一个像素接一个像素的方式在“开”状态和“关”状态之间进行电调制。如果LCD或LCOS器件的像素处于“开”状态，则它们可以通过改变液晶中行进的光的光路长度来改变所反射的光的相位；并且如果它们处于“关”状态，它们可能不会改变所反射的光的相位。这允许根据需要对由像素形成的相位调制图案进行数字自定义。在其他实施例中，LCD或LCOS器件的像素可以具有多种状态或调节等级(例如，256个等级)，并且可以被单独调制到期望的状态或等级。有利地，增加像素的调节状态或等级增加了相位调制图案的调节的连续性，从而增加了激发光402的相位的调节。

相位调制可以呈现具有不同方向和/或相位的所反射的激发光404的小波。当所反射的激发光404沿着光轴传播时，管透镜和物镜360中的每一个可以对所反射的激发光404的波前执行傅立叶变换。然后，可以在物镜360的焦平面上形成衍射图案。当照射在样本上时，该衍射图案在本文中被称为激发图案100。

在上述配置中，因为相位调制图案在样本的傅立叶平面处或大约在样本的傅立叶平面处，所以相位调制图案是照射在样本上的期望激发图案100的傅立叶逆变换。因为傅立叶变换包括与光的波长成比例的比例因子，所以激发图案100中不同波长的激发点阵列的空间周期可以不同。例如，较长的波长会以较大的角度衍射，这可以转换成较大的空间周期。这可能导致在2-D图像200中获取的相应荧光发射光谱阵列具有不同的空间周期。自定义的计算机算法可用于生成时变相位调制图案，用于扫描整个视场和/或用于根据这种2-D图像的数据集来计算重建4-D高光谱成像数据集。

有利地，调制激发光402的相位可以允许其在LCD或LCOS器件的近场中以基本均匀的强度传播，从而减少光的损失。调制的激发光然后可以在远场中的样本上形成可自定义的或可编程的激发图案100。因此，与如上所述调制激发光402的幅度相比，调制激发光402的相位以创建激发图案100可以通过减少激发光402的损失来显著提高系统300的照射效率。另外，增加激发光402的相位调制的连续性可以进一步增加LCD或LCOS器件的衍射效率，从而增加系统300的照射效率。

可替代地，用于调制激发光402的幅度或相位的LCD或LCOS器件可以是沿着光轴实施的透射型器件。照明系统的几何形状可以适当地设计成使得由器件的像素形成的幅度或相位调制图案可以如上所述地调制激发光402的幅度或相位。

无论SLM 320a调制激发光402的幅度还是相位，都可以根据需要通过按一个像素接一个像素的方式在两个或多个操作状态或等级之间调制SLM320a的像素来编程和自定义激发图案100。此外，通过扫描或移位SLM 320a的像素的调制，激发图案100可以在给定的空间方向上(诸如水平或垂直方向)平移或移位。这有利地允许在不使用x-y平移台移动样本和/或样本架370的情况下扫描系统300的视场上的激发图案100。

在一些实施例中，根据SLM 320a的像素的类型和调制特征，激发光402可以相对于SLM 320a的平面以预定角度引导到SLM 320a。预定角度可以取决于SLM 320a的类型和/或系统300的几何形状。在一些情况下，当SLM320a是调制激发光402的相位的反射型SLM时，激发光402可以以一定角度被引导到SLM 320a，使得所反射的激发光404沿着系统300的光轴传播。在其他情况下，当SLM 320a是DMD时，激发光402可以以一定角度被引导到DMD，使得由“开”微镜反射的激发光404沿着光轴传播。

在一些实施例中，SLM 320a可操作地连接到具有处理器和存储指令或操作步骤的计算机可读介质的控制器(未示出)。当由处理器执行时，这些指令或步骤调制SLM 320a的像素的操作状态，以形成期望的激发图案100和/或以在整个视场的预定距离上、在期望的空间方向上平移激发图案100。

透镜和物镜

系统300的各种透镜，诸如透镜330a和330b，可以是消色差的，诸如消色差的双透镜或三透镜，以限制或减少系统的色差和/或球面像差的影响。此外，系统300的物镜360可以是消色差的。可替代地或附加地，物镜360可以是无限校正物镜(infinity-correctedobjective)，使得物镜360可以形成从其后孔径进入的准直光束的期望焦点(例如，聚焦点或聚焦图案)。使用消色差透镜和/或消色差或无限校正物镜可以允许不同波长的激发光402在样本中具有至少近似相同的焦点。此外，使用消色差透镜和/或消色差物镜可以允许来自样本中的焦平面的不同波长的荧光类似地在成像器件380处形成聚焦图像。因此，使用消色差透镜和/或消色差物镜可以提高荧光发射光谱的2-D图像200的质量，从而提高所重建的高光谱成像数据集的质量。

色散元件

色散元件340a和340b可以是衍射光栅或棱镜，诸如非偏离棱镜(例如，Amici棱镜或双Amici棱镜)。色散元件340a和340b的类型可以相同或可以不同。由色散元件340a和340b引起的色散程度可以相同或不同，并且可以基于各种因素来预先确定，诸如激发光和荧光的光谱范围、样本或视场的尺寸、成像器件380的尺寸、期望的光谱分辨率以及系统300的应用。

在一些实施例中，由色散元件340a和340b引起的色散程度可以是可调的。例如，色散元件340a可以是沿着系统300的光轴放置的一对双Amici棱镜。该对双Amici棱镜中的至少一个可围绕光轴相对于另一个旋转。双Amici棱镜相对于彼此的旋转可以允许连续控制激发光402的光谱色散的量和/或角度定向。类似地，色散元件340b可以是一对双Amici棱镜，允许连续控制荧光408的光谱色散的量和/或角度定向(例如，色散角)。

激发光阻挡

因为激发光402的强度可以比荧光408强几个数量级，所以被样本和/或样本架370反射和/或散射的激发光402可以进入检测系统并影响成像器件380对荧光发射光谱的检测或获取。因此，本公开的实施例可以减少或阻挡激发光402传播到检测系统中，如下所述。

在一些实施例中，分束器350可用于拒绝或阻挡激发光402传播到检测系统中。例如，系统300的分束器350可以是二向色分束器、偏振分束器(PBS)或其他合适类型的分束器。

当光源310或激发光402具有具有一个或多个离散波长或窄光谱带的离散光谱时，分束器350可以是根据其波长选择性地反射和透射光的二向色分束器。例如，分束器350可以是具有多个截止波长和通带的多频带二向色分束器(multiband dichroic)。可以选择多频带二向色分束器以基本反射激发光402的波长并基本透射荧光408的波长。在这种情况下，与激发光402的波长相同或接近的荧光408的一些波长可以被基本阻挡，因此可以在成像器件380获取的2-D图像200中具有基本降低的强度。

可替代地或附加地，当光源310或激发光402具有离散光谱时，一组对应的陷波滤光器或单个多陷波滤光器(未示出)可以沿着光轴被添加到检测系统中。陷波滤光器或多北滤光器(multi-north filter)可以选择性地反射激发光402的离散波长或窄光谱带，从而阻档激发光402到达成像器件380。同样，与激发光402的波长相同或接近的荧光408的一些波长可以被陷波滤光器基本阻挡，因此可以在成像器件380获取的2-D图像200中具有基本降低的强度。

当光源310或激发光402具有连续光谱时，分束器350可以是长通二向色分束器，其反射激发光402的至少一部分波长并透射荧光408的至少一部分波长。激发光402的光谱通常从紫外光到可见光光谱，荧光408的光谱通常从可见光到近红外光光谱。因此，长通二向色分束器可以阻挡激发光402的波长并透射荧光408的波长。然而，在一些情况下，激发光402的光谱和荧光408的光谱都可以包括短波长到长波长，并且它们可以重叠，例如，在可见光光谱中。在这种情况下，长通二向色分束器可以阻挡可见光光谱中的至少一些荧光408，例如，在荧光408的被阻挡的光谱包含期望光谱信息的应用中可能不适合于拒绝激发光402。

不管光源310或激发光402的光谱类型如何(无论是离散还是连续)，在一些实施例中，偏振器390a和分束器350可以组合使用以阻档激发光402进入检测系统，从而阻档其向成像器件380传播。例如，分束器350可以是偏振分束器(PBS)，其反射振动定向与偏振器390a的透射轴对准的光。

例如，偏振器390a可以沿着光轴放置在任何合适的位置，以线性偏振激发光402。PBS可以被选择成反射具有与偏振激发光相同的振动定向的光，并且透射具有垂直于偏振激发光的振动定向的光。因此，由物镜360收集的大部分激发光将从该PBS反射，并且不会到达成像器件380。在一些情况下，样本和物镜360都可以将所反射和/或所散射的激发光去偏振到很小的程度，从而不希望地允许一些激发光透射通过PBS并进入检测系统。

2-D成像器件

成像器件380可以包括位于与样本中所选焦平面共轭的图像平面的合适的2-D传感器。该传感器可以用CMOS传感器、CCD传感器、2-D硅雪崩光电二极管(avalanchephotodiodes，APD)阵列、电子倍增CCD(electron-multiplied CCD，EMCCD)、增强型CCD或其他合适类型的2-D传感器来实现。

成像器件380可操作地连接到控制器或控制其操作的计算器件(未示出)。例如，控制器(未示出)可以具有处理器和存储指令或操作步骤的一个或多个计算机可读介质。当由处理器执行时，指令或操作步骤可以操作成像器件380的曝光，获取2-D图像200，和/或将2-D图像200的数据集存储到存储器中。计算机可读介质还可以存储指令或操作步骤，当由处理器执行时，这些指令或操作步骤执行所获取的2-D图像数据集的数据处理和/或根据2-D图像数据集重建4-D高光谱图像数据集。

系统300可以有利地具有额外的技术特征和能力，以增强其功能和性能，如下面详细描述的。

时间分辨能力

在一些实施例中，时间分辨能力可以有利地添加到系统300中，以允许荧光寿命成像(fluorescence lifetime imaging，FLIM)或时间分辨荧光光谱。例如，脉冲光源(诸如超连续光谱激光器)可以与具有皮秒至纳秒时间选通能力的2-D成像器件380(诸如增强型CCD相机或光电条纹相机)一起用作光源310。或者，传统的2-D CCD或CMOS传感器可以与电光快门组合使用。在一些实施例中，调制的电子倍增荧光寿命成像显微镜(electron-multiplied fluorescence lifetime imaging microscope，MEM-FLIM)相机可以与调制的光源310(例如，脉冲光源)组合使用。

样本中荧光团或荧光分子的寿命可以根据所获取的视场中每个空间位置的荧光发射光谱的时间分辨2-D图像来计算。这将另一个维度的信息添加到高光谱成像数据集，从而提供关于样本中的荧光团或荧光分子的附加信息。

因为FLIM用时域短激发脉冲激发荧光团，所以系统300的FLIM能力可以通过丢弃接近零延迟的信号来基本上拒绝所散射和/或所反射的激发光。这可以有利地减少或最小化所获取的荧光信号(例如，2-D图像200)中所散射和/或所反射的激发光的影响。

荧光偏振

在一些实施例中，系统300可以有利地允许荧光偏振(或各向异性)测量，以获得关于样本中的荧光团或荧光分子的附加信息。激发光的偏振和随后检测到的所发射的荧光之间的关系可用于分析和研究样本中的分子的各种化学和/或物理过程，诸如旋转扩散、结合反应(binding interaction)和定向。

为了增加测量荧光偏振的能力，如图5所示，系统300可以包括偏振器390a和光学元件，诸如波片或偏振器。例如，光学元件可以是消色差半波片(half-wave plate，HWP)390b。偏振器390a可以是位于照明系统中的线性偏振器，从而生成线性偏振激发光，例如，垂直偏振光。根据其吸收偶极(absorption dipole)的定向，样本中单独的荧光团优先被线性偏振激发光激发。由于荧光团的随机定向、扩散和/或旋转，从样本发射的荧光可以被部分去偏振。

分束器350可以是基本上透射水平偏振光并反射垂直偏振光的偏振分束器(PBS)。例如，如图5所示，由偏振器390a垂直偏振的激发光可以被PBS反射，然后向HWP 390b传播。HWP 390b可以放置在合适的位置，诸如沿着光轴放置在分束器350之前。在这种情况下，例如，HWP 390b可以将线性偏振激发光和从样本收集的荧光两者的振动定向旋转大约两倍于HWP的垂直轴和快光轴(fast axis)之间的角度。围绕光轴旋转HWP 390b将有利地旋转激发光和荧光两者的振动定向。分束器350可以基本上阻挡偏振激发光，并且透射成像器件380要获取的偏振荧光的至少一部分。

取决于应用，这种荧光偏振测定可以在稳态下或用时间分辨测量来执行，诸如利用如上所述的FLIM能力。

荧光偏振(或各向异性)的测量将另一个维度的信息添加到由系统300获取的高光谱成像数据集。信息的这个附加维度可以补充高光谱成像数据集的另一维度中关于样本中荧光团标记分子的局部的化学和物理环境的信息，诸如分子质量和分子的定向。由系统300获取的增强高光谱成像数据集可以进一步提高对样本的生理或病理变化的诊断准确性。

激发光再循环系统

如上所述，因为大部分激发光402被转向远离光轴并且不会到达样本，所以使用SLM 320a(例如，DMD或LCD)调制激发光402的幅度以生成激发图案100会导致光损失。因此，在一些实施例中，系统300可以有利地包括激发光再循环系统500，以提高激发光402的利用效率。再循环系统500可以将离开光轴的激发光重定向回朝向样本的光轴，如下所述。

基于反射的方案

在一些实施例中，激发光再循环系统500使用如图6所示的基于反射的方案。再循环系统500可以包括一个或多个透镜和反射镜。例如，再循环系统500可以包括透镜330c、平面镜510、第一凹面镜520a和第二凹面镜520b。凹面镜可以由平面镜和透镜的组合来代替。

激发光402可以在通过透镜330c之前被准直。透镜330c可以将准直的激发光402聚焦到反射镜520a的焦点312a，该焦点位于靠近或对准SLM320a平面的给定平面312。然后，激发光402随着从焦点312a传播到反射镜520a而扩展。反射镜520a可以重新准直激发光402并将其引导到SLM320a。

如上所述，当SLM 320a是DMD时，一小部分激发光402可以被“开”像素沿着光轴朝向透镜330a反射，而其余部分(例如，离轴激发光403)被“关”像素以不同的角度反射并远离光轴。反射镜520b可以被配置为截取该离轴激发光403，并将其反射回非常靠近焦点312a的点312b。点312b和焦点312a之间的间距可以刚好足够大，以允许反射镜510的边缘截取返回的离轴激发光403，而不基本上阻挡原始激发光402。然后，反射镜510可以经由几乎与原始路径对准的路径将离轴激发光403引导回SLM 320a。在这种配置中，激发光402可以通过反射镜之间的多次反射多次入射到SLM320a上，从而将离轴激发光403再循环回光轴。

如本文所述，图6所示的离轴激发光403的再循环的三条路径仅是示例性的。多重或无限循环路径是可能的。

系统300的一些设计考虑将在下面讨论。在一些情况下，再循环的离轴激发光403可以稍微发散。对于在再循环系统500中传播的离轴激发光403的每个再循环路径，因为离轴激发光403没有返回焦点312a，所以离轴激发光403到达SLM 320a时将具有与原始激发光402稍微不同的角度。角度差(或发散角(divergent angle))可以定义为Δθ＝Δx/f，其中“Δx”是焦点312a和点312b之间的间距，“f”是用于重新准直由反射镜510反射的离轴激发光的反射镜520a(或透镜)的焦距。Δx可以至少大于反射镜510的任何不可用的粗糙边缘，并且大于激发光402的衍射极限点尺寸。根据Δx和f的值，Δθ可能小于1度。这种小程度的角度差(或发散角)可能不会影响激发图案100的形成。

在一些情况下，当SLM 320a是DMD时，DMD可以对反射的激发光404具有衍射效应。例如，DMD的单个微镜可以具有大约10μm的边长。由微镜阵列的衍射引起的反射的激发光404的典型发散角可以是大约λ_a/10μm，其中λ_a是激发光402的波长。因此，发散角可以大约小于一弧度，例如1/20弧度，或者小于几度，例如3度。因此，由DMD的“开”像素或微镜从再循环系统500中的不同再循环路径反射的大部分激发光404可以重叠并沿着光轴传播，因此不会影响激发图案100的形成。

在一些情况下，来自再循环系统500中不同再循环路径的反射的激发光404可能呈现光学干涉。对于具有离散波长或窄光谱带的光源310，当聚焦在样本上时，这种干涉可能导致反射的激发光404具有不稳定的强度。可以添加额外的光学组件来控制在不同再循环路径中传播的激发光403的相对相位，以减少光学干涉效应。然而，这可能使系统300的设计复杂化。因此，图6所示的用于再循环系统500的基于反射的方案可能更适合于具有宽带光谱的光源310(诸如白色光源)的系统300。对于这样的系统300，干涉的影响可能会对反射的激发光404的光谱施加非常快速的小振荡。荧光团通常具有光谱上宽的吸收特征，允许这些振荡在激发期间达到平均。因此，当光源310具有宽带光谱时，光学干涉效应可能对获取的荧光发射光谱没有什么影响。

基于极化的方案

为了解决上述用于再循环具有离散波长或窄光谱带的激发光402的技术问题，在一些实施例中，激发光再循环系统500可以使用如图7所示的基于偏振的方案。

如图7所示，基于偏振的再循环系统500可以包括一个或多个光学组件。例如，再循环系统500可以包括光隔离器530、偏振分束器(PBS)540、四分之一波片(quarter-waveplate，QWP)550以及一个或多个反射镜，例如第一反射镜510a和第二反射镜510b。在一些实施例中，光隔离器530可以包括线性偏振器，或者可以可选地由线性偏振器代替。

在该方案中，光隔离器530仅允许激发光402在一个前向方向传播。激发光402可以是线性偏振光，或者可以在通过光隔离器530之后变成线性偏振光。穿过光隔离器530后的线性偏振激发光被称为激发光420。PBS 540可以被配置为透射具有与激发光420的振动定向平行的振动定向的光，并反射具有与激发光420的振动定向正交的振动定向的光。例如，激发光420可以是水平偏振的或者具有水平方向上的振动定向。PBS 540可以透射水平偏振光并反射垂直偏振光。因此，激发光420透射通过PBS 540并向SLM 320a传播。

下面对再循环系统500的基于偏振的方案的描述使用水平偏振的激发光420作为示例。再循环系统500的基于偏振的方案的实施例同样适用于具有任何振动定向的线性偏振激发光420。

如上所述，当SLM 320a是DMD时，一小部分激发光420可以被DMD的“开”微镜沿着光轴朝向透镜330a反射，而被“关”像素反射的离轴激发光403被转向远离光轴。反射镜510a可以被配置为截取离轴激发光403，并将其反射回DMD上的“关”像素。离轴激发光403可以通过QWP 550，第一次是朝向反射镜510a传播，第二次是被反射镜510a引导回DMD，反射镜510a将离轴激发光403的振动定向旋转90°。例如，水平偏振激发光403可以在通过QWP 550两次之后被改变为垂直偏振。垂直偏振激发光然后被DMD的“关”微镜反射到PBS 540。

因为反射到PBS 540的垂直偏振激发光具有与水平偏振激发光420的振动定向正交的振动定向，所以它被PBS 540反射并引导到反射镜510b。在不改变其振动定向的情况下，反射镜510b和PBS 540然后将垂直偏振激发光反射回DMD，其中“开”微镜然后将垂直偏振激发光沿着光轴朝向透镜330a反射。“关”微镜反射垂直偏振激发光，该垂直偏振激发光再次透射通过QWP550和反射镜510a两次，并变为水平偏振。该水平偏振激发光将穿过PBS540，但是由于光隔离器530，不会传播回光源310。

在上述再循环系统500的基于偏振的方案中，因为QWP 550将离轴激发光403的振动定向旋转90°，所以朝向光轴反射的激发光404，包括被再循环的离轴激发光403的部分，将具有正交偏振。在这种情况下，分束器350可以适当地作为具有多个截止波长和通带的多频带二向色分束器，而不是偏振分束器。如上所述，可以选择多频带二向色分束器，使得具有离散光谱的激发光402的波长基本上被反射，并且所发射的荧光408的波长基本上被透射。因此，这种基于偏振的方案可以在使用具有离散波长或窄光谱带的光源310的系统300中更好地工作，诸如以离散波长工作的一组激光器的组合。

共焦光学分割能力

如上所述，系统300可以允许共焦光学分割(confocal optical sectioning)，这允许选择样本中焦平面的深度。焦平面的深度可以通过在与所选焦平面共轭的平面上引入一个或多个光学针孔来选择。

图8是允许共焦光学分割的示例性系统300的示意图表示。如图8所示，系统300可以包括用于生成如上所述的激发图案100的第一SLM 320a、用于共焦光学分割的第二SLM320b、至少一个附加反射镜510c、一个或多个管透镜(例如，330d和330e)，以及z轴平移台或可调谐液体透镜(未示出)。SLM 320b可以具有与上面针对SLM 320a描述的相似类型和特征。例如，SLM 320b的像素可以以与针对SLM 320a描述的方式相同的方式被单独调制。

SLM 320b可以放置在位于样本中沿着光轴的期望深度的、与焦平面共轭的平面附近。例如，透镜330b和物镜360可以形成成像配置。如图8所示，透镜330b可以位于物镜360后面，SLM 320b可以位于透镜330b后面大约一个焦距处。物镜360的后孔径和透镜330b之间的空间是准直空间，其可以基于各种因素(诸如系统300的几何形状和最小光束孔径的期望位置)根据需要进行调整。在一些实施例中，透镜330b放置在物镜360后面大约一个焦距处。

SLM 320b的像素可被选择性地致动或切换到“开”或“关”状态，以在样本上形成与激发图案100匹配或共轭的针孔图案。针孔图案可包括共轭平面处的多个人工光学针孔，并拒绝来自样本的离焦荧光。因此，离焦荧光不会穿过检测系统，并且被基本上从获取的2-D图像200中去除或消除。

针孔图案中人工针孔的尺寸和间距是可编程的，并且可以基于由物镜360和透镜330b形成的成像配置的放大倍数来自定义。在一些情况下，针孔图案可以包括多个细长形状的“开”像素，以允许同时获取从样本上的多个位置(例如，由激发点112a-112f激发的区域)发射的荧光。在其他情况下，针孔图案可以包括与激发图案100中的激发线或激发点的尺寸匹配的“开”像素的阵列。

然后，由SLM 320b的“开”像素反射的荧光412被管透镜330d和330e成像到成像器件380。例如，反射镜510c可以放置在沿着光轴的适当位置，并且用于将由“开”像素反射的荧光412引导到管透镜。管透镜330d可以位于由透镜330b产生的图像之外大约一个焦距处(例如，在SLM 320b后面大约一个焦距)，使得它重新准直来自样本的荧光。成像器件380可以位于管透镜330e后面大约一个焦距处，或者位于SLM 320b的共轭平面处。因为荧光在管透镜330d和330e之间的空间中被准直，所以管透镜330d和330e之间的距离可以根据需要调整。在一些实施例中，管透镜330e可以在管透镜330d后面大约两个焦距，使得管透镜330d和330e中间的平面与系统300的出射光瞳共轭。

通过相应地数字改变和/或横向移位激发图案100和SLM 320b上的匹配针孔图案，可以扫描整个视场以获取共焦成像数据集。通过进一步扫描整个样本的视场，可以扫描整个样本以获得样本的完整的共焦成像数据集。

在一些实施例中，成像器件380可以适当地倾斜，以减少像差，从而提高获取的2-D图像数据集的质量。这至少是因为SLM 320b的“开”像素以不垂直于SLM 320b的表面平面的角度引导荧光412，使得由管透镜330d和330e形成的图像平面可以倾斜。由这种倾斜效应引起的像差可以通过适当倾斜成像器件380来补偿。如果色散元件340b的色散角被调整为平行于倾斜的成像器件380的旋转轴，像差可以进一步减小。

为了改变或选择焦平面的深度，在一些实施例中，样本架370可以安装在z轴平移台上。可以通过使用z轴平移台沿着光轴移动样本架370来选择焦平面的期望深度。或者，物镜360可以安装在z轴平移台上，并且可以通过沿着光轴移动物镜360来选择焦平面的期望深度。如本文所述，z轴平移台还可包括x-y平移能力，以在横向方向上跨越样本移动系统300的视场。在其他实施例中，可以通过调谐放置在物镜360后面的可调谐液体透镜(未示出)的焦点来选择焦平面的期望深度。另外，z平移台或可调谐液体透镜可由计算机程序控制以实现自动聚焦。

有利的是，可以根据需要通过改变由SLM 320b形成的人工针孔的尺寸和/或间距来调节共焦度。例如，通过增加针孔中的像素数量和/或减小针孔间距来增加针孔的尺寸可以降低共焦度，从而降低期望焦平面的深度选择性程度。另一方面，通过减少针孔中的像素数量和/或增加针孔间距来减小针孔的尺寸可以增加共焦度，从而增加期望焦平面的深度选择性程度。在一些实施例中，深度选择性可以与SLM 320b的“关”和“开”像素的数量之比成比例。因此，SLM 320b可以有利地允许，根据需要，通过方便地调节针孔尺寸和/或间距在宽视场和共焦成像之间切换。

另外，由SLM 320b的像素形成的针孔图案有利地允许由激发图案100同时照射的样本上的多个区域的共焦成像。与使用顺序逐点扫描的传统共焦显微镜相比，这可以增加在期望焦平面的样本上获取高光谱成像数据集的速度和/或吞吐量。

如图8所示，在使用SLM 320b的系统300的实施例中，色散元件340b可以位于管透镜330d和330e之间的准直空间中。因为SLM 320b上的针孔图案匹配样本上的激发图案100，所以如上所述，由SLM 320b的人工针孔反射的荧光412可以被色散元件340b色散，使得与激发图案100的激发点相对应的荧光发射光谱可以被成像器件380的2-D传感器获取。

荧光发射光谱的选择性过滤

在一些应用中，在样本中可以使用或存在具有间隔开的荧光发射光谱的不同荧光团，诸如绿色和红色荧光团。这可能导致在2-D图像200中获取的荧光发射光谱中沿着发射波长轴的横向间隙，导致成像器件380的2-D传感器上的空间的低效使用。

在其他应用中，不同荧光团的组合可导致由成像器件380获得总体的宽荧光发射光谱。在一些情况下，宽发射荧光光谱内的多个光谱区域可能比其他区域更有用。获取完整的宽荧光发射光谱可能导致成像器件380的2-D传感器上的空间的低效使用，并进一步降低获取高光谱成像数据集的吞吐量。

为了提高使用成像器件380的传感器空间的效率并增加系统300的吞吐量，光谱分割系统342可以包括在检测系统中沿着光轴的准直空间处。例如，如图8所示，光谱分割系统342可以位于管透镜330d和330e之间，并且可以放置在检测系统中的色散元件340b之前。光谱分割系统342可以选择性地通过具有可调谐带宽和/或中心波长的一个或多个光谱带，从而允许获取具有期望光谱带和/或期望光谱分辨率的高光谱成像数据集。

如图8所示，光谱分割系统342可以包括多个光谱分割模块344。由样本发射的荧光408可以在被准直或重新准直之后进入光谱分割系统342。使用一个或多个分束器和/或机动翻转镜，光谱分割系统342可以将输入的准直荧光光束分成一个或多个光束，每个光束具有不同的光谱带，并引导它们分别通过光谱分割模块344。每个光谱分割模块344可以过滤其中一个光束以具有期望的带宽和中心波长。在过滤之后，光谱分割系统342可以使用一个或多个分束器和/或机动翻转镜将过滤后的光束组合成输出光束。

光谱分割模块344可以各自作为具有可调谐通带宽度和/或可调谐中心波长的可调谐带通滤光器工作。例如，光谱分割模块344可以包括沿着其光轴的长通滤光器和短通滤光器。长通滤光器和短通滤光器中的至少一个可相对于光轴旋转。旋转滤光器可以调节光束在滤光器上的入射角，从而移位它们的吸收或反射边缘的波长。因此，旋转长通滤光器和/或短通滤光器可以调谐由长通滤光器和短通滤光器形成的光谱通带的带宽和/或中心波长。或者，光谱分割模块344可以各自包括可调谐带通滤光器，其通带可以通过旋转滤光器来调谐，从而调谐光束在滤光器上的入射角。

光谱分割系统342允许测量的荧光发射光谱可调整地过滤到对特定应用有用的期望光谱范围。通过选择期望的光谱范围，成像器件380的2-D传感器上的空间可以被更有效地使用。例如，如上所述，由色散元件340b引起的色散程度是可调节的。荧光发射光谱的所选光谱范围的光谱分辨率可以通过使用色散元件340b增加光谱色散程度来增加，从而提供样本中的荧光团或荧光分子的更多信息。

另外，选择期望的光谱范围可以允许减小2-D图像200中荧光发射光谱之间沿着发射波长轴的横向间距，从而提高数据集获取的吞吐量。例如，通过减小水平方向上的激发图案100的周期，并使用色散元件340b减小光谱色散程度，可以减小2-D图像200中水平方向上的荧光发射光谱的阵列的周期。这又可以增加在一次曝光中可以获取的荧光发射光谱的数量，从而提高使用成像器件380的传感器空间的效率。

替代配置

在一些应用中，可能期望系统300的配置更紧凑。在这种情况下，系统300可以使用衍射元件来代替SLM 320a和/或SLM 320b。下面参考图9-图13描述系统300的这种配置的实施例。

图9是系统300的示例性紧凑实施例的示意图表示。如图9所示，系统300可以有利地使用透射型照射来简化其几何形状。然而，根据应用，也可以使用如图3-图8所示的反射型照射配置。在照明系统中，来自光源310(诸如通过光纤提供的超连续光谱激光源)的激发光402被透镜330a准直，透射通过第一衍射元件600a，然后照射放置在样本架370上的样本。衍射元件600a调制透射通过它的激发光402的相位，并构造激发光402以生成激发图案100。相位调制可以呈现具有不同方向和/或相位的所透射的激发光430的多个小波，在远场中生成衍射图案。聚焦在样本上的衍射图案被称为激发图案100。

图12是示例性衍射元件600a的示意图表示。如图12所示，在一些实施例中，衍射元件600a可以是衍射透镜610的2-D阵列。对于具有单一波长的激发光402，衍射元件600a生成激发点的2-D阵列，每个衍射透镜610生成一个激发点。对于具有多个离散波长或波长范围的激发光402，不同波长的激发光402被每个衍射透镜610衍射成沿着不同角度方向传播的若干光束。因此，当聚焦在样本上时，不同波长的激发光402可以具有在第一横向方向(例如，垂直方向)上彼此空间移位的焦点，从而生成如图1或图2所示的激发图案100。

在一些实施例中，衍射元件600a的衍射透镜610可以是具有透明和不透明光谱带的区域片(zone plate)，通过例如二元光刻、灰度光刻或模制工艺制成的常规光栅，或者通过二元光刻制成的亚波长光栅。在其他实施例中，衍射元件600a可以用具有如上所述的用于生成激发图案100的相位调制能力的2-D小透镜阵列和透射衍射光栅代替。

在检测系统中，由样本发射的荧光408被物镜360收集和准直，透射通过色散元件340b，然后被透镜330b聚焦到成像器件380上。色散元件340b可以如上所述在第二横向方向(例如，水平方向)上光谱色散荧光408。色散元件340b可以具有与上述相同的特征和功能。

在一些实施例中，系统300可以包括第二线性偏振器390c。荧光408可以穿过偏振器390c。当激发光402线性偏振时，偏振器390c可用于基本上反射偏振激发光，从而阻档其到达成像器件380。在其他实施例中，一组陷波滤光器或单个多陷波滤光器(未示出)可以沿着光轴被添加到检测系统中。

因为衍射元件600a不具有与SLM相同的数字可编程性，所以衍射元件600a或样本架370可以在空间维度上平移，以扫描视场或样本上的激发图案100，以获得完整的4-D高光谱成像数据集。扫描方案可以与上面参考图1和图2描述的相同。每个扫描单元110中的不同区域可以通过在垂直和水平方向上空间移位激发图案100来照射。在激发图案100的每个空间位置，可以获取所照射的区域的荧光发射光谱的至少一个2-D图像200。然后，可以对应于一系列彼此横向移位的激发图案100来获取荧光发射光谱的多个2-D图像200，并用于重建4-D高光谱成像数据集。

图10是系统300的另一示例性紧凑实施例的示意图表示。如图10所示的系统300可以允许通过在一个横向方向上执行扫描来获取4-D高光谱成像数据集。例如，系统300可以包括检测系统中的衍射元件600a和照明系统中的另一衍射元件600b。如图10所示，在照明系统中，来自光源310的激发光402被透镜330a准直，透射通过衍射元件600b，然后照射放置在样本架370上的样本。

图13是示例性衍射元件600b的示意图表示。衍射元件600b可以调制透射通过它的激发光402的相位，并呈现具有不同方向和/或相位的所透射的激发光430的小波。在一些实施例中，衍射元件600b可以包括衍射柱面小透镜620的线性阵列。对于单一波长的激发光402，衍射元件600b生成单色条纹的重复图案，每个柱面小透镜620生成一个单色条纹。对于具有多个离散波长或波长范围的激发光402，不同波长的激发光402被每个柱面小透镜620衍射成沿着不同角度方向传播的若干光束。因此，当聚焦在样本上时，不同波长的激发光402可能具有在第一横向方向(例如，垂直方向)上彼此空间移位的焦点，生成一系列移位的不同颜色条纹的重复图案。取决于光源310的光谱，不同颜色的条纹可以在第一横向方向上连接或隔开。然后在样本上照射移位的不同颜色的条纹的重复图案。

在检测系统中，代替使用色散元件340b，衍射元件600a可以被添加并放置在成像器件380的前面。由样本发射的荧光408被物镜360收集和准直，透射通过偏振器390c，然后通过透镜330b成像到衍射元件600a上。衍射元件600a的衍射透镜610然后可以在第二横向方向(例如，水平方向)上光谱色散荧光，并将光谱色散的荧光410成像到成像器件380的2-D传感器。

在一些实施例中，选择透镜330b的焦距，使得透镜330b在其焦平面上的衍射受限点尺寸可以覆盖成像器件380的2-D传感器的多个像素。这可能影响透镜330b的数值孔径(numerical aperture，NA)、焦距比(focal ratio，f-ratio)和/或放大倍数。例如，为了增加透镜330b的衍射受限点尺寸，透镜330b可以具有更长的焦距、更小的NA或更大的f-ratio和/或更大的放大倍数。

衍射元件600a可以被设计或选择为使得其衍射透镜610的直径大约是透镜330b的衍射受限点的尺寸。被每个衍射透镜610偏转和聚焦的荧光410的不同波长可能具有在第二横向上彼此空间移位的焦点，生成如图1或图2所示的荧光发射光谱的阵列。

如图10所示的系统300的实施例允许在由一系列横向移位的不同颜色条纹的重复图案照射的样本上的区域或位置的如图1或图2所示的2-D图像200中获取荧光发射光谱。为了获取激发光谱，可以沿着第一横向方向扫描重复图案，使得先前由重复图案的彩色条纹照射的样本上的区域或位置被不同颜色的条纹照射。重复图案在第一横向方向上的移位和随后的相应2-D图像200的获取可以被执行多次。在这种情况下，可以获取与样本上每个区域或位置的激发波长相对应的荧光发射光谱，并将其用于重建4-D高光谱成像数据集。

在如图10所示的系统300的实施例中，因为一系列横向移位的不同颜色条纹的重复图案在第二横向方向上是连续的，所以可能只需要沿着第一横向方向扫描重复图案，以获得视场内所有区域或位置的激发光谱。这可以进一步提高用于获取4-D高光谱成像数据集的系统300的吞吐量和效率。

沿着第二横向方向，由连续彩色条纹照射的每个区域可以被成像到衍射透镜610，衍射透镜610然后色散荧光并将其聚焦到成像器件380。在这种情况下，沿着第二横向方向的空间分辨率可以取决于衍射透镜610的尺寸和焦距、透镜330b和物镜360的焦距和/或成像器件380的2-D传感器的尺寸。在一些实施例中，增加透镜330b的焦距可以允许使用更大的衍射透镜610。沿着第二横向方向的光谱分辨率可以取决于衍射透镜610的宽度和/或焦距，以及由衍射透镜610在第二横向方向生成的离轴焦移(off-axis focal shift)。例如，增加衍射透镜610的凹槽密度将增加荧光的衍射角，从而增加离轴焦移，从而增加第二横向方向上的光谱分辨率。

图11是提供用于测量荧光偏振的能力的系统300的另一示例性紧凑实施例的示意图表示。如图11所示，系统300可以包括两个偏振器390a和390c。偏振器390a可以位于照明系统中沿着光轴的适当位置，从而生成线性偏振激发光。偏振器390c可以位于检测系统中沿着光轴的适当位置，从而透射具有给定振动定向的所发射的荧光408。为了执行荧光偏振测定，偏振器390c的透射轴可以在平行于和正交于线性偏振激发光的振动定向的定向之间旋转。成像器件380可以分别获取具有平行于和正交于偏振激发光的振动定向的振动定向的荧光408的荧光发射光谱的2-D图像200。所获取的2-D图像200然后可用于荧光偏振(或各向异性)测定。

本文所述的系统300可用于各种高光谱成像方法。图14是用于执行高光谱成像或用于获取样本的高光谱成像数据集的示例性方法700的流程图。方法700使用系统300和以上参考图3-图13描述的系统300的实施例的特征。

在步骤702，提供了具有离散光谱或连续光谱的光源310并将其配置为发射具有一个或多个波长的激发光402。在步骤704，激发光402被SLM 320a构造成在样本中的焦平面的共轭平面处的预定二维图案。在步骤706，所构造的激发光(例如，由SLM 320a反射的激发光404)被色散元件340a在第一横向方向上光谱色散。在步骤708，光谱色散的激发光406被引导到样本并聚焦在样本上，用在第一横向上色散的具有一个或多个波长的激发图案100照射样本。在步骤710，从样本收集的荧光408被色散元件340b在第二横向方向上光谱色散。在步骤712，光谱色散的荧光410被成像到成像器件380的2-D传感器。

方法700可以进一步包括附加步骤。例如，方法700可以包括在获取2-D图像200之前校准系统300。系统300中的各种光学组件可以被适当地校准和对准，使得可以获取失真减小或最小的聚焦的2-D图像200。

方法700可以进一步包括使用第一偏振器来偏振将要被引导到样本的激发光402，并且使用第二偏振器或偏振分束器(PBS)基本上反射从样本收集的具有与偏振的激发光相同的偏振的光。

方法700可以进一步包括在一系列彼此横向移位的激发图案100中顺序照射样本，获得与该一系列激发图案100相对应的光谱色散的发射光的多个2-D图像200，以及重建多个2-D图像200以提供4-D高光谱成像数据集。如上所述，每个2-D图像200记录与每个横向移位的激发图案100相对应的荧光发射光谱的阵列。

方法700可以进一步包括通过SLM 320b在与焦平面共轭的平面处提供可编程人工光学针孔，通过SLM 320b的像素形成一系列针孔图案，以及将该一系列针孔图案与该一系列激发图案100匹配。如上所述，使用一个或多个透镜将从SLM 320b收集的光成像到成像器件380。光谱色散的发射光的2-D图像200可以在激发图案100的每次横向移位和与其匹配的针孔图案的形成之后获取。方法700可进一步包括重建与该一系列激发图案100相对应的2-D图像200，以提供样本的所选焦平面的4-D高光谱成像数据集。

前面的描述是为了说明的目的而提出的。它不是穷尽的，也不限于所公开的精确形式或实施例。根据考虑所公开的实施例的说明书和实践，实施例的修改和改编将是显而易见的。例如，所描述的实施方式包括硬件和软件，但是与本公开一致的系统和方法可以单独实施为硬件。此外，虽然某些组件已经被描述为彼此耦合，但是这些组件可以彼此集成或者以任何合适的方式分布。

此外，尽管本文已经描述了说明性实施例，但是范围包括任何和所有具有基于本公开的等效元件、修改、省略、(例如，各种实施例的各方面的)组合、改装和/或变更的实施例。权利要求中的元素将基于权利要求中使用的语言被广义地解释，而不限于本说明书中描述的示例或在本申请的实施过程中所描述的示例，这些示例将被解释为非排他性的。此外，可以以任何方式修改所公开方法的步骤，包括重新排序步骤和/或插入或删除步骤。

由计算机可读介质存储的指令或操作步骤可以是计算机程序、程序模块或代码的形式。如本文所述，基于本说明书的书面描述的计算机程序、程序模块和代码(诸如控制器使用的那些)很容易在软件开发者的权限内。可以使用各种编程技术来创建计算机程序、程序模块或代码。例如，可以采用Java、C、C++、汇编语言或任何这样的编程语言来设计这些计算机程序、程序模块或代码。一个或多个这样的程序、模块或代码可以集成到设备系统或现有通信软件中。程序、模块或代码也可以作为固件或电路逻辑来实施或复制。

根据详细的说明书，本公开的特征和优点是显而易见的，因此，所附权利要求旨在覆盖落入本公开的真实精神和范围内的所有系统和方法。如本文所使用的，不定冠词“一”和“一个”表示“一个或多个”。类似地，复数术语的使用不一定表示复数，除非它在给定的上下文中是明确的。除非另有特别指示，否则诸如“和”或“或”的词语意味着“和/或”。此外，由于根据研究本公开内容将容易发生许多修改和变化，因此不希望将本公开内容限制于所示和所述的确切结构和操作，并且相应地，可以诉诸所有合适的修改和等同物，这些修改和等同物都落入本公开内容的范围内。

通过考虑本文公开的说明书和实施例的实践，其他实施例将是显而易见的。旨在将说明书和实施例仅视为示例，所公开的实施例的真实范围和精神由所附权利要求指示。

Claims (20)

1.一种高光谱成像系统，包括：

样本架，被配置为保持样本；

光源，被配置为发射具有一个或多个波长的激发光；

二维成像阵列；和

光学系统，包括：

第一光谱分离器，包括第一色散元件或第一衍射元件；和

第二光谱分离器，包括第二色散元件或第二衍射元件；

其中所述光学系统被配置为(i)使用第一光谱分离器将所述激发光构造成在所述样品中的焦平面或所述焦平面的共轭平面处的光谱色散的二维激发图案；(ii)在所述焦平面内使用沿着第一方向色散的具有一个或多个波长的激发图案照射所述样本；(iii)从所述样本收集发射光；(iv)使用所述第二光谱分离器光谱色散所收集的发射光；以及(v)将所收集的发射光聚焦提供给所述成像阵列，使得所收集的发射光沿着第二方向光谱色散，其中，第一方向不同于第二方向。

2.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，所述第一光谱分离器被配置为调制激发光的相位。

3.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，所述第一光谱分离器包括第一衍射元件，并且第一衍射元件包括衍射透镜的二维阵列。

4.根据权利要求3所述的高光谱成像系统，其中，所述衍射透镜中的每个衍射透镜包括具有透明带和不透明带的区域片。

5.根据权利要求3所述的高光谱成像系统，其中，所述衍射透镜中的每个衍射透镜包括光栅。

6.根据权利要求5所述的高光谱成像系统，其中，所述光栅是亚波长光栅。

7.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，第一光谱分离器包括第一衍射元件，并且第一衍射元件包括二维小透镜阵列和透射衍射光栅。

8.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，第一光谱分离器包括第一衍射元件，并且第一衍射元件包括衍射柱面小透镜的线性阵列。

9.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，第二光谱分离器包括第二衍射元件，并且第二衍射元件包括衍射透镜的二维阵列。

10.根据权利要求9所述的高光谱成像系统，其中，所述衍射透镜中的每个衍射透镜的直径大约是将发射光成像到成像阵列上的透镜的衍射受限点的直径。

11.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，将发射光成像到成像阵列上的透镜的衍射受限点覆盖成像阵列的多个像素。

12.根据权利要求1所述的高光谱成像系统，其中，所述光学系统进一步包括第一偏振器，所述第一偏振器被配置为偏振所述激发光。

13.根据权利要求12所述的高光谱成像系统，其中，所述光学系统进一步包括被配置为反射具有与所偏振的激发光的偏振相同的偏振的光的第二偏振器或偏振分束器(PBS)中的至少一个。

14.根据权利要求12所述的高光谱成像系统，其中，所述光学系统还包括第二偏振器，该第二偏振器具有相对于所偏振的激发光的振动定向可旋转的透射轴。

15.一种用于高光谱成像的方法，所述方法包括：

从光源提供具有一个或多个波长的激发光；

通过第一光谱分离器将来自所述光源的激发光构造成在样品中的焦平面或所述焦平面的共轭平面处的预定二维激发图案；

光谱色散所述激发图案；

在所述焦平面内使用沿着第一方向色散的具有一个或多个波长的激发图案照射所述样本；

光谱色散从所述样本收集的发射光；和

使用二维成像阵列对光谱色散的发射光进行成像，其中所述光谱色散的发射光被所述成像阵列聚焦地接收，使得所述光谱色散的发射光沿着第二方向光谱色散，其中第一方向不同于第二方向。

16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括：

通过第一偏振器偏振所述激发光；和

通过第二偏振器或偏振分束器(PBS)中的至少一个反射具有与所偏振的激发光的偏振相同的偏振的光。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，第一光谱分离器包括：

衍射透镜的二维阵列，

二维小透镜阵列和透射衍射光栅，或

衍射柱面小透镜的线性阵列。

18.根据权利要求15所述的方法，还包括：由第一光谱分离器调制激发光的相位。

19.根据权利要求15所述的方法，进一步包括：

用一系列激发图案顺序地照射所述样本，所述一系列激发图案在所述样本内的焦平面内彼此移位；

使用所述成像阵列获得光谱色散的发射光的多个二维图像，其中所获得的二维图像中的每一个与所述一系列激发图案中的相应一个激发图案相对应；以及

重建所获得的多个二维图像以提供四维高光谱成像数据集。

20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述发射光通过包括衍射透镜的二维阵列的第二光谱分离器光谱色散。

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