CN112553130A - 一种耐硒菌株gx-d6及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及的是一种耐硒菌株GX‑D6及其应用。一种耐硒菌株GX‑D6，其分类学名为Klebsiella pneumoniae subsp.rhinoscleromatis，于2020年12月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61356。本发明的耐硒菌株Klebsiella pneumoniae subsp.rhinoscleromatis GX‑D6于4000μg/mL硒浓度下，对土壤中硒的去除率达到最高为40.04％。该结果可为硒污染地区生物修复提供菌种资源，为硒资源的开发利用提供参考。

Description

一种耐硒菌株GX-D6及其应用

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，一种耐硒菌株GX-D6及其应用。

背景技术

硒是人体必需的微量元素，硒缺乏会导致克山病、癌症和心血管疾病等发病率的增加，硒摄入量过高，则会引起脱发与中毒的现象。硒在自然界中主要以四种形态存在，分别是硒化物(Se^2-)、单质硒(Se⁰)、亚硒酸盐(SeO₃ ^2-)和硒酸盐(SeO₄ ^2-)，而各种形态之间的价态的转化都与微生物息息相关。高硒环境是耐硒微生物菌种的潜在来源，研究表明高硒环境胁迫下细菌产生应激反应，将毒性较高的无机硒转化为毒性较低的硒单质^[4]。彭祚全等^[5]与王明义等曾经从湖北恩施富硒土壤中筛选出耐硒菌株，并能在含硒培养基中将无机硒还原为红色单质硒，在治理环境硒污染方面具有重要意义。

土壤中的硒安全值范围为0.1-3.0μg/g，小于或大于此值都会导致动物出现明显的缺硒病和硒中毒病。近年来，硒污染问题全球屡见不鲜，在我国湖北恩施和陕西紫阳地区曾出现过因硒污染中毒的案例，其中最著名的是恩施鱼塘坝人群硒中毒事件。紫阳地区的硒污染来源于富硒的硫化铁碳酸岩和火山岩岩床、开采和风化侵蚀导致含硒岩层露出地表，导致闹热村土壤的平均硒含量达到15.74mg/kg，最高达26mg/kg，远远高于土壤硒平均值含量。国外同样也出现硒污染问题，美国西南部的加利福利亚凯斯特森水库硒污染，高剂量的硒污染导致水中的水禽和鱼类死亡和畸变，同样，墨西哥瓦瓦地区、加拿大安大略湖以及波兰托伦市也因硒污染造成土壤、地表水洗含量严重超标现象。因此硒污染地区的环境修复成为了研究的热点。

利用化学方法进行修复，则可能会造成二次污染，越来越多的研究者把目光投向了微生物生物修复方面。目前国内对硒的研究主要集中于硒在土壤中的行为、植物富硒以及纳米硒材料，而对富硒土壤中的微生物研究较少，为此发明人从广西富硒地区采集土壤样品，对耐硒菌株进行鉴定，并进行耐硒菌株对硒的去除率测定，以期从微生物方向为硒资源的开发提供菌种资源。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐硒菌株Klebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis GX-D6及其应用。

本发明提供的耐硒菌株Klebsiella pneumoniae subsp.rhinoscleromatis GX-D6是从广西贵港市覃塘区的土壤中分离得来，经形态学和分子生物学鉴定为Klebsiellapneumoniae subsp.rhinoscleromatis，于2020年12月10日保藏于保藏于广东省微生物菌种保藏中心，(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070)，保藏号为GDMCC No.61356。

本发明还提供了所述的耐硒菌株Klebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis GX-D6在去除土壤中硒的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用稀释平板法进行耐硒菌株筛选，通过形态学观察、革兰氏染色、16SrRNA序列测序对耐硒菌株进行鉴定，并进行耐硒菌株对硒的去除率测定。获得的D6菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella)；对硒的去除率研究中，D6菌株于4000μg/mL硒浓度下，对土壤中硒的去除率达到最高为40.04％。该结果可为硒污染地区生物修复提供菌种资源，为硒资源的开发利用提供参考。

保藏信息说明

Klebsiellapneumoniae subsp.rhinoscleromatis GX-D6，保藏编号为GDMCCNo.61356，保藏日期为2020年12月10日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1为本发明分离出的部分菌落PCR产物凝胶电泳图；

图2为本发明四株耐硒菌株形态；

图3为本发明四株耐硒菌株革兰氏染色镜检；

图4为本发明四株耐硒菌株的16S rRNA基因序列系统发育树；

图5为本发明四株耐硒菌株生长曲线图；

图6为本发明四株耐硒菌株在不同硒浓度下对硒的去除率；

有关附图标记的说明：

图1中，Marker：1kb DNAMarker；1-9：部分菌株的PCR产物。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1筛菌土壤

筛菌土壤采自广西贵港市覃塘区四个不同硒含量水稻土壤样品，将四个土壤分别命名为A、B、C、D。供试土壤采用五点混合法采集0-20cm地表土，去除表面杂质后放入无菌自封袋中置于冰盒保存，当天带回实验室放入4℃冰箱保存备用，土壤理化性质如表1所示。

表1土壤理化性质和硒含量

1.1.2培养基

细菌液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7.4-7.6。

细菌固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L，琼脂15g，pH 7.4-7.6。

1.1.3硒溶液的配置

称取22.35g亚硒酸钠，用去离子水定容至100mL，即得到的溶液硒浓度为100mg/mL，使用0.22μm的无菌滤头进行过滤备用。

1.2土壤微生物的分离纯化

称取1g土壤放入装有10颗玻璃珠以及9mL的无菌水的指形瓶中。30℃，200r/min，震荡20min，静置5min收集土壤悬液于5000r/min离心10min，取上清液1mL加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养2天，将摇好的菌液进行浓度稀释，制备成10-2-10-6的稀释液，取100μL的稀释液分别涂布到固体培养基中，于30℃进行培养，细菌培养1天。挑取颜色、形态、大小、光泽不同的单个菌落，采用平板划线法进行3次重复分离纯化，获得菌株纯培养物并用甘油进行保藏。

1.3细菌的16S rRNA鉴定

将初筛得到的细菌菌株纯培养物进行16S rRNA鉴定：挑取单菌落于1.5mL的离心管中进行菌落PCR，选择细菌通用引物27F和1492R，引物序列如表2，PCR反应体系如表3。

表2 16S rRNA引物

表3 PCR反应体系

PCR程序为：94℃，7min；94℃30s，54℃30s，72℃1min30，循环25次；72℃，2min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNAPurification Kit对PCR产物进行纯化，具体步骤参考说明书。将纯化后的PCR产物送至深圳华大基因股份有限公司进行16SrRNA测序，测序序列通过登录NCBI数据库上的BLAST进行比对，从而确定种属信息。

1.4耐硒菌株的筛选

将分离纯化得到的菌株接种到液体培养基中培养，培养24h，准备足够多数量的平板，取5μL培养液涂布到不同含硒浓度的固体培养基中。细菌的含硒固体培养基中的硒浓度以5000μg/mL的梯度进行筛选，分别筛选出四个不同地点中最为耐硒菌株为止。

1.5耐硒菌株形态观察

对耐硒菌株的单菌落进行显微观察拍照，并且对菌落的形态结构进行描述。

细菌革兰氏染色镜检：

(1)涂布固定：在载玻片上滴上一滴超纯水，挑取单菌落放入生理盐水中均匀涂布，载玻片在酒精灯上间歇性接触使菌落固定；

(2)初染：将固定好的载玻片上滴加草酸铵结晶紫染色1min，之后用蒸馏水冲洗干净；

(3)煤染：再滴加碘液染色1min，然后用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸去水分；

(4)脱色：滴加95％的酒精数滴并轻轻摇晃进行脱色，大约20秒后进行水洗，用吸水纸吸去水分；

(5)复染：再滴加蕃红染色液染色1min后用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸将水分吸干，镜检。

1.6耐硒菌株的生长状况及系统发育树的构建

将筛选出的耐硒菌株进行生长曲线的绘制：配置牛肉膏蛋白胨细菌液体培养基，每个处理三个重复，取提前摇好的细菌悬浊液100μL进行接种，分别在0、2、4、8、10、12、14、16、18、20小时取样进行测定OD值(600nm波长)，绘制细菌生长曲线。

将筛选出四个地点中的耐硒细菌的16S rRNA序列登录NCBI数据库进行BLAST对比，一个菌株挑选七个一致性较高的序列，构建系统发育树。

1.7耐硒细菌对硒的去除率的研究

耐硒菌株对硒的去除率研究参考张诗琦等的研究方法并作出修改，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入已过滤除菌的亚硒酸钠溶液，使液体培养基中的含硒浓度为0、1000、2000、3000、4000、5000μg/mL，每个处理设置三个平行，按1％的接种量接入到相应的液体培养基中，于30℃、200r/min，震荡培养6天。培养结束后，13000r/min离心5min，取上清液进行消解，利用原子荧光光度计测定溶液中的硒浓度，去除率按公式1-1进行计算：

去除率(％)＝(C_i-C_f)/C_i×100％ (1-1)

公式中，C_i为原培养液中硒的浓度，C_f为菌株培养后的硒浓度。

1.8水样硒含量的检测

样品收集后立即用0.45μm滤膜过滤，用少量的滤液清洗采集瓶，收集50mL的滤液，按每升水样加入2mL盐酸混匀，混匀后的样品放入150mL的锥形瓶中，加入5mL硝酸-高氯酸混合液(V:V＝1:1)于电热板上加热至冒白烟，待冷却后加入5mL的盐酸，加热至黄褐色烟冒尽，冷却后定容至50mL的容量瓶中，利用原子荧光光度计上机检测。样品溶液浓度计算按功公式1-2计算：

C＝C₁×F×V₁/V (1-2)

公式中，C为样溶液浓度(μg/L)，C₁为上机检测的浓度(μg/L)，F为样品稀释倍数，V₁为定容的体积(mL)，V为取样的体积(mL)。

1.9数据处理

利用MAGE-X构建系统发育树，利用Origin 2018进行作图。

2.结果与分析

2.1菌株的分离

将土壤样品加入含硒浓度为100μg/mL液体培养基中进行初筛，挑取颜色、形态等不同的单菌落进行平板划线纯化，共筛选出细菌菌株17株，将初筛的单菌落进行16S rRNA测序鉴定出所属菌株、耐硒能力的筛选。

2.2菌株16S rRNA鉴定

将初筛后分离纯化的菌株进行菌落PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行验证如图1所示。

从图1可以看出，PCR产物条带出现在1500bp左右，条带清晰，说明成功PCR产物扩增成功。

将剩下的PCR产物经过DNAPurification Kit进行纯化，将纯化后的PCR产物送至深圳华大基因股份有限公司进行16S rRNA测序，测序序列通过登录NCBI数据库上的BLAST进行比对，对比结果如表4所示。

表4菌株BLAST比对结果

从表4可以看出，共得到9个不同属的细菌：A1为丛毛单胞菌属(Comamonas)，A2为普罗维登斯菌属(Providencia)，A3、B2、B4、C1、D1、D4以及D5均为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，A4、B1以及B3为芽孢杆菌属(Bacillus)，C2为泛菌属(Pantoea)，C3为肠杆菌属(Enterobacter)，D2为香味菌属(Myroides),D3为微小杆菌属(Exiguobacterium)，D6为克雷伯氏菌属(Klebsiella)。其中，得到最多的菌属为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，其次为芽孢杆菌属(Bacillus)。从覃塘四个不同地点的富硒土壤中都能够筛选出赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，说明赖氨酸芽孢杆菌属普遍存在于覃塘富硒土壤中。

2.3耐硒菌株的筛选

将分离纯化得到的菌株在不同含硒浓度的固体培养基中的生长情况如下表5所示。

表5菌株在不同硒含量浓度下生长状况

注：+表示生长；-表示不生长

结合表4和表5可以看出，A地点最高耐受的菌株为A1为丛毛单胞菌属(Comamonas)，最高耐受硒含量为50000μg/mL；B地点最高耐受的菌株为B4为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，最高耐受硒含量为45000μg/mL；C地点最高耐受的菌株为C3为肠杆菌属(Enterobacter)，最高耐受硒含量为50000μg/mL；D地点最高耐受的菌株为D6为克雷伯氏菌属(Klebsiella)，最高耐受硒含量为50000μg/mL。

除了各地点最耐硒的细菌外，能够耐受45000μg/mL的有A2普罗维登斯菌属(Providencia)，最高耐受40000μg/mL的细菌有A3和C1均为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、D3肠杆菌属(Enterobacter)，最高耐受35000μg/mL的细菌有B2和D1均为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、C2泛菌属(Pantoea)。最高耐受25000μg/mL的细菌有D2香味菌属(Myroides)，最高耐受15000μg/mL的细菌有B3芽孢杆菌属(Bacillus)，最高耐受5000μg/mL的细菌有A4和B1均为芽孢杆菌属(Bacillus)。

由此说明经过初筛后的细菌均能在5000μg/mL固体培养基上生长，赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)具有较强的耐硒能力，能在35000μg/mL-50000μg/mL范围内生长，芽孢杆菌属(Bacillus)的耐硒能力较弱，最高耐受浓度为15000μg/mL。

2.4耐硒菌株的鉴定

2.4.1耐硒菌株形态观察

纯培养的四株耐硒菌株，于30℃培养24h后，菌株的形态如图2所示。

从图2中可以看出，A1菌株白色不透明，圆形易挑起，边缘整齐，质地软，中等大小。B4菌株白色半透明，不规则易挑起，边缘啮蚀，质地湿润。C3菌株白色不透明，圆形易挑起，边缘整齐，表明光滑，质地软，中等大小。D6菌株白色圆形，边缘整齐不透明，质地湿润易挑起，中等大小。

2.4.2耐硒菌株革兰氏染色

革兰氏染色是在细胞学中广泛运用的一种鉴别方法。革兰氏阳性菌经过染色后显现为蓝紫色，革兰氏阴性菌经过染色后呈现红色。本实验对获得的四株耐硒菌株进行革兰氏染色，结果如图3所示；

从图3可以看出，A1菌株呈杆状，被染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌；B4菌株呈长杆状，染色后呈现为紫色，为革兰氏阳性菌；C3菌株呈杆状被染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌；D6菌株呈杆状，被染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌。

2.4.3耐硒菌株的系统发育树构建

将筛选出四株耐硒菌株的16S rRNA序列与NCBI数据库进行对比，每一个菌株挑选七个一致性较高的序列，利用MAGE-X构建系统发育树，构建的发育树如图4所示。

从图4可以看出：A1菌与丛毛单胞菌属(Comamonas)的相似性较高，确定A1菌株为丛毛单胞菌属，将其命名为Comamonas testosteroni GX-A1；

B4菌与赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)的相似性较高，确定B4为赖氨酸芽孢杆菌属，将其命名为Lysinibacillus boronitolerans GX-B4；

C3菌与肠杆菌属(Enterobacter)的相似性较高，确定C3为肠杆菌属，将其命名为Enterobacter ludwigii GX-C3；

D6菌株与克雷伯氏菌属(Klebsiella)的相似性较高，确定D6为克雷伯氏菌属，将其命名为Klebsiellapneumoniaesubsp.rhinoscleromatis GX-D6。

2.5生长曲线

将筛选出四株耐硒菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，每隔两个小时测一次菌液的OD₆₀₀值，绘制生长曲线，结果如图5所示。

从图5可以看出：A1菌株0到10h为其对数期，生长迅速；10到22h为稳定期；

B4菌株于0到6h之间生长迅速，为菌株的生长对数期；6到12h仍能继续生长，但生长速率较之前的较低，此时仍为菌株的对数期；12到22h之间为菌株的稳定期；

C3菌株于0到8h之间生长迅速，为菌株生长的对数期，说明菌株C3能够很好的适应环境；8到16h之间菌株C3仍能继续生长，但其生长速率较之前有所下降，此时仍为菌株的对数期；16到22h之间菌株生长速率趋于平稳，说明菌株处于稳定期；

D6菌株0到12h为菌株的对数期，生长迅速；12到22h为菌株生长的稳定期。

由此可以看出，C3菌株比其余三个菌株生长稍快，C3与D6菌株比其余两个菌株在稳定期拥有更多的生物量。

2.6耐硒细菌对硒的去除率

设置不同硒浓度的液体培养基分别四株菌株，震荡培养6天后，测定培养基中残留的硒浓度，结果如图6所示。

从图6可以看出，四株菌株均能在0-5000μg/mL硒浓度下生长，且对硒具有较好的去除效果。其中，A1菌株于2000μg/mL硒浓度下其去除率达到最高为37.44％；B4菌株于3000μg/mL硒浓度下其去除率达到最高为34.1％；C3菌株于2000μg/mL时去除率达到最高为46.76％；D6菌株在4000μg/mL时，去除率达到最高为40.04％。

另外，硒浓度在0-4000μg/mL范围内，C3菌株的去除率均高于其他三株菌株，4000-5000μg/mL范围内，D6菌株的去除率均高于其他三株菌株。说明硒浓度在0-4000μg/mL范围内，C3菌株去除率效果最好，去除率最高为46.76％；在4000-5000μg/mL范围内，D6菌株的去除率效果最好，去除率最高为40.04％。

其次，四株菌株的去除率均表现出先上升后下降再趋向于平衡的趋势，这可能由于相对较低硒浓度时菌株具有较高的吸附能力，随着液体培养基中硒浓度的升高，菌体的吸附达到饱和状态。

综上所述，本发明筛选出的四株耐硒菌株具有除硒效果。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种菌株GX-D6及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 克雷伯氏菌属(Klebsiella pneumoniae subsp. rhinoscleromatis)

<400> 1

gcgccctccc gaaggttaag ctacctactt cttttgcaac ccactcccat ggtgtgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgtagcat tctgatctac gattactagc 120

gattccgact tcatggagtc gagttgcaga ctccaatccg gactacgaca tactttatga 180

ggtccgcttg ctctcgcgag gtcgcttctc tttgtatatg ccattgtagc acgtgtgtag 240

ccctggtcgt aagggccatg atgacttgac gtcatcccca ccttcctcca gtttatcact 300

ggcagtctcc tttgagttcc cggcctaacc gctggcaaca aaggataagg gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tttcacaaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc 420

tcacagttcc cgaaggcacc aaagcatctc tgctaagttc tgtggatgtc aagaccaggt 480

aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540

caattcattt gagttttaac cttgcggccg tactccccag gcggtcgatt taacgcgtta 600

gctccggaag ccacgcctca agggcacaac ctccaaatcg acatcgttta cggcgtggac 660

taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc acctgagcgt cagtctttgt 720

ccagggggcc gccttcgcca ccggtattcc tccagatctc tacgcatttc accgctacac 780

ctggaattct acccccctct acaagactct agcctgccag tttcgaatgc agttcccagg 840

ttgagcccgg ggatttcaca tccgacttga cagaccgcct gcgtgcgctt tacgcccagt 900

aattccgatt aacgcttgca ccctccgtat taccgcggct gctggcacgg agttagccgg 960

tgcttcttct gcgggtaacg tcaatcgaca aggttattaa ccttatcgcc ttcctccccg 1020

ctgaaagtgc tttacaaccc gaaggccttc ttcacacacg cggcatggct gcatcaggct 1080

tgcgcccatt gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca 1140

gttccagtgt ggctggtcat cctctcagac cagctaggga tcgtcgccta ggtgagccgt 1200

taccccacct actagctaat cccatctggg cacatctgat ggcatgaggc ccgaaggtcc 1260

cccactttgg tcttgcgaca ttatgcggta ttagctaccg tttccagtag ttatccccct 1320

ccatcaggca gtttcccaga cattactcac ccgtccgccg ctcgtcaccc gagagcaagc 1380

tctctgtgct accgctcgac tgca 1404

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (2)

1.一种耐硒菌株GX-D6，其分类学名为Klebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis，于2020年12月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61356，其基因序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的耐硒菌株GX-D6在去除土壤中硒的用途。

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