CN112543813A

CN112543813A - 雌激素诱导的癌症的诊断和预后方法

Info

Publication number: CN112543813A
Application number: CN201980036301.0A
Authority: CN
Inventors: 普拉迪普·S·坦沃
Original assignee: Newcastle University of Upon Tyne
Current assignee: Newcastle University of Upon Tyne
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-03-23
Also published as: EP3775262A4; US20210025872A1; AU2019240770A1; EP3775262A1; WO2019183683A1; US11994513B2

Abstract

本发明提供了用于检测个体中雌激素诱导的癌症的方法、鉴定有患上雌激素诱导的癌症的风险的个体的方法、以及用于确定或预测患有雌激素诱导的癌症的个体的预后的方法。本发明的方法包括确定从个体获得的生物样品(通常是血液样品)中ALPPL2的表达水平。

Description

雌激素诱导的癌症的诊断和预后方法

技术领域

本发明总体上涉及雌激素诱导的癌症的诊断和预后方法和方案，特别是子宫内膜癌和卵巢癌的方法和方案。

背景技术

子宫(子宫内膜)癌是全世界第五大最常见的妇科癌，每年诊断出超过60,000例新病例，并且有近10,000例死亡。无转移的子宫内膜癌患者的5年总生存率在74％至91％之间。然而，对于患有IV期子宫内膜癌的女性，长期生存率下降到20％。肥胖是一个独立的危险因素，大约50％的病例与高体重指数(BMI，>30kg/m²)有关。

子宫内膜癌在绝经后妇女中最常见。初潮早期和更年期晚期，或长期暴露于雌激素中，可导致子宫内膜生长延长，继而引起子宫内膜增生和癌症。肥胖妇女的肥大脂肪细胞是芳香化酶的主要来源，芳香化酶原位合成了过量的雌激素并促进子宫内膜腺癌。因此，雌激素水平的升高与子宫内膜癌的易感性密切相关。

大多数子宫内膜癌患者的标准治疗是大手术，通常是子宫切除术或双侧输卵管卵巢切除术(输卵管和卵巢切除术)。然而，子宫内膜癌患者的五年生存率很差，原因是该癌症通常仅在晚期才被诊断出来。

显然需要鉴定生物标志物以早期发现该疾病，从而使早期治疗成为可能。早期诊断可以对患者的预后产生重大影响。如果在I或II期诊断出子宫内膜癌，则五年生存率约为90％。然而，如果直到第三阶段或第四阶段才被诊断出癌症，五年生存率将急剧下降至仅约40％。大多数子宫内膜癌患者(约90％)具有子宫内膜样组织学特征，这与高雌激素(hyperestrogenic)状态显著相关。因此，鉴定雌激素反应性生物标志物对于早期检测雌激素水平升高和子宫内膜癌的诊断将特别有益。

当前没有普遍认可的用于子宫内膜癌的生物标志物。已显示高水平的癌蛋白stathmin与侵袭性子宫内膜癌和不良预后有关，然而，stathmin作为生物标志物的使用仅限于患有晚期子宫内膜癌的患者。子宫内膜癌患者可在术前进行血液检查以确定CA-125水平，然而CA-125作为子宫内膜癌生物标志物的实用性因缺乏特异性和敏感性、缺乏检测早期癌症的能力且预后能力差而受到限制。

仍然需要具有改善的诊断和预后能力的子宫内膜癌和相关癌的生物标志物。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种用于检测个体中雌激素诱导的癌症的方法，该方法包括执行以下步骤：

(a)确定在从个体获得的生物样品中胎盘样碱性磷酸酶2(ALPPL2)的表达水平；和

(b)将所确定的表达水平与一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中ALPPL2的表达水平进行比较，

其中相对于一个或多个参考样品中ALPPL2的表达水平，从个体获得的样品中的ALPPL2的升高的表达水平指示个体中雌激素诱导的癌症的存在。

确定ALPPL2的表达水平可以包括定性或定量确定ALPPL2蛋白的表达。或者，确定ALPPL2的表达水平可以包括定性或定量确定ALPPL2mRNA的表达。

可以对ALPPL2表达水平的确定进行一项或多项统计分析。示例性统计分析包括但不限于：接收者操作特性(receiver operator characteristic(ROC))分析、逻辑回归分析，斯皮尔曼等级相关相关(Spearman’s rank correlation analysis)分析和曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)。在一个示例性实施方案中，该方法包括确定统计值，并比较所述统计值，所述统计值源自从个体获得的样品和一个或多个参考样品中ALPPL2的表达水平。比较步骤可以包括例如ROC分析。

雌激素诱导的癌症可以为例如子宫内膜癌、卵巢癌或乳腺癌。在示例性实施方案中，雌激素诱导的癌症为子宫内膜癌或卵巢癌。

在示例性实施方案中，从个体获得的生物样品为流体样品，更通常是血液样品，例如全血、血浆或血清样品。通常，一个或多个参考样品为流体样品，更通常是血液样品，例如全血、血浆或血清样品。一个或多个参考样品可以来自已知不患有雌激素诱导的癌症的一个或多个个体。

在另一方面，本发明提供了一种用于鉴定有患上雌激素诱导的癌症风险的个体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中ALPPL2的表达水平；和

(b)将所确定的表达水平与一个或多个没有雌激素诱导癌症的参考样品中的ALPPL2的表达水平进行比较，

其中相对于一个或多个参考样品中的ALPPL2的表达水平，从个体获得的样品中ALPPL2的升高的表达水平指示个体患上雌激素诱导的癌症的风险增加。

通常，ALPPL2的升高的表达水平与雌激素水平正相关。

在另一方面，本发明提供了一种用于确定或预测患有雌激素诱导的癌症的个体的预后的方法，该方法包括执行以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中ALPPL2的表达水平；

(b)将所确定的表达水平与一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中的ALPPL2的表达水平进行比较；和

(c)基于所确定的表达水平和所述比较来确定或预测个体的预后。

在一个实施方案中，预测预后包括预测个体生存。

本发明还提供了用于检测和筛选雌激素诱导的癌症的试剂盒，其中该试剂盒包含一种或多种用于确定如以上实施方案中所定义的ALPPL2表达的试剂。

本发明还提供了一种计算机系统或设备，其被配置为帮助检测或诊断雌激素诱导的癌症、个体患上所述癌症的风险或患有所述癌症的个体的预后，其中使用计算机软件来分析与以上实施方案中所定义的ALPPL2的表达有关的数据，并提供关于个体的诊断、风险评估或预后预测。通常，计算软件还用于将所述数据与与一个或多个无癌参考样品中ALPPL2表达相关的数据进行比较。

本发明的另一方面提供了一种选择进行雌激素诱导的癌症的治疗的个体的方法，该方法包括：

(a)执行确定在源自个体的生物样品中如上实施方案中所定义的ALPPL2的表达水平的步骤，其中相对于一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中的ALPPL2的表达水平，源自个体的生物样品中的ALPPL2的表达水平指示个体中雌激素诱导的癌症的存在；和

(b)选择在(a)中确定为患有雌激素诱导的癌症的个体，进行所述癌症的治疗。

本发明的另一方面提供了一种用于监测个体对雌激素诱导的癌症的治疗性治疗的反应的方法，该方法包括：

(a)从个体获得第一生物样品，其中所述第一生物样品在开始治疗性治疗之前或之后获得；

(b)执行确定所述第一生物样品中的如上实施方案中所定义的ALPPL2的表达水平的步骤；

(c)从个体获得第二生物样品，其中在治疗性治疗开始后和获得所述第一生物样品后的时间点获得所述第二生物样品；

(d)执行确定所述第二生物样品中的上述实施方案中所定义的ALPPL2表达水平的步骤；和

(e)比较所述第一生物样品和所述第二生物样品中的ALPPL2的表达水平，

其中所述第一生物样品和所述第二生物样品之间的表达水平的变化指示个体是否对治疗性治疗有反应。

该方法可以进一步包括关于第三或后续样品的获得和执行步骤。通常，第一、第二和任何后续样品均为相同的体液。

本发明的另一方面提供了一种用于监测雌激素诱导的癌症的治疗性治疗的功效的方案，该方案包括：

其中所述第一生物样品和所述第二生物样品之间的表达水平的变化指示治疗性治疗是否有效。

所述方案可以进一步包括关于第三或后续样品的获得和执行步骤。通常，第一、第二和任何后续样品均为相同的体液。

上述方案也可以用于筛选用于治疗雌激素诱导的癌症的候选药物。

附图说明

在此，仅通过非限制性实例的方式，参考以下附图描述了本发明的实施方案。

图1.Ishikawa细胞的2D和3D培养物中的ALPPL2蛋白的免疫印迹。

图2.Ishikawa细胞以3D生长，并用雌激素(E2，10nmol/L)和孕酮(progesterone)(P4，100nmol/L)处理。(A)柱状图显示了不同治疗组(n＝3)的平均菌落大小。分析每个处理组的50个菌落的直径。(B)用E2和P4处理Ishikawa细胞并测定其增殖(n＝3)。(C)定量实时PCR分析施用E2和/或P4的Ishikawa类器官的cDNA中ALPPL2 mRNA的表达水平(n＝3)。(D)在不同处理条件下(n＝3)，在2D和3D环境中来自Ishikawa细胞的ALPPL2蛋白的免疫印迹分析。(E)E组中蛋白印迹的光密度定量。比例尺，100μm。结果代表平均值±SEM；*，P<0.05；**，P<0.01；****，P<0.0001。

图3.(A)该图显示了ALPPL2染色强度的定量(n＝3)。(B)来自E2和P4处理的小鼠子宫(n＝3)的cDNA的Alppl2 mRNA表达水平。(C)对来自E2和P4处理的小鼠子宫的蛋白裂解物进行蛋白印迹ALPPL2分析(n＝3只小鼠/组)。(D)ALPPL2蛋白印迹条带的光密度定量显示为条形图(n＝3)。(E)通过H-评分(H-score)定量ALPPL2染色强度，并以柱状图显示(n＝5)。HSecE，人类分泌型子宫内膜；HProE，人类增生子宫内膜。比例尺，100μm。结果代表平均值±SEM；*，P<0.05；**，P<0.01。

图4.(A)子宫内膜癌患者中ALPPL2表达的总体和(B)无病卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)分析(TCGA计划)。该分析是通过对数秩(log-rank)检验的P值进行中位数切割(median cut)而完成的。黑线，ALPPL2低的样品；红线，ALPPL2高的样品。(C)ALPPL2染色强度的定量显示为正常(n＝5)、1级(n＝16)、1-2级(n＝22)、2级(n＝20)、2-3级(n＝9)和3级(n＝25)子宫内膜癌患者的H评分。盒形-虚线图(Whisker box plot)代表具有最小值和最大值的中位数。与正常病例相比，通过曼-惠特尼U检验确定P值。(D)显示子宫内膜样腺癌相对于正常病例的ALPPL2表达水平的ROC曲线。(E)对癌性组织和正常邻近子宫组织的蛋白裂解物进行蛋白印迹，分析ALPPL2的表达(n＝9名患者每组)。显示了来自四名患者的正常组织和癌性组织的代表性蛋白印迹。(F)对F中的条带进行光密度定量，取平均值并显示为盒形-虚线图(n＝9)。Pt，患者；AUC，ROC曲线下的面积；CI，置信区间；HNormalAd，正常的邻近人子宫内膜；HendoCa，人类子宫内膜癌。比例尺，100μm。结果代表平均值±SEM；*，P<0.05；**，P<0.01。

图5.盒形-虚线图显示了子宫内膜癌患者和正常女性血浆中的(A)ALPPL2和(B)CA-125值。每个框代表最大值、上四分位数、中位数、下四分位数和最小值。(C)比较ALPPL2和CA-125对子宫内膜癌病例的鉴别能力。垂直线代表CA-125阈值(35U/mL)，高于该阈值女性将被送去看妇科医生。水平线代表ALPPL2阈值，该阈值是通过取所有对照样品的第75个百分位数选择的，并且将介于中位数和第75个百分位数之间的范围视为边界。(D)该表显示了ALPPL2-和CA-125阳性病例数，以及对照组。(E)条形图显示了通过CA-125和ALPPL2生物标志物筛选鉴定出的已知病例和对照样品总数的百分比。I级(F)、III/IV级(G)和所有(H)子宫内膜癌病例组及对照组的ALPPL2和CA-125的ROC曲线分析。AUC，ROC曲线下的面积；CI，置信区间。

图6.免疫印迹显示与无癌的阴性对照相比，在四个卵巢癌阳性组织样品中ALPPL2的表达增加。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。

如本发明所使用的，单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”也包括多个方面(即，至少一个或多个)，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“miRNA”包括单个miRNA以及两个或更多个miRNA。

在本说明书的上下文中，术语“约”应理解为是指本领域技术人员在实现相同功能或结果的情况下将认为等同于所述值的数字范围。

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。

“ALPPL2”是指胎盘样碱性磷酸酶2蛋白。根据上下文，在本文中也可以使用该术语来指代编码ALPPL2蛋白的基因、cDNA序列或mRNA序列。人ALPPL2是一种533个氨基酸的膜结合糖基化酶，包括一个19个氨基酸的N端信号肽。当以升高的水平存在时，细胞分泌ALPPL2。尽管本发明内容通常涉及在人类中发现的蛋白质和基因，然而本领域技术人员将理解，也考虑并涵盖了来自其他物种的人类序列同源物。编码人ALPPL2的cDNA位于国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)数据库中，登录号为NM_031313。SEQ ID NO:1列出了包括N端信号肽的人ALPPL2蛋白的示例性氨基酸序列。SEQID NO:2列出了成熟的人ALPPL2蛋白(减去N端信号肽)的示例性氨基酸序列。SEQ ID NO:3列出了人ALPPL2基因的示例性核苷酸序列。

术语“表达”在本发明中在其最广泛的上下文中用于表示基因或蛋白质的可测量到的(定性或定量可测量的)存在。如下文所述，考虑了确定或测量ALPPL2表达的多种方法。在一些实施方案中，测量ALPPL2的表达包括确定蛋白质或mRNA的水平。如本发明所用，术语“水平”和“量”可以互换使用，以指示量、半定量、相对量、浓度等。因此，这些术语涵盖样品中蛋白质或mRNA的绝对或相对的量或浓度，包括以平均水平和标准偏差表示的个体群体中的水平。

如本发明所用，术语“源自”是指源自或从中获得。术语“源自”和“来自”在本发明中可以互换使用。

如本发明所用，术语“个体”是指哺乳动物，包括人、灵长类动物、家畜(例如绵羊、猪、牛、马、驴)、实验室测试动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如狗、猫)和圈养的野生动物(例如狐狸、袋鼠、鹿)。通常，哺乳动物为人类或实验室测试动物。更典型地，哺乳动物为人类。

本发明人研究了子宫内膜癌细胞的分泌蛋白质组(secretome)。具体而言，分析了子宫内膜癌类器官的转录组，并确定ALPPL2(碱性磷酸酶，胎盘样2)是子宫内膜癌类器官中最重要的、高度分泌的蛋白质。发明人已经发现，在体内和体外，雌激素水平和ALPPL2表达之间存在显著的正相关。已显示在子宫内膜癌患者的组织和血浆样品以及人类卵巢癌患者的组织样品中ALPPL2均过表达。在子宫内膜癌患者中，ALPPL2的过表达还显示与存活率低有关。本文举例说明的本研究的令人惊讶的发现表明，ALPPL2是用于子宫内膜癌和卵巢癌的有用的生物标志物，用于子宫内膜癌和卵巢癌的基于血液(例如基于血浆)的诊断和预后。与CA-125相比，ALPPL2显示出显著改善的诊断和预后潜力。

因此，本发明的一个方面提供了一种用于检测个体中雌激素诱导的癌症的方法，该方法包括执行以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中胎盘样碱性磷酸酶2(ALPPL2)的表达水平；和

其中相对于一个或多个参考样品中的ALPPL2的表达水平，从个体获得的样品中的ALPPL2的升高的表达水平指示个体中雌激素诱导的癌症的存在。

本发明的另一方面提供了一种用于鉴定有患上雌激素诱导的癌症风险的个体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中的ALPPL2的表达水平；和

(b)将所确定的表达水平与一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中的ALPPL2的表达水平进行比较，

其中相对于一个或多个参考样品中的ALPPL2的表达水平，从个体获得的样品中的ALPPL2的升高的表达水平指示个体患上雌激素诱导的癌症的风险增加。

本发明的另一方面提供了一种用于确定或预测患有雌激素诱导的癌症的个体的预后的方法，该方法包括执行以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中的ALPPL2的表达水平；

本发明的实施方案提供了适合于快速和早期检测和诊断雌激素诱导的癌症的生物标志物，从而使得能够在疾病进展至不易治疗的晚期之前实施适当的治疗和患者管理策略。因此，本发明还提供了通过采用ALPPL2作为生物标记物便于早期干预以改善此类癌症患者的预后的方法。

在本说明书的上下文中，术语“雌激素诱导的癌症”是指与雌激素产生和活性相关的癌症。通常，“雌激素诱导的癌症”是其中雌激素与癌症的病因有关并且与癌症的风险增加相关的癌症。术语“雌激素相关”和“与雌激素有关”可以与“雌激素诱导的”互换使用。雌激素诱导的癌症的例子包括子宫内膜癌(子宫癌)、卵巢癌和乳腺癌。

在本发明的特定实施方案中，雌激素诱导的癌症可以是子宫内膜(子宫)癌或卵巢癌。通常，癌症是癌(carcinoma)。可以根据本发明内容诊断的子宫内膜或卵巢癌的其他示例性形式包括肉瘤(sarcomas)和癌肉瘤(carcinosarcomas)。

用于确定ALPPL2表达水平的生物样品可以源自任何合适的体液或组织。例如，样品可以包含血液(例如红细胞、白细胞、全血、血浆或血清)、唾液、痰、尿液、呼吸、凝气或组织。当样品包含组织时，通常该组织是受雌激素诱导的癌症影响的组织。在一个特定的实施方案中，样品包含全血、血浆或血清。确定可以从个体中获得的用于本发明的方法的合适的生物样品是在本领域普通技术人员的能力范围内的。

可以在收集之后几乎立即(即，作为新鲜样品)根据本发明对生物样品进行处理和分析，以用于确定癌症的存在，或者可以将其存储以用于后续分析。如果需要或要求保存生物样品，本领域技术人员应理解，理想情况下应将其保存在保持样品内生物标志物完整性的条件下(例如-80℃)。

本领域技术人员将理解，确定或测量生物样品中ALPPL2表达的方法本质上可以是定量的、半定量的或定性的。例如，定量分析可以在适当的误差范围内(例如，平均值+/-标准偏差)提供样品中ALPPL2的量或浓度。相比之下，半定量或定性分析通常会提供样品中ALPPL2相对含量的指示。这可以包括将第一样品中的ALPPL2的量与第二样品中的ALPPL2的量进行比较，并且确定第一样品和第二样品之间的相对量。

根据本发明，可以使用任何合适的方法或技术来测量或确定ALPPL2表达。本领域技术人员将理解，本发明不限于所提及的确定和/或定量ALPPL2表达的方式。本领域技术人员将能够确定在任何给定情况下检测或测量表达的适当手段，而无需过度的负担或实验，也无需进一步的发明。

用于确定蛋白或多肽水平上的ALPPL2表达的示例性方法包括，例如，使用与ALPPL2蛋白结合的抗体的免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫印迹、2D凝胶电泳(包括2D-DIGE)、多重蛋白质表达测定、蛋白印迹、免疫沉淀测定、HPLC、LC/MS、流式细胞仪、柱色谱和光谱分析，包括例如质谱、磁共振成像(MRI)光谱和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。

用于确定在mRNA水平上的ALPPL2表达的示例性方法包括PCR、RNA和cDNA微阵列、连接酶链反应、寡核苷酸连接测定、下一代测序、凝胶电泳、RNA印迹、流式细胞术和原位杂交。示例性PCR方法包括但不限于逆转录酶PCR、实时PCR、定量PCR(qPCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)和多重PCR。

仅作为示例，悬浮液或平面阵列中的颗粒(例如珠)可以用作测定蛋白或mRNA表达的测定法的基础。例如，可以将诸如抗体或寡核苷酸的生物分子缀合至珠的表面以分别结合和捕获ALPPL2蛋白或mRNA。然后可以将本领域技术人员已知的一系列检测方法，例如流式细胞术或其他合适的成像技术，用于表征珠以及检测蛋白或mRNA的存在。

为了本方法的目的，通常将ALPPL2的表达水平与参考水平进行比较，其中参考水平代表不存在雌激素诱导的癌症。参考水平可以来自一个或多个参考样品。在本发明中，术语“参考”或“参考样品”是指一个或多个来自被诊断为没有雌激素诱导的癌症的个体或个体组的生物样品。替代地或另外地，在某些情况下，期望将来自评估对象的ALPPL2表达水平与一个或多个参考样品进行比较，其中，参考样品是指来自具有确诊的雌激素诱导的癌症的个体或个体组的一个或多个生物样品。在这种情况下，确诊可以包括对雌激素诱导的癌症的特定阶段或等级的确诊。

“参考样品”可以包括来自一个或多个个体的数据的汇编，所述一个或多个个体已经确认了对于本发明的目的可作为“参考”或“对照”的诊断。即，为了与从被评估对象获得的样品进行比较的目的，不需要专门或立即获得用作参考样品或对照的样品。

因此，可以使用来自健康个体组(即没有雌激素诱导的癌症)的生物样品预先确定ALPPL2表达的参考水平，以获得准确的中值或均值。可以确定各种样品的参考水平，例如各种细胞和组织类型以及各种体液。为了最准确的检测，用于比较的参考样品包括与所提供的方法中的被评估对象相同类型的样品。参考水平还可以根据年龄、性别或其他因素进行匹配。

根据本发明，可以对来自一个或多个样品(包括处于比较中的样品)的表达数据进行一种或多种统计分析，从而有助于诊断或预后方法。统计分析可以包括，例如接收者操作特性(ROC)分析、包括具有k-fold验证的逻辑回归的逻辑回归分析、斯皮尔曼等级相关分析、曼-惠特尼U检验以及皮尔逊相关系数(PCC)值的计算。

本发明的方法可以用于检测或诊断先前没有诊断出或没有确诊癌症的个体。这种诊断可以在没有癌症的临床症状的情况下进行。例如由于家族病史、肥胖症、雌激素暴露、确定的雌激素水平、一种或多种基因突变的存在或潜在疾病或状况的存在，个体可能会表现出罹患雌激素诱导的癌症的风险增加、易患或易感雌激素诱导的癌症。举例来说，患有Lynch综合征(遗传性非息肉性结直肠癌)的个体通常与错配修复基因(例如MLH1、MSH2、MSH6或PMS2)的胚系突变相关时，罹患子宫内膜癌或卵巢癌的风险增加。同样，BRCA基因突变的个体易患乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌。本领域技术人员将理解，存在许多因素(包括症状、突变和病状)使个体易患雌激素诱导的癌症，或导致罹患这种癌症的风险增加，并且本发明的范围不限于所提及的任何一种因素。

或者，本文公开的方法可以用于确认由不同方式提供的诊断或初步诊断，例如超声、组织活检、MRI或PET扫描，或针对与癌症相关的一种或多种其他生物标志物的血液测试。因此，本方法可以独立使用，或与一种或多种其他诊断或预后方法、测试或测定法结合使用。因此，根据本发明公开的实施方案进行的诊断可以与诊断雌激素诱导的癌症的其他手段相关联。

试剂盒

检测或测量ALPPL2表达所需的所有必需材料和试剂可在试剂盒中组装在一起。因此，本发明提供了用于检测或确定生物样品中ALPPL2表达水平的诊断和测试试剂盒，以便于检测或诊断雌激素诱导的癌症、罹患此类癌症的风险、或患有此类癌症的个体的预后。试剂盒通常包含一种或多种用于执行本文公开的方法的试剂和/或装置。例如，试剂盒可包含用于从生物样品中分离细胞或细胞成分的试剂，例如用于提取或分离RNA或蛋白的试剂、和/或用于测量ALPPL2 mRNA或蛋白表达的试剂。

试剂盒还可以包括合适的软件、或访问合适的软件的途径，以便于参考表达水平与来自待分析的个体的表达水平之间的比较，并且便于可以在这种比较中采用的统计分析。因此，本发明还提供了一种计算机系统或装置，其被配置为帮助检测或诊断雌激素诱导的癌症、患上这种癌症的风险或患有这种癌症的个体的预后，其中使用计算机软件来分析与如本文所定义的ALPPL2的表达有关的数据，并提供针对个体的诊断或预后预测。通常，计算软件还用于将所述数据与与一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中的ALPPL2表达有关的数据进行比较。

试剂盒还可包括合适的装置，用于接收生物样品，用于实施本发明所述方法的一个或多个容器或器皿，阳性和阴性对照(包括参考样品)以及其中包含的试剂盒组分的根据本发明公开的方法的使用说明。

治疗方案

根据上文描述的本发明的方法，被鉴定为患有雌激素诱导的癌症的个体可以被选择进行治疗或分至治疗组，其中为了治疗癌症，可以采用适当的治疗方案或开具处方。

因此，在一个实施方案中，本文公开的方法可以包括以下步骤：将被鉴定为患有雌激素诱导的癌症的个体暴露于(即，使其接受)用于治疗所述癌症的治疗方案。

(a)执行确定在源自个体的生物样品中的如上实施方案中所定义的ALPPL2的表达水平的步骤，其中相对于一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中的ALPPL2的表达水平，源自个体的生物样品中的ALPPL2的表达水平指示个体中雌激素诱导的癌症的存在；和

待采用的治疗性治疗或方案的性质可由本领域技术人员确定，并且通常取决于因素，例如但不限于个体的年龄、体重和总体健康状况。合适的治疗性治疗和治疗方案是本领域技术人员已知的，其非限制性实例包括手术、化学疗法和/或放射疗法。

如本发明所用，术语“治疗”和“处理”是指以任何方式补救(remedy)癌症或以其他方式预防、阻碍、延缓或逆转癌症或其一种或多种症状的进展的任何和所有用途。因此，术语“治疗”等应在其最广泛的范围内考虑。例如，治疗不一定意味着要治疗患者直至完全康复。在表现出多种症状或以多种症状为特征的病症中，治疗或预防不一定需要补救、预防、阻碍、延缓或逆转所有所述症状，而是可以预防、阻碍、延缓或逆转一种或多种所述症状。

不受理论或特定实践模式的束缚，从本发明内容还可以得出，本发明公开的方法可用于监测个体对治疗性治疗的反应，并监测治疗性治疗对于雌激素诱导的癌症的功效，由此在两个或更多个单独的时间点，包括例如在处理开始之前、在处理过程中以及停止处理之后，在从个体获得的生物样品中确定(例如，测量)ALPPL2的表达，以确定个体是否对处理充分反应，以及该处理是否有效，例如在抑制癌症的发生或进展中是否有效。

因此，本发明的一个方面提供了一种用于监测个体对雌激素诱导的癌症的治疗性治疗的反应的方法，该方法包括：

其中第一生物样品和第二生物样品之间表达水平的变化指示个体是否对治疗性治疗有反应。

本发明还提供了用于监测雌激素诱导的癌症的治疗性治疗的功效的方案，所述方案包括：

其中第一生物样品和第二生物样品之间的表达水平的变化指示治疗性治疗是否有效。

该方法或方案可以进一步包括关于第三或后续样品的获得及执行步骤。通常，第一样品、第二样品和任何后续样品都为相同的体液。

在一个实施方案中，第一样品和第二(或后续)样品之间ALPPL2表达的变化可以指示治疗方案有效。当本文公开的方案指示治疗方案无效时(即，第一样品和第二样品或后续样品之间ALPPL2的表达没有变化)，该方案可以进一步包括改变或修改治疗方案以提供更有效或积极的治疗。这可以包括向个体施用额外剂量的个体正在接受治疗的相同药剂或改变药物的剂量和/或类型。

本发明还提供了用于筛选候选化合物和组合物作为用于治疗雌激素诱导的癌症的治疗剂的方法。例如，可以通过选择能够调节ALPPL2表达水平的化合物或组合物来获得合适的治疗剂。这种筛选治疗剂的方法可以在体内或体外进行。例如，可以通过以下步骤进行筛选方法：将候选化合物或组合物施用于个体(例如实验室测试动物个体)，测量来自个体的生物样品中ALPPL2的表达水平；与未与候选化合物或组合物接触的对照相比，选择增加或降低ALPPL2表达水平的化合物或组合物。

选择用于治疗雌激素诱导的癌症、监测这种治疗的功效或筛选候选药剂的化合物或组合物的方法也可以通过以下方式使用：例如，从个体(例如实验室测试动物个体)获得生物样品；在多种化合物或组合物的存在下分别保持样品的等分试样；比较每个等分试样中ALPPL2的表达；相对于在其他化合物或组合物存在下ALPPL2的表达水平，选择一种化合物或组合物，该化合物或组合物显著改变含有该化合物或组合物的等分试样中ALPPL2的表达水平。

将会意识到，上述术语和相关联的定义仅用于解释目的，而不是限制性的。

为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施方案。

在本说明书中对任何先前出版物(或从其衍生的信息)或任何已知问题的引用均不是，也不应被视为对该先前出版物的承认或接受或任何形式的暗示(或从中获得的信息)或已知物质构成了本说明书所涉领域的常识。

实施例

实施例1-实验程序

细胞系和培养条件

在含5％CO₂的37℃的潮湿气氛中在MEM(HyClone)培养基(补充有5％热灭活的FBS(Bovogen Biologics)、2mmol/L L-谷氨酰胺(HyClone)和抗生素(50U/mL青霉素，50mg/L链霉素；Gibco)中培养人子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa(Sigma#99040201)。通过短串联重复序列(STR)DNA分型(DNA profiling)方法进行细胞系鉴定，并使用MycoAlert^TM Plus支原体检测试剂盒(Lonza)常规检测细胞中的支原体污染。

临床样品

人子宫内膜癌患者样品：使用经纽卡斯尔大学人类研究伦理委员会(Universityof Newcastle Human Research Ethics Committee)批准的方案，在约翰·亨特医院(JohnHunter Hospital)从经历肿瘤切除或手术减灭的患者中收集人子宫内膜癌组织样品和邻近的正常组织样品。将新鲜的组织样品运输到实验室，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并固定在10％的福尔马林缓冲液中以进行石蜡包埋和切片。相应的正常邻近组织切片和肿瘤切片也被快速冷冻并储存在液氮中用于蛋白质分离和蛋白印迹分析。

人血浆样品：纽卡斯尔大学人类研究伦理委员会批准了收集人血浆样品的方案。从澳大利亚维多利亚癌症生物库(Victorian Cancer Biobank,Australia)收集正常和子宫内膜腺癌患者的血浆样品。

组织微阵列：免疫组织化学分析了包括97个癌病例(1、2和3级)和5个正常切片的子宫内膜癌组织微阵列(EMC1021，US Biomax)的ALPPL2蛋白表达。使用Halo^TM图像分析平台对ALPPL2染色强度进行定量；计算H-评分，并将其用于建立正常和腺癌病例之间的接收者操作特性(ROC)曲线。

TCGA数据：使用来自TCGA的子宫癌数据集(Cancer Genome Atlas：www.cancergenome.nih.gov)验证了ALPPL2或MUC16表达与患者存活率之间的关联。TCGA微阵列基因表达数据用于计算548个肿瘤样品的ALPPL2或MUC16 mRNA表达z值(Z-score)。使用±2的z值作为临界值，以将样品分为高和低ALPPL2或MUC16表达组。使用癌症基因组学cBioPortal(cBioPortal for Cancer Genomics)(Cerami et al,Cancer Discov,2012,2:401-4)对这两组患者进行了整体且无病的Kaplan-Meier生存分析。

动物和激素治疗

纽卡斯尔大学动物保健与伦理委员会批准了小鼠实验的所有程序。为了研究类固醇激素的作用，将8-12周大的雌性C57BL/6小鼠切除了卵巢，并休息7天。卵巢切除术后一周，用17-β-雌二醇(每粒0.72mg，90天释放，n＝3)或17-β-雌二醇和孕酮(每粒分别0.72mg和100mg，90天释放，n＝3，美国创新研究(Innovative Research of America))的激素颗粒皮下植入小鼠。有皮下切口但无颗粒的小鼠用作对照(Sham，n＝3)。3个月后，收集子宫组织，进行福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)处理，和蛋白或RNA分离物的速冻。

RNA-Seq和数据分析

按照制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从2D单层和3D生长的Ishikawa类器官分离总RNA。如先前所述(Sahoo et al,Oncotarget,2017,8:71400-17)进行文库制备、测序和读段(read)计数分析。广义log2倍数变化(GFOLD)值大于2的转录本被认为具有统计学意义(Feng et al,Bioinformatics,2012,28:2782-8)。

3D类器官形成分析和免疫荧光染色

将5000个Ishikawa细胞/孔一式三份地在100μL培养基中接种到涂覆有减少的生长因子基底膜提取物薄层(

RGF BME:Trevigen)的96孔组织培养板上，并使其形成类器官。24小时后，对类器官进行了所需的激素处理：10nmol/L雌激素(β-雌二醇，Sigma#E8875)和100nmol/L孕酮(甲羟孕酮17-乙酸盐，Sigma#M1629)。每48小时更换一次具有所需激素浓度的培养基。在第7天，测量菌落大小，并使用JuLI^TMStage全自动实时细胞荧光成像分析系统(Stage Real-Time Cell History Recorder)(NanoEnTek)在37℃、5％CO₂加湿的培养箱中拍摄图像。处理后72小时，将细胞与

3D试剂(Promega)在室温下孵育30分钟，并使用FLUOstar OPTIMA(BMG Labtech)记录发光信号。将Ishikawa 3D类器官固定在4％多聚甲醛中(Electron Microscopy Sciences,ProSciTech)20分钟并进行处理以进行免疫荧光分析，如前所述(Sahoo et al,Oncotarget,2017,8:71400-17)。

免疫印迹

子宫内膜癌样品：将人子宫内膜癌样品、小鼠子宫组织和Ishikawa细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)的冰冷的RIPA(放射免疫沉淀测定)缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7.5，150mmol/L NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解。将裂解物在4℃下以12000rpm离心10分钟，并收集上清液。将含有相同蛋白质含量的纯化的裂解物的等分试样在95℃的1x Laemmli样品缓冲液(0.04mol/L Tris-HCl pH 6.8、0.2％SDS，0.01％溴酚蓝，10％β-巯基乙醇和10％甘油)中煮沸5分钟并用10％SDS-PAGE凝胶分离。将蛋白条带电泳转移到硝酸纤维素印迹膜(GE Healthcare Life Sciences)上，在室温下在含有5％脱脂奶(w/v)的TBS-T(0.1％Tween 20，在TBS中)封闭1小时，然后用第一抗体ALPPL2(1:500稀释，Santa Cruz Biotechnology#sc-134255)在4℃下孵育过夜。将膜洗涤并与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠第二抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在室温下孵育1小时。再次在TBS-T中洗涤膜，使用化学发光底物(Millipore)显影以检测HRP，并通过化学发光检测蛋白条带(Fujifilm LAS-4000)。GAPDH被用作上样对照。使用ImageJ软件(NIH,USA)进行光密度定量。

卵巢癌样品：将人卵巢癌样品在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)的冰冷的RIPA(放射免疫沉淀试验)缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7.5、150mmol/L NaCl，1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解中。将裂解物在4℃下以12000rpm离心10分钟，并收集上清液。将裂解物在4℃下以12000rpm离心10分钟，并收集上清液。将含有相同蛋白质含量的纯化的裂解物的等分试样在95℃的1x Laemmli样品缓冲液(0.04mol/L Tris-HCl pH6.8、0.2％SDS，0.01％溴酚蓝，10％β-巯基乙醇和10％甘油)中煮沸5分钟并用10％SDS-PAGE凝胶分离。将蛋白条带电泳转移到硝酸纤维素印迹膜(GE Healthcare LifeSciences)上，在室温下在含有5％脱脂奶(w/v)的TBS-T(0.1％Tween 20，在TBS中)封闭1小时，然后用第一抗体ALPPL2(1:500稀释，Santa Cruz Biotechnology#sc-134255)在4℃下孵育过夜。将膜洗涤并与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠第二抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories)在室温下孵育1小时。再次在TBS-T中洗涤膜，使用化学发光底物(Millipore)显影以检测HRP，并通过化学发光检测蛋白条带(Fujifilm LAS-4000)。GAPDH被用作上样对照。使用ImageJ软件(NIH,USA)进行光密度定量。

组织学、免疫组织化学(IHC)和数字量化

为了进行组织学分析，将人子宫内膜癌组织和小鼠子宫在10％中性福尔马林缓冲液中于4℃固定过夜，并转移至70％乙醇中直至进一步处理。处理福尔马林固定的组织，包埋在石蜡中，切成5μm的厚度。使用先前描述的(Sahoo et al,Mol Cancer Res,2018 16(2):309-321)标准方案进行苏木精和曙红染色和免疫组织化学。将组织切片与第一抗体ALPPL2(1:50稀释，Santa Cruz Biotechnology#sc-134255)在4℃下孵育过夜，然后与过氧化物酶偶联的第二抗体(Thermo Fisher Scientific)和DAB底物(Sigma)孵育以检测结合的抗体。用苏木精对组织进行染色以使细胞形态可视化。使用Aperio AT2幻灯片扫描仪(Leica Biosystems,Victoria,Australia)以相同的增益和曝光时间捕获图像。使用Halo^TM图像分析平台进行定量IHC分析，并使用Area Quantification v1.0算法(Indica Labs,New Mexico,USA)计算DAB染色的像素强度。免疫组织化学强度评分(H-Score)是根据像素强度值(强染色的像素的3x％+中等染色的像素的2x％+弱染色的像素的1x％的总和)计算得出的。

RNA提取、第一链cDNA的合成和qRT-PCR

按照制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从雌激素或孕酮处理的小鼠子宫和Ishikawa细胞中分离总RNA。使用RT2 First Strand Kit(Qiagen)将250ng总RNA用于cDNA合成。使用序列特异性Alppl2引物扩增cDNA。通过预孵育步骤和40个扩增循环(包括变性、退火和延伸片段)，在7900HT FAST Thermocycler(Applied Biosystems)上使用RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix(Qiagen)进行实时定量PCR(Q-PCR)。相对定量[比较Ct(2^-ΔΔCt)方法]用于比较不同治疗组中靶基因和管家基因(Gapdh)的表达水平。引物序列为：人ALPPL2(F:5’TGTTACCGAGAGCGAGAGC3’(SEQ ID NO:4),R:5’GTGGGTCTCTCCGTCCAG 3’(SEQ ID NO:5))，小鼠Alppl2(F:5’ACACATGGCTCTGTCCAAGA 3’(SEQ ID NO:6)，R:5’TCGTGTTGCACTGGTTGAAG 3’(SEQ ID NO:7))，人GAPDH(F:5’GCCACATCGCTCAGACACCAT 3’(SEQ ID NO:8)，R:5’GAAGGGGTCATTGATGGCAA 3’(SEQ ID NO:9))和小鼠Gapdh(F:5’TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC 3’(SEQ ID NO:10)，R:5’AAGATGGTGATGGGCTTCCCG 3’(SEQ IDNO:11))。

ELISA

使用人ALPPL2(CUSABIO Life science#CSB-EL001633HU)和CA-125(Abcam#ab195213)ELISA试剂盒按照制造商的说明分析正常和子宫内膜腺癌患者的血浆ALPPL2和CA-125水平。简而言之，将测定板与标准品和样品一起孵育。孵育后，将板与生物素和HRP-亲和素标记的抗体孵育1小时。洗涤后，用比色试剂使板显影并在450nm波长下读数。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.02软件进行统计分析。重复所有体外实验三次，每次重复使用三个生物学复制，数据表示为平均值±SEM。统计分析是通过学生的t检验(未配对，双尾)进行的。使用Mann-Whitney测试比较各组的ALPPL2和CA-125蛋白水平。卡方检验或Fisher精确检验用于分类数据。使用Kaplan-Meier分析和对数秩检验评估了总生存期和无病生存期之间的差异。使用接收者操作特性曲线(AUC)下的面积比较ALPPL2和CA-125生物标志物的预后能力；AUC＝0表示在临床实践中极不可能发生，接近0.5的值表示区分能力接近偶然，而AUC＝1表示诊断测试在疾病与正常之间的区分上是完美的。P<0.05被认为在统计学上是显著的。

实施例2-ALPPL2作为人子宫内膜癌类器官中的分泌蛋白

为了鉴定用于诊断子宫内膜癌患者的潜在肿瘤生物标记物，发明人表征了子宫内膜癌细胞的分泌蛋白质组。为了表征人子宫内膜癌细胞的分泌蛋白质组，发明人在细胞外基质上三维(3D)培养Ishikawa细胞以形成类器官。与常规的二维培养相反，类器官的培养是有益的，因为类器官是自组织的、稳定的并且类似于起源组织。子宫内膜类器官模仿体内子宫腺体，对类固醇信号产生反应并分泌“子宫乳”的成分。

以3D形式形成的子宫内膜癌类器官通常从单个细胞开始，以组织形成相关的多细胞极化(由顶侧的GM130显示)和腺体(由肌动蛋白丝排列显示)结构。与其他蛋白质(核蛋白、细胞质和膜性蛋白)相比，在3D环境中，通过获取天然腺体模式，子宫内膜癌细胞在本质上转变为分泌型，并合成了大量分泌蛋白(数据未显示)。与Ishikawa细胞的单层细胞相比，Ishikawa类器官的转录组分析确定了111个分泌蛋白编码基因(90个上调，21个下调)(>2倍变化，P<0.05)。对所有高度显著(GFOLD>2；P<0.05；eFDR，1)转录本的进一步累积分析显示，ALPPL2是Ishikawa类器官中分泌的最丰富的蛋白编码基因(约80倍)。ALPPL2表达使用免疫印迹在翻译水平上得到验证，并在Ishikawa类器官中显示出与RNA-seq数据一致的独特表达(图1)。这些结果表明子宫内膜癌细胞以其天然状态大量分泌ALPPL2。

实施例3–子宫内膜癌的类器官生长和ALPPL2表达显示对雌激素和孕酮的相似的趋势

发明人在此证明，施用雌激素(E2)后，Ishikawa类器官的大小和增殖增加，并且孕酮(P4)抵消了E2的促有丝分裂作用(图2A和2B)。当子宫内膜癌细胞分泌ALPPL2时，发明人怀疑E2介导的子宫内膜癌细胞增殖是否也刺激了ALPPL2表达。在单独的E2、单独的P4或在E2和P4中生长的Ishikawa类器官中，对ALPPL2进行了实时定量PCR分析。在E2处理的类器官中，ALPPL2 mRNA表达显著上调，而P4抑制了这一效果(图2C)。ALPPL2的过表达也通过对用E2和/或P4处理的Ishikawa细胞和类器官的总细胞裂解物的蛋白印迹分析进行了证实(图2D和2E)。结果得出结论，E2以升高的ALPPL2表达促进Ishikawa类器官的增殖。

实施例4-类固醇激素调节小鼠和人子宫中ALPPL2的表达

为了验证体内ALPPL2对类固醇激素的反应，将野生型C57BL/6小鼠切除卵巢，并用溶媒、E2或E2和P4治疗3个月(每次处理n＝3)。通过组织学分析证实了类固醇激素对小鼠子宫的作用，与用E2和P4治疗的子宫相比，E2治疗组的子宫内膜增生增加(数据未显示)。免疫组织化学分析显示，在E2处理的小鼠中ALPPL2表达增加，而在E2和P4处理的小鼠中，P4减弱了E2的作用(图3A)。在E2和/或P4处理的小鼠子宫中ALPPL2的表达也已在mRNA和蛋白质水平确定(图3B-3D)。还研究了月经周期的增生(E2应答)和分泌期(P4应答)期间的ALPPL2蛋白表达。与增生性子宫内膜相比，人类分泌性子宫内膜显示出适度的ALPPL2表达(图3E)。综上所述，这些结果表明，ALPPL2是一种E2响应基因，可以通过ALPPL2表达水平检测子宫的高雌激素状态。

实施例5–ALPPL2在子宫内膜腺癌中的预后意义

已经在“非对立雌激素假说(unopposed estrogen hypothesis)”的框架内描述了性-类固醇激素与子宫内膜癌之间的正相关性，这暗示着具有高内源性雌激素水平的女性患子宫内膜癌的风险增加。在本研究中，发明人发现ALPPL2表达与E2浓度的增加正相关。为了评估这些发现在临床队列中的相关性，分析了来自TCGA(癌症基因组图谱(The CancerGenome Atlas))子宫内膜癌子集(uterine corpus endometrial carcinoma subset)的公开可用RNA-seq基因表达数据。TCGA数据分析显示，ALPPL2的扩增与子宫内膜癌患者的不良预后密切相关。用中位数切割和对数秩检验对548个样品进行的Kaplan-Meier分析显示，总(Cox危险比为0.2183，95％CI：0.0458-1.041，P＝0.0139)和无病生存时间(Cox危险比为0.8976，95％CI:0.2062-3.908，P＝0.5067)存在显著差异，这将ALPPL2与不良预后联系起来(图4A和4B)。与低ALPPL2表达(16％死亡)的患者相比，发现高ALPPL2表达的患者的总生存率降低(36％死亡)。

为了测试ALPPL2蛋白水平在子宫内膜癌患者中的预后价值，在福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织微阵列上进行了免疫组织化学，该阵列由61个低级别和30个高级别子宫内膜腺癌组成(表1)。

表1.子宫内膜癌患者中的临床病理变量与ALPPL2表达的关系

与正常子宫内膜相比，在腺癌病例中平均ALPPL2蛋白染色强度更高(图4C；ALPPL2H-score：正常，159±5.83vs腺癌，180.1±4.37；P＝0.0174)。此外，对不同等级的腺癌的分析也表明，与正常人相比，ALPPL2蛋白表达显著增加(图4C)。正常vs腺癌患者的接收者操作曲线(ROC)下的对应面积为0.82(95％CI 0.69-0.93，P＝0.0197)(图4D)。此外，发明人比较了来自同一患者的子宫内膜癌组织与相应的正常相邻组织之间的ALPPL2表达水平。在进行蛋白质分离之前，对所有正常的邻近组织和子宫内膜癌组织切片进行了组织学分析。与组织微阵列数据一致，与正常邻近子宫内膜相比，蛋白印迹分析确定了子宫内膜癌组织中ALPPL2的显著上调(图4E和4F)。总体而言，这些数据表明子宫内膜癌期间ALPPL2蛋白的显著上调可用于患者的预后。

TCGA数据集分析还证明，与CA-125相比，ALPPL2是患者存活的更好的预测指标(MUC16表达：高，8.6％死亡，低，17.9％死亡；数据未显示)。这些数据表明，ALPPL2上调是子宫内膜癌患者的不良预后的指标。

实施例6–ALPPL2作为子宫内膜癌临床上有用的基于血液的肿瘤标志物

分析了100个不同组织学类型(低级别和高级别)的子宫内膜癌和60名正常女性的血浆中的ALPPL2表达并将其与CA-125水平进行比较。I级子宫内膜癌患者中位ALPPL2水平显著较高(对照，1.172ng/mL，vs病例，1.486ng/mL；P<0.0001)，而晚期疾病(III/IV级)患者显示出较高的CA-125值(对照，18.21U/mL，vs病例，28.15U/mL；P＝0.0002；图5A和5B)。然而，与CA-125水平相比(案例：中位数，19.48U/mL；范围，2.59-169.20U/mL，vs对照：18.21U/mL；范围，4.84-132.20U/mL；P＝0.2832)，子宫内膜癌患者的血浆总ALPPL2水平(中位数为1.4ng/mL；范围为0.54-11.12ng/mL)显著高于正常女性(中位数为1.1ng/mL；范围为0.35-2.99ng/mL)；P＝0.0101)。发明人还比较了单个病例和对照样品的ALPPL2值与CA-125值(图5C)。阈值为1.5ng/mL，在100个病例中有40例(40％)中ALPPL2呈阳性，而通过CA-125临界值仅检测到100个病例中有24例(24％)(35U/mL，图5D)。总体而言，在160名女性组中，有52个人(33％)的ALPPL2阈值较高，而只有33个人(12％)的CA-125值升高(图5E)。此外，为了确定ALPPL2的预后意义，发明人生成了ROC曲线以将癌症病例与对照区分开。当分析仅限于I级子宫内膜样子宫内膜癌患者时，ALPPL2相对于CA-125的优势得到增强(ALPPL2 AUC，0.71vsCA-125AUC，0.55；图5F)。与I级病例相比，CA-125对III/IV级患者的预后更好(CA-125AUC，0.73vs ALPPL2 AUC，0.55；图5G)。然而，对于所有患者，ALPPL2(0.40)的敏感性均高于CA-125(0.24，图5H)。因此，似乎ALPPL2滴度比CA-125更能独立地更好地识别早期子宫内膜癌患者。

实施例7–ALPPL2在卵巢癌中的表达

然后，本发明人研究了来自四名已被确诊为卵巢癌的患者的卵巢组织样品中的ALPPL2表达。如图6所示，相对于看家蛋白质GAPDH，ALPPL2蛋白在卵巢癌组织样本中明显可检测到，并且至少在患者2、3和4中可检出，但在没有卵巢癌的健康患者的对照样本中却没有检出。

序列表

<110> 澳大利亚纽卡斯尔大学

<120> 雌激素诱导的癌症的诊断和预后方法

<130> KHP202112941.2

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 532

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn

20 25 30

Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala

35 40 45

Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly

50 55 60

Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp

65 70 75 80

Lys Leu Gly Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val

85 90 95

Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly

100 105 110

Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr

115 120 125

Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg

130 135 140

Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala

165 170 175

Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp

180 185 190

Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp

245 250 255

Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu

260 265 270

Leu Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe

275 280 285

Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp

290 295 300

Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Arg

305 310 315 320

Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His

325 330 335

Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met

340 345 350

Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp

355 360 365

Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly

370 375 380

Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys

385 390 395 400

Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro

405 410 415

Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu

420 425 430

Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Gly

435 440 445

Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln

450 455 460

Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val

465 470 475 480

Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala

485 490 495

Pro Arg Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val

500 505 510

Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr

515 520 525

Ala Thr Ala Pro

530

<210> 2

<211> 513

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr

35 40 45

Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly

50 55 60

Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser

65 70 75 80

Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu

100 105 110

Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu

115 120 125

Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly

130 135 140

Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr

145 150 155 160

Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala

165 170 175

Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser

180 185 190

Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe

195 200 205

Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly

210 215 220

Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys

225 230 235 240

His Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Leu Gln Ala

245 250 255

Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly

260 265 270

Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu

275 280 285

Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg

290 295 300

Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His

305 310 315 320

Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp

325 330 335

Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser

340 345 350

Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro

355 360 365

Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp

370 375 380

Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val

385 390 395 400

Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser

405 410 415

Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Gly Glu Thr His

420 425 430

Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu

435 440 445

Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe

450 455 460

Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Arg Ala

465 470 475 480

Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val Pro Ala Leu

485 490 495

Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Thr Ala

500 505 510

Pro

<210> 3

<211> 1599

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

atgcaggggc cctgggtgct gctcctgctg ggcctgaggc tacagctctc cctgggcatc 60

atcccagttg aggaggagaa cccggacttc tggaaccgcc aggcagccga ggccctgggt 120

gccgccaaga agctgcagcc tgcacagaca gccgccaaga acctcatcat cttcctgggt 180

gacgggatgg gggtgtctac ggtgacagct gccaggatcc taaaagggca gaagaaggac 240

aaactggggc ctgagacctt cctggccatg gaccgcttcc cgtacgtggc tctgtccaag 300

acatacagtg tagacaagca tgtgccagac agtggagcca cagccacggc ctacctgtgc 360

ggggtcaagg gcaacttcca gaccattggc ttgagtgcag ccgcccgctt taaccagtgc 420

aacacgacac gcggcaacga ggtcatctcc gtgatgaatc gggccaagaa agcaggaaag 480

tcagtgggag tggtaaccac cacacgggtg cagcatgcct cgccagccgg cgcctacgcc 540

cacacggtga accgcaactg gtactcggat gccgacgtgc ctgcctcggc ccgccaggag 600

gggtgccagg acatcgccac gcagctcatc tccaacatgg acattgatgt gatcctaggt 660

ggaggccgaa agtacatgtt tcccatgggg accccagacc ctgagtaccc agatgactac 720

agccaaggtg ggaccaggct ggacgggaag aatctggtgc aggaatggct ggcgaagcac 780

cagggtgccc ggtacgtgtg gaaccgcact gagctcctgc aggcttccct ggacccgtct 840

gtgacccatc tcatgggtct ctttgagcct ggagacatga aatacgagat ccaccgagac 900

tccacactgg acccctccct gatggagatg acagaggctg ccctgctcct gctgagcagg 960

aacccccgcg gcttcttcct cttcgtggag ggtggtcgca tcgaccatgg tcatcatgaa 1020

agcagggctt accgggcact gactgagacg atcatgttcg acgacgccat tgagagggcg 1080

ggccagctca ccagcgagga ggacacgctg agcctcgtca ctgccgacca ctcccacgtc 1140

ttctccttcg gaggctaccc cctgcgaggg agctccatct tcgggctggc ccctggcaag 1200

gcccgggaca ggaaggccta cacggtcctc ctatacggaa acggtccagg ctatgtgctc 1260

aaggacggcg cccggccgga tgttacggag agcgagagcg ggagccccga gtatcggcag 1320

cagtcagcag tgcccctgga cggagagacc cacgcaggcg aggacgtggc ggtgttcgcg 1380

cgcggcccgc aggcgcacct ggttcacggc gtgcaggagc agaccttcat agcgcacgtc 1440

atggccttcg ccgcctgcct ggagccctac accgcctgcg acctggcgcc ccgcgccggc 1500

accaccgacg ccgcgcaccc ggggccgtcc gtggtccccg cgttgcttcc tctgctggca 1560

gggaccttgc tgctgctggg gacggccact gctccctga 1599

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

tgttaccgag agcgagagc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

gtgggtctct ccgtccag 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

acacatggct ctgtccaaga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

tcgtgttgca ctggttgaag 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

gccacatcgc tcagacacca t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

gaaggggtca ttgatggcaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

tggcaaagtg gagattgttg cc 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

aagatggtga tgggcttccc g 21

Claims

1.一种用于检测个体中雌激素诱导的癌症的方法，所述方法包括执行以下步骤：

其中相对于一个或多个参考样品中ALPPL2的表达水平，从个体获得的样品中ALPPL2的升高的表达水平指示个体中雌激素诱导的癌症的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中确定ALPPL2的表达水平包括定性或定量确定ALPPL2蛋白或ALPPL2 mRNA的表达。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括确定统计值并比较所述统计值，所述统计值源自从个体获得的样品和一个或多个参考样品中ALPPL2的表达水平。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述雌激素诱导的癌症为子宫内膜癌或卵巢癌。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述从个体获得的生物样品为血液样品。

6.一种用于鉴定有患上雌激素诱导的癌症风险的个体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中ALPPL2的表达水平；和

其中相对于一个或多个参考样品中ALPPL2的表达水平，从个体获得的样品中ALPPL2的升高的表达水平指示个体罹患雌激素诱导的癌症的风险增加。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述ALPPL2的升高的表达水平与雌激素水平正相关。

8.一种用于确定或预测患有雌激素诱导的癌症的个体的预后的方法，所述方法包括执行以下步骤：

(a)确定从个体获得的生物样品中ALPPL2的表达水平；

(b)将所确定的表达水平与一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中ALPPL2的表达水平进行比较；和

9.根据权利要求8所述的方法，其中预测预后包括预测个体生存。

10.用于检测和筛选雌激素诱导的癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种用于确定权利要求1-9中任一项所定义的ALPPL2的表达的试剂。

11.一种计算机系统或装置，其被配置为帮助检测或诊断雌激素诱导的癌症、个体患上所述癌症的风险或患有所述癌症的个体的预后，其中使用计算机软件来分析与权利要求1-9中任一项所定义的ALPPL2的表达有关的数据，并提供关于个体的诊断、风险评估或预后预测。

12.根据权利要求11所述的计算机系统或设备，其中，所述计算软件用于将所述数据与与一个或多个无癌参考样品中ALPPL2的表达相关的数据进行比较。

13.一种选择进行雌激素诱导的癌症的治疗的个体的方法，所述方法包括：

(a)执行确定在源自个体的生物样品中的如上实施方案中所定义的ALPPL2的表达水平的步骤，其中相对于一个或多个没有雌激素诱导的癌症的参考样品中ALPPL2的表达水平，源自个体的生物样品中ALPPL2的表达水平指示个体中雌激素诱导的癌症的存在；和

(b)选择在(a)中确定为患有雌激素诱导的癌症的个体，以进行所述癌症的治疗。

14.一种用于监测个体对雌激素诱导的癌症的治疗性治疗的反应的方法，所述方法包括：

(e)比较所述第一生物样品和所述第二生物样品中ALPPL2的表达水平，

15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括关于第三样品或后续样品的获得和执行步骤。

16.一种用于监测雌激素诱导的癌症的治疗性治疗的功效的方案，所述方案包括：

17.根据权利要求16所述的方案，其进一步包括关于第三样品或后续样品的获得和执行步骤。