CN112538548A - 一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法 - Google Patents
一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及动物卫生技术领域。本发明提供了一组能够特异性检测蜜蜂克什米尔病毒的实时荧光RT‑PCR的引物和探针，并利用所述的引物组合探针对实时荧光RT‑PCR的反应体系和反应程序进行优化得到的非诊断目的的检测方法。本发明的检测方法具有以下优点：(1)良好的特异性和敏感性性：对蜜蜂克什米尔病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；(2)灵敏度高：灵敏度能达到约8拷贝/μL；(3)操作简单、快速，整个反应可在60分钟内完成。本发明可用于非诊断为目的的蜜蜂克什米尔病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别，对于保障我国养蜂业和维护自然生态的健康发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及动物卫生技术领域，尤其涉及一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及其检测方法。
背景技术
克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus，KBV)最初于1977年从饲喂了患病东方蜜蜂Apis cerana病毒液的西方蜜蜂体内被分离鉴定出来，因为这些东方蜜蜂来源于克什米尔地区，所以研究者就用此地名给这种病毒命名。目前，除了印度和澳大利亚以外，KBV在世界各地的西方蜜蜂群中陆续被报道，但是，人们对于中国境内KBV的传播与流行情况认识有限。
KBV与其他蜜蜂病毒一样通过垂直传播和水平传播两种途径在蜂群内扩散。KBV首先发现于成蜂体内，病毒粒子在进入成蜂血淋巴后几天内就会导致宿主死亡，因此它被认为是毒力最强的蜜蜂病毒之一。KBV会与其他病毒如SBV共同感染蜜蜂，由于KBV具有较强的快速扩增能力，通常在被多种病毒感染的蜜蜂体内居于主导地位，例如近年间，欧美诸国的西方蜜蜂Apis mellifera蜂群在越冬期间损失的现象愈发严重，发生的频率和死亡蜜蜂的数量也都有所上升。造成这种现象的原因众说纷纭，其中病毒及病毒与蜂螨间的协同作用被认为是导致蜜蜂死亡和蜂群崩溃的主要诱因之一，而KBV也作为导致蜜蜂死亡的罪魁祸首。该病毒自发现以来就开始在世界范围内传播流行，给蜜蜂及其他昆虫造成巨大损失，已成为养蜂业的主要危害。
目前对蜜蜂病毒病的检测主要采用免疫学检测和核酸分子检测技术。免疫检测是目前一种常用的快速检测病毒的方法，但是蜜蜂很多病毒之间具有高度的基因同源性，应用免疫学技术会造成蜜蜂病毒检测特异性较差，很难对蜜蜂病毒病进行准确诊断。得益于分子生物学的发展，病毒的检测手段也发生了变革，其中普通PCR检测被认为是克服蜜蜂病毒检测障碍的有效手段。对比于传统的物理学和血清学检测，自从Stoltz等(1995)开发出第一对蜜蜂病毒的普通PCR引物以来，KBV的检测就变得方便经济很多。近年来，TaqMan探针法与SYBR Green荧光法进行KBV病毒定量PCR检测的手段也已开发利用，其灵敏度相比于传统的PCR方法高出约1000倍。但是IAPV病毒被确定以来，其与KBV的关系就一直纠缠不清。由于KBV和IAPV具有高度的相似性，核苷酸序列一致性高达97％，以致采用新的IAPV PCR引物和方法对法国境内的西方蜜蜂重新进行病毒筛查，结果只有一个蜜蜂样本呈现KBV阳性，这与之前的结果大相径庭，最终分析显示，之前的KBV属于IAPV，从而证实了用以检测KBV引物的特异性不强，不能准确区分KBV和IAPV。因此，急需一种特异性更强，敏感度更高的检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组合和探针及其检测方法来弥补现有技术的不足，来保障我国养蜂业和自然生态的健康发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组合和探针及其检测方法。解决了现有技术中检测蜜蜂克什米尔病毒特异性差，检测结果不准确等问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，包括上游引物KBV-F、下游引物KBV-R及TaqMan探针KBV-P；所述上游引物KBV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物KBV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探针KBV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述TaqMan探针KBV-P的5'端采用荧光基团HEX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。
作为优选，所述扩增得到的目的片段的大小为190bp，序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，采用实时荧光RT-PCR进行检测。
作为优选，所述实时荧光RT-PCR检测的反应体系包括如下组分和含量：10×RT-PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl22μL，2.5mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L上下游引物KBV-F/KBV-R各0.5μL，10μmol/L探针KBV-P 1.0μL，5U/μL DNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，样品RNA 2μL，然后加入水9.0μL，使反应总体积为20.0μL。
作为优选，所述实时荧光RT-PCR检测的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，61℃退火30s，共40个循环。
作为优选，所述61℃退火为单点荧光检测。
作为优选，所述检测结果的判定标准为：在实验有效的情况下，样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测，重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂克什米尔病毒；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂克什米尔病毒。
作为优选，所述实验有效的情况为：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验。
本发明提供了一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组合和探针及其检测方法，本发明的技术方案具有以下优点：
(1)良好的稳定性和特异性：本发明系通过大量的Blast比对分析，筛选了KBV高度特异、保守的基因片段为靶目标；通过对多组引物进行比较后选定的最佳引物，而且还设计并筛选了一条特异性荧光探针，在实时荧光RT-PCR反应过程中可以对靶目标进行双重控制，对蜜蜂克什米尔病毒的检测特异性更强，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，尤其是IAPV；相对于重组酶聚合酶等温核酸扩增技术(RPA)，实时荧光RT-PCR引物长度要求短，不易产生引物二聚体，扩增效果更好，具有较好的重复性；
(2)灵敏度高：本发明采用TaqMan-BHQ1探针，因为BHQ1本身不产生荧光，荧光背景低，所以灵敏性更高，再通过对反应体系和反应条件的多次优化，进一步提升其灵敏度，可达到约8拷贝/μL；
(3)操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在60分钟内完成。
附图说明
图1为实时荧光RT-PCR退火温度的优化结果图，(其中仅61℃退火温度的荧光强度为高)。
图2为目的片段电泳图。
图3为灵敏度检测图，(其中，当阳性克隆质粒为8.0拷贝/μL时仍然能够扩增得到相应的曲线)。
图4为标准曲线，(其中标准曲线显示扩增有效率E为108.8％，决定系数R2为0.998，标准曲线Y＝-3.128x+44.274)。
图5为Ct值的确定图，(其中除了阳性对照外，8.0拷贝/μL的4个重复均出现扩增曲线，平均扩增的Ct值为35.22，4.0拷贝/μL仅1个管出现扩增曲线，扩增得到的Ct值为38.19)。
图6为特异性检测结果图，(其中仅蜜蜂克什米尔病毒出现扩增曲线，其余病毒均未出现扩增曲线)。
图7为临床样本检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1实时荧光RT-PCR退火温度的优化
实时荧光RT-PCR反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度设置为55～65℃(梯度温度)，退火延伸30s，每个梯度温度设置3个重复，共40个循环；
实时荧光RT-PCR反应体系为：10×RT-PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl22μL，2.5mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L上下游引物KBV-F/KBV-R各0.5μL，10μmol/L探针KBV-P1.0μL，5U/μL DNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，蜜蜂克什米尔病毒RNA 2μL，然后加入水9.0μL，使反应总体积为20.0μL。
按以上方法对蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测的退火温度进行优化。结果如图1所述。
结果显示，当退火温度为61℃时，荧光强度最强，在保持扩增效率的基础上，选择较高的退火温度来提高特异性，所以选择最佳退火温度为61℃。
应用实施例1
按照实施例1的反应体系和优选的反应程序对蜜蜂克什米尔病毒进行PCR扩增，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增的目的片段的长度，通过福州尚亚生物技术有限公司对目的片段进行测序。扩增得到的目的片段电泳结果见图2，扩增得到的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
图2显示扩增得到的目的片段的长度为190bp。
应用实施例2
将含有蜜蜂克什米尔病毒的阳性克隆质粒用无菌水10倍递增稀释成8×108拷贝/μL～8×100拷贝/μL浓度的质粒DNA标准品。
以稀释后的质粒DNA标准品为模板，每个标准样品处理重复3次，并以健康蜜蜂组织总RNA为对照，以无菌水为空白对照。按实施例1所述实时荧光RT-PCR反应体系和优化后的实时荧光RT-PCR反应程序进行实时荧光RT-PCR扩增；获得如图3所示的扩增曲线来检验灵敏度和如图4所述的蜜蜂克什米尔病毒的标准曲线。
从图3可以看出，本方法最低可以检测到8拷贝/μL的蜜蜂克什米尔病毒，最高能够检测到。图4构建的标准曲线的回归方程为Y＝-3.128x+44.274；R代表相关系数，决定系数R2为0.998，扩增效率为108.8％。
应用实施例3
以8.0拷贝/μL标准质粒为起始浓度，进行连续2倍稀释，获得浓度为8.0拷贝/μL、4.0拷贝/μL、2.0拷贝/μL和1.0拷贝/μL共4个稀释度。以此4个稀释度为模板，按实施例1所述实时荧光RT-PCR反应体系和优化后的实时荧光RT-PCR反应程序进行实时荧光RT-PCR检测，检测结果如图5所示。
结果显示，当模板浓度为8.0拷贝/μL，4个重复管中均出现扩增，平均Ct值为35.22；当模板量为4.0拷贝/μL时，只有1个重复管出现扩增，Ct值为38.19，所以确定本方法的阳性判定Ct值为35。
应用实施例4
分别以蜜蜂克什米尔病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、急性麻痹病毒、残翅病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、以色列急性麻痹病毒等7种常见的蜜蜂病毒为样品，按常规方法提取RNA后以实施例1的方法进行RT-PCR反应和应用实施例3的结果判定的标准进行判定。检测结果如图6所示。
由图6可知，仅蜜蜂克什米尔病毒有产生典型的扩增曲线(Ct值为19.13)，其他样品均无扩增曲线。
应用实施例5
利用本方法对临床分离的7份临床样品进行检测，按照常规方法提取各个样品总RNA后根据实施例1的反应体系和反应程序进行检测。结果判定按应用实施例3的判定结果进行判定。检测结果如图7所示。
由图7可以看出，7份样品均为阳性，Ct值均在24～34之间，阳性对照为21.91，阴性对照无Ct值，与预期结果相一致。
由以上实施例可知，本发明提供了一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组合和探针及其检测方法。本发明的技术方案具有以下优点：
(1)良好的稳定性和特异性：本发明系通过大量的Blast比对分析，筛选了KBV高度特异、保守的基因片段为靶目标；通过对多组引物进行比较后选定的最佳引物，而且还设计并筛选了一条特异性荧光探针，在实时荧光RT-PCR反应过程中可以对靶目标进行双重控制，对蜜蜂克什米尔病毒的检测特异性更强，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，尤其是IAPV；相对于重组酶聚合酶等温核酸扩增技术(RPA)，实时荧光RT-PCR引物长度要求短，不易产生引物二聚体，扩增效果更好，具有较好的重复性；
(2)灵敏度高：本发明采用TaqMan-BHQ1探针，因为BHQ1本身不产生荧光，荧光背景低，所以灵敏性更高，再通过对反应体系和反应条件的多次优化，进一步提升其灵敏度，可达到约8拷贝/μL；
(3)操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在60分钟内完成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福州海关技术中心
<120> 一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
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Claims (9)
1.一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，其特征在于，包括上游引物KBV-F、下游引物KBV-R及TaqMan探针KBV-P；所述上游引物KBV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物KBV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探针KBV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，其特征在于，所述TaqMan探针KBV-P的5'端采用荧光基团HEX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。
3.一种如权利要求1或2所述的一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针扩增得到的目的片段，其特征在于，所述扩增得到的目的片段的大小为190bp，序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，采用实时荧光RT-PCR进行检测。
5.根据权利要求4所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR检测的反应体系包括如下组分和含量：10×RT-PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L上下游引物KBV-F/KBV-R各0.5μL，10μmol/L探针KBV-P 1.0μL，5U/μL DNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，样品RNA 2μL，然后加入水9.0μL，使反应总体积为20.0μL。
6.根据权利要求5所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR检测的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，61℃退火30s，共40个循环。
7.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述61℃退火为单点荧光检测。
8.根据权利要求7所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述检测结果的判定标准为：在实验有效的情况下，样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测，重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂克什米尔病毒；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂克什米尔病毒。
9.根据权利要求4～8任意一项所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实验有效的情况为：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验。
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