CN112522379A - 一种功能核酸磁生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种功能核酸磁生物传感器，包括：（1）BS‑PCR扩增体系，（2）功能核酸磁层析分析体系。本发明通过巧妙地设计引物，使得在双链靶标存在下可对靶标进行超快扩增，并使扩增产物两端各带一个单链寡核苷酸。进一步利用构建的侧流磁层析试纸进行磁信号输出和分析，突破了目前功能核酸检测试纸信噪比高，信号分子不稳定的瓶颈，解决了传统PCR反应速度慢，产物难于可视化的难题，实现了对双链靶标的快速、高灵敏、可视化检测。不仅如此，本发明提供的磁传感器具有出色的长期重复磁信号读取的稳定性。

Description

一种功能核酸磁生物传感器

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种双链核酸靶标序列的功能核酸磁生物传感器。

背景技术

PCR技术发展于1983年，是一种典型的核酸变温扩增技术。微量的核酸片段在体外可增加数百万倍。由于PCR具有较高的灵敏度和特异性，且操作过程简单，已被应用于食品安全检测和监督等各个领域。然而，PCR不适合快速现场筛查；并且扩增产物为双链，不易进行可视化分析。尽管已经做出了许多努力来减少PCR扩增所需的时间，但对于快速现场筛查，仍然需要提高速度，并且更简单，以及长期稳定的信号读取。

侧流生物传感器具有检测精度高、方便快捷等优点。这是一种为实现快速筛查而开发的可视化分析方法。与基于抗体的免疫层析试纸相比，基于功能核酸的侧流生物传感器靶标范围更广、稳定性更高、成本更低。然而，有几个因素限制了功能核酸试纸技术的发展。首先，基于传统的信号放大方法很难同时实现对双链DNA扩增子的可视化和高灵敏度检测；其次，由于信号分子、生物样本和环境的固有特性，消除背景干扰受到限制；第三是信号分子的稳定性。因此，需要开发一种新型的功能核酸试纸条平台，既实现了双链DNA扩增子的可视化，又消除了背景干扰，提高了信号读取稳定性。

纳米规模的磁性材料有其自身的优势。首先，磁信号读取能抗背景干扰，实际的生物样本没有磁性背景，因此无需进一步处理样品就可以实现高灵敏度的测量；其次，磁性纳米颗粒可以根据其聚集诱导的棕色提供定性的可视化输出，同时允许通过其超顺磁信号响应进行精确的磁信号强度分析；第三，磁信号具有较高的稳定性和较长的衰减周期，有助于建立稳定的筛选平台。目前关于以磁性纳米颗粒作为探针并输出磁信号的功能核酸侧流生物传感器鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种功能核酸磁生物传感器。

本发明的另一目的是提供一种基于隔断超速PCR和功能核酸磁层析试纸的快速、灵敏检测双链核酸靶标的方法。

为了实现本发明目的，发明人根据双链核酸靶标，设计了通用隔断接头引物对进行隔断超速聚合酶链式反应（blocking super Polymerase Chain Reaction, BS-PCR），反应产物用新构建的功能核酸磁层析试纸进行分析，构建了一种新型的基于BS-PCR和功能核酸磁层析试纸的功能核酸磁生物传感器。

第一方面，本发明提供一种功能核酸磁生物传感器，包括：（1）BS-PCR扩增体系，（2）功能核酸磁层析分析体系。

所述传感器检测体系用于对待测样品依次经由所述BS-PCR扩增体系进行反应后所得产物进行功能核酸磁层析分析；

其中，所述BS-PCR扩增体系包括：正向隔断接头引物、反向隔断接头引物；

所述功能核酸磁层析分析体系包括：层析缓冲液、磁信号探针、功能核酸检测试纸和功能核酸磁层析检测仪。

其中， 所述正向隔断接头引物包括：通用接头序列A、隔断物和特异性引物序列B；

所述反向隔断接头引物包括：通用接头序列A’、隔断物和特异性引物序列B’；

所述隔断物位于所述通用接头序列和特异性引物序列之间；

所述特异性引物序列B、B’的核苷酸序列位于正向隔断接头引物和反向隔断接头引物的3’端；

所述隔断物包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构。

所述特异性引物序列B、B’的核苷酸序列具体包括根据待测双链靶标片段的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。

具体的，所述传感器还包括下述1）-2）中的至少一种：

1）所述BS-PCR反应的反应体系中正向引物和反向引物的浓度为普通PCR浓度的10倍以上；具体的，为25倍；

2）所述的BS-PCR反应的过程包括：95-98℃，0-10s；55-65℃，0-10s，共25-40个循环；还具体的，所述BS-PCR反应的过程包括：96℃，4s；60℃，6s，共30个循环。

具体的，所述传感器还包括下述1）-6）中的至少一种：

1）所述隔断物包括具有长链结构的化合物；

2）所述正向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物；

3）所述反向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物；

4）通用接头序列A、A’位于所述引物序列的5’端；

5）所述正向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物；

6）所述反向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物。

再具体的，所述隔断物为聚六乙二醇。

其中，所述磁信号探针为表面修饰了单链核酸序列C的磁性纳米颗粒。

所述功能核酸检测试纸的检测线处修饰了单链核酸序列D，质控线处修饰了单链核酸序列D’。

所述单链核酸序列D与通用接头序列A部分或全部互补配对；

单链核酸序列D’与通用接头序列A’部分或全部相同；

单链核酸序列D’与通用接头序列A’分别与修饰在磁性纳米颗粒表面的单链核酸序列C部分或全部互补配对。

所述A、A’、B、B’、C、D、D’只用于区别不同的序列，不用于排序。

所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。

所述检测试纸包括现有技术或公知常识所制备的试纸；所述制备包括现有技术或公知常识所记载的制备方法。

具体的，所述功能核酸磁层析分析过程包括：将2-3μL BS-PCR反应所得产物与80-120μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将1-3μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待3-10分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度。还具体的，所述功能核酸磁层析分析过程包括：将2.5μL BS-PCR反应所得产物与100μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将2μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待5分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度。

具体的，所述传感器还包括下述1）-4）中的至少一种：

1）所述磁信号探针包括：将序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列通过相互作用修饰在磁性纳米颗粒表面后得到的探针；

2）所述功能核酸检测试纸包括：将序列表中SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列通过相互作用修饰在检测线处，将序列表中SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列通过相互作用修饰在质控线处所得到的检测试纸；

3）所述磁信号探针包括：将序列表中SEQ ID NO：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：7所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过相互作用修饰在磁性纳米颗粒表面后得到的探针；

4）所述功能核酸检测试纸包括：将序列表中SEQ ID NO：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：8所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列修饰在检测线处，以及将序列表中SEQ ID NO：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过相互作用修饰在质控线处所得到的检测试纸。

本发明还提供前述传感器在检测双链核酸靶标方面的应用，所述检测可表现为定性检测。

第二方面，本发明提供了一种利用前述传感器对双链核酸靶标进行定性检测的方法，包括如下步骤：

S1、向所述BS-PCR扩增体系中加入待测样品，进行隔断超速聚合酶链式反应，得到BS-PCR扩增产物；

S2、利用所述功能核酸磁层析分析体系对所述BS-PCR扩增产物进行磁层析分析。

S1具体如下：将待测样品加入BS-PCR扩增体系，体系中正向隔断接头引物浓度为1-5μM、反向隔断接头引物浓度为1-5μM，根据程序：95-98℃、0-10s，55-65℃、0-10s，进行25-40个循环扩增，得到BS-PCR扩增产物。

还具体的：将待测样品加入BS-PCR扩增体系，体系中正向隔断接头引物浓度为2μM、反向隔断接头引物浓度为2μM，根据程序：96℃、4s，60℃、6s，进行30个循环扩增，得到BS-PCR扩增产物。

S2具体如下：将2-3μL BS-PCR反应所得产物与80-120μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将1-3μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待3-10分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度。

还具体的，将2.5μL BS-PCR反应所得产物与100μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将2μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待5分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度。

本发明提供一种基于隔断超速PCR和功能核酸磁层析试纸的快速、灵敏检测双链核酸靶标的方法，包括如下步骤：

首先设计正向隔断接头引物和反向隔断接头引物，对含有双链核酸靶标的样品进行BS-PCR扩增，扩增出的产物两端各带有一段通用接头序列A和A’；将与反向隔断接头引物中的通用接头序列A’部分或全部互补的单链核酸序列C修饰在磁性纳米颗粒表面制备磁信号探针，将与正向隔断接头引物中的通用接头序列A部分或全部互补的单链核酸序列D修饰在试纸硝酸纤维素膜的检测线上，与反向隔断接头引物中的通用接头序列A’部分或全部相同的单链核酸序列D’修饰在质控线上制备功能核酸检测试纸，将1-3μL的磁信号探针加载到检测试纸的结合垫上；将2-3μL BS-PCR反应所得产物与80-120μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将加载了磁信号探针的检测试纸插入待检样品中，待3-10分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，进而完成对双链靶标的快速可视化检测。或者取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度进行分析。

所述正向隔断接头引物的5’端具有与功能核酸检测试纸检测线上单链核酸序列D部分或全部互补的通用接头序列A，3’端含有可与靶标结合的特异性引物序列B；所述反向隔断接头引物的5’端具有与磁信号探针表面单链核酸序列C部分或全部互补的通用接头序列A’，3’端含有可与靶标结合的特异性引物序列B’；所述5’端通用接头序列与3’端特异性引物序列之间至少设有一个隔断物，所述隔断物可抑制聚合酶结合和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸。

优选地，所述隔断物为聚六乙二醇。

所述功能核酸检测试纸检测线处单链核酸序列D部分或全部互补通用接头序列A，质控线处单链核酸序列D’部分或全部互补磁信号探针表面单链核酸序列C’。

优选的，前述的方法，双链靶标检测中所用的正向隔断接头引物、反向隔断接头引物、磁信号探针表面的单链核酸、功能核酸检测试纸的检测线和质控线处的单链核酸的碱基序列如下：

正向隔断接头引物：5’-TTGGTCGTGGTGGTGGTTT-聚六乙二醇-ACAGCCACCACTTCTCCTTG-3’

反向隔断接头引物：5’-CCTTCCCTCTTCCCCCC-聚六乙二醇-CGGAAATGAAAGAAGGCTACCG-3’

磁信号探针表面的单链核酸：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTTTTT-3’

检测线处单链核酸：5’-AAACCACCACCACGACCAATTTTT-3’

质控线处单链核酸：5’-CCTTCCCTCTTCCCCCCTTTTT-3’

其中，TTTTT表示间隔序列。

本发明还提供与上述方法配套的检测试剂盒，所述试剂盒至少包括以下成分：正向隔断接头引物、反向隔断接头引物、层析缓冲液、磁信号探针、功能核酸检测试纸等。

本发明试剂盒的检测分析原理：首先设计正向隔断接头引物和反向隔断接头引物，对含有双链核酸靶标的样品进行BS-PCR扩增，由于引物中隔断物作用阻碍了聚合酶的延伸，使得扩增出的产物两端各带有一段单链核酸序列；将磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上；将BS-PCR反应所得产物与层析缓冲液混合形成待检样品，将加载了磁信号探针的检测试纸插入待检样品中，观察试纸的检测线由无色变为棕色，进而完成对双链靶标的快速可视化检测。或者取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度进行分析。

具体检测方法如下：

1）BS-PCR反应：配制由正向隔断接头引物、反向隔断接头引物、双链靶标、DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液和ddH₂O组成的PCR反应体系，进行BS-PCR扩增反应；

2）功能核酸磁层析分析反应：将2-3μL BS-PCR反应所得产物与80-120μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将1-3μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待3-10分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度。

其中，步骤2）所述层析缓冲液的配方为：4×SSC、2% BSA、0.05% Tween-20、10 mMTris-HCl和0.002% TrtionX-100，pH 7.4。

优选地，步骤1）中BS-PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：95-98℃，0-10s；55-65℃，0-10s，共25-40个循环。

通过肉眼观察试纸检测线处棕色的有无，可实现对双链靶标的可视化检测；将试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定检测线处的磁信号强度进行精确的分析。

本方法的双链靶标的检测灵敏度是单拷贝。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过建立一种功能核酸磁生物传感器，用于双链靶标的快速灵敏检测。设计隔断接头引物对双链靶标进行隔断超速聚合酶链式反应，反应产物用新构建的功能核酸磁层析试纸进行分析，构建了一种新型的基于BS-PCR和功能核酸磁层析试纸的功能核酸磁生物传感器，并提供了一种快速、灵敏、可视化的双链靶标检测新方法。使样品的检测时间大大缩短，检测灵敏度低至单拷贝。而且本发明成功突破了目前功能核酸检测试纸信噪比高，信号分子不稳定的瓶颈，解决了传统PCR反应速度慢，产物难于可视化的难题，利用功能核酸检测试纸实现了对双链DNA扩增子的可视化和高灵敏度检测，对现场实时快速检测具有重要的现实意义。

（一）本方法构建了隔断接头引物对，对双链靶标进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到5分钟，显著减少了PCR反应的用时。

（二）引物中隔断物的使用阻碍了聚合酶的延伸，实现了PCR产物单双链的转换，获得两端带有单链核酸序列的PCR产物。

（三）首次构建了功能核酸磁层析检测试纸，以磁信号作为信号输出，利用磁性纳米颗粒聚集诱导产生的颜色变化用于可视化定性分析，利用磁性纳米颗粒对磁场的超顺磁信号响应，通过测定磁场强度进行精确分析；解决了目前功能核酸检测试纸背景信号干扰以及信号分子不稳定的问题。

（四）利用构建的功能核酸磁层析试纸来分析BS-PCR扩增产物，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对双链DNA扩增子的快速、可视化和高灵敏检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中隔断超速PCR反应产物并用功能核酸磁层析检测试纸分析的结果；图1（a）中，泳道1：无靶标-正反向隔断接头引物对；泳道2：双链靶标-普通引物对；泳道3：双链靶标-正向隔断接头引物-普通反向引物；泳道4：双链靶标-普通正向引物-反向隔断接头引物；泳道5：双链靶标-正反向隔断接头引物对；图1（b）中1-5对应(a)中的1至5。

图2为本发明实施例1中功能核酸检测试纸检测线处的颜色深浅随双链靶标数量的变化；其中，1至6靶标数量分别为：2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹、2×10⁰和1×10⁰拷贝，7为空白对照。

图3为本发明实施例1中实验组与空白对照在检测试纸检测线处磁信号强度的差值随靶标数量对数的变化。

图4为本发明实施例2中生物传感器特异性检测结果。

图5为本发明实施例3中生物传感器磁信号输出稳定性验证结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中，溶解磁信号探针用缓冲液配方为：20nM Na₃PO₄·12H₂O、5% BSA、 0.25%Tween-20、10%蔗糖；

磁层析用缓冲液的配方为：4×SSC、2% BSA、0.05% Tween-20、10 mM Tris-HCl和0.002% TrtionX-100，pH 7.4。

实施例1 一种功能核酸磁生物传感器的建立

1、实验材料

10×PCR buffer、EB核酸染料、核酸分子量标准2000 DNA marker、dNTP、rTaq DNA聚合酶、20×SSC、牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、Triton X-100、MES、EDC、NHS、蔗糖等均购自美国Sigma公司。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。

序列设计如下（SEQ ID NO:1-2、7-9）：

注：TTTTT表示间隔序列，是为了不影响修饰的单链核酸的功能；

磁信号探针表面的单链核酸与反向隔断接头引物的5’端以及质控线处单链核酸互补配对；

正向隔断接头引物的5’端与检测线处单链核酸互补配对。

2、磁信号探针的构建和验证

用浓度为25 mM的MES缓冲液（pH=6）配置浓度为50 mg/mL的EDC和NHS溶液；取羧基修饰的磁性纳米四氧化三铁，用MES缓冲液多次洗涤后重悬；向重悬液中分别加入相同量的EDC和NHS，37℃活化约1 h；再用MES缓冲液多次洗涤后重悬；加入一定量的氨基修饰的单链核酸，室温旋转孵育约1 h。用MES缓冲液进行多次洗涤，除去剩余未偶联的核酸，用溶解缓冲液对偶联好的磁性纳米颗粒进行重新悬浮，磁信号探针制备完成，4℃保存备用。

采用Zetasizer Nano ZS分析仪对制备的磁信号探针进行Zeta电位和动态光散射的表征。磁性纳米颗粒表面修饰单链核酸后Zeta电位的降低和粒径的增大证明磁信号探针的成功制备。

3、功能核酸磁生物传感器的建立与验证

双链靶标隔断超速PCR体系如下：

在冰上配制20μL反应体系，迅速置于超速PCR反应装置中进行温度控制。超速PCR反应程序：96℃ 4s，60℃ 6s，30个循环，总计5min。

完成超速PCR反应过程，使用2%琼脂糖凝胶电泳验证超速PCR反应体系的扩增效果，反应条件：120 V 0.5h，拍照系统：Molecular Imager Gel Doc XR (Bio-Rad)。

将2.5μL PCR反应所得产物与100μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将2μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待5分钟后肉眼观察试纸的检测线由无色变为棕色。

实验结果表明，隔断接头引物设计的成功，可以进行超速PCR扩增，并且可以对扩增产物进行功能核酸磁层析可视化分析（图1）。

4、双链靶标超灵敏、可视化的快速检测

根据上述优化体系，分别加入不同数量的2×10⁴ copies、2×10³ copies、2×10²copies、2×10¹ copies、2×10⁰ copies和1×10⁰ copy的基因组样品进行隔断超速PCR扩增，扩增产物利用功能核酸检测试纸进行磁层析分析，试纸检测线处出现肉眼可见的深浅不一的棕色（图2）。

将检测试纸放入功能核酸磁层析检测仪中对检测线处的磁信号强度进行测定，绘制实验组与空白对照的磁信号强度的差值随基因组数量对数的变化曲线（图3）。

当基因组数量低至单拷贝时，试纸检测线处也出现了肉眼可见的棕色条带，磁信号强度较高，与空白对照差异显著，因此对MON810的检测灵敏度低至单拷贝。

实施例2 传感器的特异性考察

按照实施例1构建的生物传感器，分别将2×10² copies的转基因玉米MON810基因组，2×10⁴ copies的转基因玉米MIR604和GA21、转基因大豆MON87705和MON87769、转基因油菜RF3的基因组加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的磁生物传感器具有较好的特异性（图4）。

实施例3 磁信号稳定性验证

2倍梯度稀释磁信号探针进行功能核酸磁层析分析，将所得的检测试纸在室温下保存一个月后再次利用功能核酸磁层析检测仪测定检测线处的磁信号强度，与一个月之前的测定结果进行比较（图5）。

试纸储存一个月，测得的磁信号强度与一个月之前相比并没有发生明显的改变，磁信号作为信号输出有杰出的稳定性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种功能核酸磁生物传感器

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttggtcgtgg tggtggttta cagccaccac ttctccttg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccttccctct tcccccccgg aaatgaaaga aggctaccg 39

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttggtcgtgg tggtggttt 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acagccacca cttctccttg 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccttccctct tcccccc 17

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cggaaatgaa agaaggctac cg 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggggggaaga gggaaggttt tt 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

aaaccaccac cacgaccaat tttt 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccttccctct tccccccttt tt 22

Claims (10)

1.一种功能核酸磁生物传感器，其特征在于，包括：（1）隔断超速聚合酶链式反应BS-PCR扩增体系，（2）功能核酸磁层析分析体系；

所述传感器用于对待测样品依次经由所述BS-PCR扩增体系进行反应后所得产物进行功能核酸磁层析分析；

其中，所述BS-PCR扩增体系包括：正向隔断接头引物、反向隔断接头引物；

所述功能核酸磁层析分析体系包括：层析缓冲液、磁信号探针、功能核酸检测试纸和功能核酸磁层析检测仪。

2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，

所述正向隔断接头引物包括：通用接头序列A、隔断物和特异性引物序列B；

所述反向隔断接头引物包括：通用接头序列A’、隔断物和特异性引物序列B’；

所述隔断物位于所述通用接头序列和特异性引物序列之间；

所述特异性引物序列B、B’的核苷酸序列位于正向隔断接头引物和反向隔断接头引物的3’端；

所述隔断物包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构。

3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述BS-PCR扩增体系中，正向隔断接头引物浓度为1-5μM、反向隔断接头引物浓度为1-5μM。

4.根据权利要求3所述的传感器，其特征在于，所述BS-PCR的反应过程包括：95-98℃，0-10s；55-65℃，0-10s，共25-40个循环。

5.根据权利要求4所述的传感器，其特征在于，所述BS-PCR扩增体系中，正向隔断接头引物浓度为2μM、反向隔断接头引物浓度为2μM；所述BS-PCR反应过程包括：96℃，4s；60℃，6s，共30个循环。

6.根据权利要求5所述的传感器，其特征在于，还包括下述1）-6）中的至少一种：

1）所述隔断物包括具有长链结构的化合物；

2）所述正向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物；

3）所述反向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物；

4）通用接头序列A、A’位于所述引物序列的5’端；

5）所述正向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物；

6）所述反向隔断接头引物包括：将序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过隔断物连接后得到的引物。

7.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述磁信号探针为表面修饰了单链核酸序列C的磁性纳米颗粒；

所述功能核酸检测试纸的检测线处修饰了单链核酸序列D，质控线处修饰了单链核酸序列D’；

单链核酸序列D与通用接头序列A部分或全部互补配对；

单链核酸序列D’与通用接头序列A’部分或全部相同；

单链核酸序列D’与通用接头序列A’分别与修饰在磁性纳米颗粒表面的单链核酸序列C部分或全部互补配对。

8.根据权利要求1或7所述的传感器，其特征在于，所述功能核酸磁层析分析过程包括：将2-3μL BS-PCR反应所得产物与80-120μL的层析缓冲液混合形成待检样品，将1-3μL的磁信号探针加载到功能核酸检测试纸的结合垫上，将检测试纸插入待检样品中，待3-10分钟后试纸的检测线由无色变为棕色，肉眼进行观察，取出试纸放入功能核酸磁层析检测仪中测定磁信号强度。

9.根据权利要求8所述的传感器，还包括下述1）-4）中的至少一种：

1）所述磁信号探针包括：将序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列通过相互作用修饰在磁性纳米颗粒表面后得到的探针；

2）所述功能核酸检测试纸包括：将序列表中SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列通过相互作用修饰在检测线处，将序列表中SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列通过相互作用修饰在质控线处所得到的检测试纸；

3）所述磁信号探针包括：将序列表中SEQ ID NO：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：7所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过相互作用修饰在磁性纳米颗粒表面后得到的探针；

4）所述功能核酸检测试纸包括：将序列表中SEQ ID NO：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：8所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列修饰在检测线处，以及将序列表中SEQ ID NO：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过相互作用修饰在质控线处所得到的检测试纸。

10.权利要求1-9任一项所述传感器在检测双链核酸靶标方面中的应用。

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