CN112516018B - 一种具有美白、抗衰、保湿、排毒功效的富硒绿豆发酵液及其面膜组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化妆品领域，具体公开了一种富硒绿豆发酵液及其制备方法。该发酵液由两种不同的富硒绿豆发酵液混合而成：一种是以富硒绿豆粉和淀粉为原料，以嗜热链球菌和丙酸杆菌为菌种发酵制得，另一种是以富硒绿豆粉、L‑谷氨酸和柠檬酸为原料，以枯草芽孢杆菌为菌种发酵制得。本发明的发酵液具有美白、抗衰、保湿、排毒等功效。

Description

一种具有美白、抗衰、保湿、排毒功效的富硒绿豆发酵液及其 面膜组合物

技术领域

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种具有美白、抗衰、保湿、排毒功效的富硒绿豆发酵液。

背景技术

生物发酵技术运用微生物体内的多重酶将植物的大分子物质分解为小分子，并能分解细胞壁，从而获取植物细胞内的多种营养元素。生物发酵技术具有以下优点：(1)破除植物中的屏障物质如纤维素等，可使活性物质更易溶出；(2)可以降解转化毒性物质如生物碱、内酯物质、苷类化合物、毒蛋白、蒽醌、鞣质、重金属等；(3)使功效成分小分子化，可被快速吸收，消耗一般性物质，提高功效成分的相对含量；(4)特异性转化特定成分并产生新的功效物质；(5)发酵用益生菌具有补充、增强原有药效的功能。

绿豆也称青小豆，为豆科植物绿豆的种子。绿豆中含有51.9％-53.7％的淀粉、19.5％-33.1％的蛋白质，具有清热解毒、清洁皮肤、抗氧化等多种功能。绿豆经过发酵以后，其有益肌肤的大分子物质如蛋白质会变成更容易被皮肤吸收的小分子多肽，更容易到达皮肤基底层，从而达到由内而外的滋养。

目前市面上将普通绿豆作为化妆品功效物质的产品比比皆是，但尚未有对富硒绿豆的研究开发。另外，在发酵类化妆品方面，菌种选择的多样性，导致产品质量差异巨大。例如，CN102112106A中公开了一种包含经发酵和酶处理的绿豆种子提取物，用于制备皮肤抗老化的化妆品组合物，其发酵原料为普通绿豆，发酵菌种为酿酒酵母和乳杆菌。

发明内容

本发明提供了一种具有美白、抗衰、保湿、排毒功效的富硒绿豆发酵液，含有以富硒绿豆和淀粉为原料，用嗜热链球菌和丙酸杆菌发酵的发酵液，和以富硒绿豆、L-谷氨酸和柠檬酸为原料，用枯草芽孢杆菌发酵的发酵液，该富硒绿豆发酵液相对于未经发酵的富硒绿豆或者普通绿豆或者这些绿豆的其他发酵液而言，极大地提高了生物活性。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种富硒绿豆发酵液，通过嗜热链球菌和丙酸杆菌在含有富硒绿豆粉和淀粉的培养基中发酵制得。

根据本发明，将嗜热链球菌种子液和丙酸杆菌种子液接种于含有富硒绿豆粉和淀粉的培养基中，在35-38℃发酵6-48小时后制得。优选地，发酵时间为12-24小时。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计3-20％，优选7-15％的富硒绿豆粉。优选地，富硒绿豆粉的粒径为1-50μm，最优选15-20μm。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计0.5-10％，优选1-2％的淀粉。优选地，淀粉为可溶性淀粉。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计70-96％，优选83-92％的水。

在一个优选的实施方式中，培养基由富硒绿豆粉、淀粉(优选可溶性淀粉)和水组成。

本领域技术人员可以理解，本领域已知的嗜热链球菌种子液均可用于本发明。根据本发明，嗜热链球菌种子液的接种量为培养基重量的1-6％，优选为3-5％。嗜热链球菌种子液中嗜热链球菌的浓度为1×10⁶-1×10⁸CFU/ml，进一步优选1×10⁷-5×10⁷CFU/ml，更优选2×10⁷CFU/ml。

本领域技术人员可以理解，本领域已知的丙酸杆菌种子液均可用于本发明。根据本发明，丙酸杆菌种子液的接种量为培养基重量的5-10％，优选为6-8％。丙酸杆菌种子液中丙酸杆菌的浓度为1×10⁶-1×10⁸CFU/ml，进一步优选1×10⁷-5×10⁷CFU/ml，更优选2×10⁷CFU/ml。

在一个优选的实施方式中，上述发酵产生的发酵液中曲酸含量大于3％，优选3-5％。

本发明进一步提供了上述富硒绿豆发酵液的制备方法，包括用嗜热链球菌和丙酸杆菌在含有富硒绿豆粉和淀粉的培养基中发酵。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种富硒绿豆发酵液，通过枯草芽孢杆菌在含有富硒绿豆粉、L-谷氨酸和柠檬酸的培养基中发酵制得。

根据本发明，将枯草芽孢杆菌接种于含有富硒绿豆粉、L-谷氨酸和柠檬酸的培养基中，在35-40℃发酵24-72小时后制得。优选地，发酵时间为36-60小时。优选地，通气量为1.5-2.5vvm(vvm为通气比，即每分钟通气量与发酵罐中实际料液体积的比值)，最优选2vvm；pH为6.5-7.2，最优选6.8。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计3-20％，优选7-15％的富硒绿豆粉。优选地，富硒绿豆粉的粒径为1-50μm，最优选15-20μm。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计0.5-10％，优选1-3％的L-谷氨酸。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计0.1-5％，优选0.5-1％的柠檬酸。

根据本发明，培养基中含有以重量百分比计65-96％，优选81-91％的水。

在一个优选的实施方式中，培养基由富硒绿豆粉、L-谷氨酸、柠檬酸和水组成。

本领域技术人员可以理解，本领域已知的枯草芽孢杆菌种子液均可用于本发明。根据本发明，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为培养基重量的1-6％，优选为2-4％。枯草芽孢杆菌种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为1×10⁶-1×10⁸CFU/ml，进一步优选1×10⁷-5×10⁷CFU/ml，更优选2×10⁷CFU/ml。

在一个优选的实施方式中，上述发酵产生的发酵液中γ-聚谷氨酸含量大于2％，优选2-5％。

本发明进一步提供了上述富硒绿豆发酵液的制备方法，包括用枯草芽孢杆菌在含有富硒绿豆粉、L-谷氨酸和柠檬酸的培养基中发酵。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种富硒绿豆发酵液，该富硒绿豆发酵液含有前述本发明第一方面的富硒绿豆发酵液(即嗜热链球菌和丙酸杆菌富硒绿豆发酵液)和前述本发明第二方面的富硒绿豆发酵液(即枯草芽孢杆菌富硒绿豆发酵液)。优选地，嗜热链球菌和丙酸杆菌富硒绿豆发酵液与枯草芽孢杆菌富硒绿豆发酵液的重量比为(2-5):(5-8)，最优选(3-4):(6-7)。在一个优选的实施方式中，该富硒绿豆发酵液由嗜热链球菌和丙酸杆菌富硒绿豆发酵液和枯草芽孢杆菌富硒绿豆发酵液组成。

本发明进一步提供了上述富硒绿豆芽发酵液的制备方法，包括将嗜热链球菌和丙酸杆菌富硒绿豆发酵液和枯草芽孢杆菌富硒绿豆发酵液混合。

本领域技术人员可以理解，可以使用本领域已知的方法对富硒绿豆进行粉碎制备富硒绿豆粉。例如：将富硒绿豆去杂、清洗、烘干后，用粉碎机进行初步粉碎得富硒绿豆粗粉，再将富硒绿豆粗粉进行气流粉碎和射流纳米粉碎机粉碎，使其粒径为1-50μm，优选15-20μm。

根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种化妆品组合物，含有前述任一种富硒绿豆发酵液。优选地，在所述化妆品组合物中，富硒绿豆发酵液的重量百分含量为0.1-10％，进一步优选0.5％-3.0％。

本发明的富硒绿豆发酵液具有美白、抗衰、保湿、排毒功效，因此可以用于各种化妆品组合物中，包括但不限于爽肤水、乳液、面膜、精华液、面霜、眼霜、洗面奶、浴液等。

在一个优选的实施方式中，上述化妆品组合物为面膜组合物。

在一个优选的实施方式中，上述化妆品组合物为泥浆面膜组合物。优选地，泥浆面膜组合物中进一步含有高岭土。

根据本发明，泥浆面膜组合物中进一步含有其他活性组分，包括但不限于：保湿剂、润肤剂和/或美白剂等。本领域技术人员可以理解，本领域常用的各种保湿剂、润肤剂、美白剂均可用在本发明的泥浆面膜组合物中，其含量可以是本领域通常使用的含量。例如，保湿剂为甘油、对羟基苯乙酮、D-泛醇等，润肤剂为大花可可树籽脂、棕榈酸乙基己酯、山茶油等，美白剂为烟酰胺、3-o-乙基抗坏血酸等。

根据本发明，泥浆面膜组合物中进一步含有其他活性成分提取物，包括但不限于铁皮石斛提取物、银杏叶提取物、野菊花提取物等。本领域技术人员可以理解，这些提取物的含量可以是本领域已知的常用量。

根据本发明，泥浆面膜组合物中进一步含有添加剂，包括但不限于：增稠剂例如黄原胶等，乳化剂例如GP200、A165、鲸蜡硬脂醇等，抗氧化剂例如PE9010等，防腐剂例如羟苯甲酯、羟苯丙酯、丙二醇等，着色剂例如氧化铁黄、氧化铁黑、氧化铬绿等，芳香剂例如绿豆香精等，溶剂水等。本领域技术人员可以理解，这些添加剂的含量可以是本领域已知的常用量。

在一个优选的实施方案中，本发明的泥浆面膜组合物中含有以重量百分比计如下组分：

本领域技术人员可以理解，本发明泥浆面膜组合物可以通过本领域常规方法制备得到。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的富硒绿豆发酵液，可以进一步提高和扩展富硒绿豆在化妆品方面的应用，其具有的美白、抗衰、保湿、排毒功效皆优于以普通绿豆为功效成分的化妆品。

富硒绿豆发酵液的功能主要体现在以下几个方面：(1)富硒绿豆纳米粉具有消肿治痘压热解毒之功效，其能消除皮肤上的而一些炎症，治疗水痘、湿疹等，并能促进伤口的愈合；(2)富硒绿豆纳米粉中含有的牡蛎碱、异牡蛎碱等成分，具有卓越的洁净作用能有效祛除皮肤中的不净物，更可彻底祛除皮肤深层废物，使皮肤焕发光彩；(3)富硒绿豆纳米粉中含有的山奈酚、异槲皮苷和富硒绿豆酵素中含有特有的曲酸物质，都是酪氨酸酶抑制剂，可以有效的防止皮肤衰老，祛除色斑、增白皮肤，在对老年斑、祛斑及色素沉着等具有良好的治疗作用；(4)富硒绿豆纳米粉中含有的天然植物硒具有抗衰、解毒排毒、保护皮肤的作用。(5)富硒绿豆酵素中含有特有的γ-聚谷氨酸，其不仅保湿性极强，还可以进入皮肤深层之后还具有恢复皮肤自我湿润系统的功能；(6)嗜热链球菌发酵过程中产生的透明质酸在保持皮肤弹性方面发挥着重要作用；(7)富硒绿豆酵素中含有的其它发酵代谢产物，如细菌素、有机酸、神经酰胺等，应用于皮肤后可以为其提供屏障，可以阻止细菌、真菌、病毒及其组合物的生长。

附图说明

图1富硒绿豆发酵液对酪氨酸酶的抑制率

图2富硒绿豆发酵液对DPPH自由基的清除率

图3富硒绿豆发酵液处理24h后对AQP3基因表达的影响

图4富硒绿豆发酵液处理48h后对AQP3基因表达的影响

图5普通绿豆和富硒绿豆对酪氨酸酶的抑制率

图6普通绿豆和富硒绿豆对DPPH自由基的清除率

图7普通绿豆和富硒绿豆在RH＝81％的吸湿率

图8普通绿豆和富硒绿豆在RH＝30％的吸湿率

图9普通绿豆和富硒绿豆的保湿率

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1富硒绿豆发酵液的制备

本实施例所制备的富硒绿豆发酵液中含有以嗜热链球菌和丙酸杆菌为发酵菌种的富硒绿豆发酵液32重量份和以枯草芽孢杆菌为发酵菌种的富硒绿豆发酵液68重量份。

富硒绿豆粉的制备：将绿豆去杂、清洗、烘干后，用中药粉碎机进行初步粉碎后，得富硒绿豆粗粉，再将富硒绿豆粗粉在压缩空气压强0.88Mpa，引风机频率53Hz，分级轮频率70Hz，加料电机频率12Hz的条件下进行气流粉碎，接着再用射流纳米粉碎机进行粉碎，其参数为：排气压力7Mpa，流体压力40Mpa，流量3.5m³/min，所得富硒绿豆粉的粒径为15-20μm。

嗜热链球菌和丙酸杆菌为发酵菌种的富硒绿豆发酵液的制备：将50g的富硒绿豆粉经7KGy的钴60辐照灭菌后，与450g的纯化水和7.5g的经灭菌的可溶性淀粉混合，然后接种嗜热链球菌种子液20g和丙酸杆菌种子液35g，两种菌种种子液浓度均为2×10⁷CFU/ml，控制发酵温度为36.5℃，发酵18h后制得。

枯草芽孢杆菌为发酵菌种的富硒绿豆发酵液的制备：将50g的富硒绿豆粉经7KGy的钴60辐照灭菌后，与450g的纯化水、10g的经灭菌的L-谷氨酸和3.5g的经灭菌的柠檬酸混合，然后接种枯草芽孢杆菌种子液15g，菌种种子液浓度为2×10⁷CFU/ml，控制发酵温度为37℃，转速170r/min，通气量2vvm，pH值6.8，发酵46h后制得。

将32重量份的以嗜热链球菌和丙酸杆菌为发酵菌种的富硒绿豆发酵液和68重量份的以枯草芽孢杆菌为发酵菌种的富硒绿豆发酵液物混合，得到本实施例的富硒绿豆发酵液。

实施例2富硒绿豆发酵液对酪氨酸酶的抑制作用

酪氨酸酶是一类络合铜离子的金属酶类，广泛存在于动植物、微生物及人体中，是生物体合成黑色素、果蔬褐变的关键酶。黑色素在黑素小体内主要通过酪氨酸酶的作用进行合成，在人体皮肤角化细胞中，黑色素的形成导致表皮褐变，产生黑斑。以酪氨酸酶抑制剂作为化妆品美白添加剂的作用靶点主要是通过抑制酪氨酸酶的活性和调节酪氨酸酶的转录。其中抑制酪氨酸酶活性的作用模式是目前市场上大多数美白化妆品开发应用的靶点。酪氨酸酶是黑色素合成过程中的主要限速酶。

配置磷酸盐缓冲溶液PBS(0.2M，pH6.8)，酪氨酸酶溶液(200U/ml)，按照如下表1在各反应组试管中分别加入PBS、实施例1最终制备得到的富硒绿豆发酵液、酪氨酸酶溶液(总的反应体系是3mL)，混合均匀，于恒温水浴(37℃)反应10min，之后分别迅速加入多巴溶液(1.5g/ml)1mL，混匀，放回水浴中反应15min，当反应至15min时马上测量各反应组试管在475nm处的吸光度值。按照如下公式计算酪氨酸酶活性的抑制率：

酪氨酸酶活性的抑制率(％)＝[(AC1－AC2)－(AT1－AT2)]/((AC1－AC2)×100％

表1

反应组	PBS/ml	富硒绿豆发酵液/ml	酪氨酸酶溶液/ml
				C1	2.5	0	0.5
C2	3	0	0
				T1	2.49-2.18	0.01/0.02/0.04/0.08/0.16/0.32	0.5
T2	2.99-2.68	0.01/0.02/0.04/0.08/0.16/0.32	0

以抗坏血酸作为阳性对照，按照如上相同方法测定其酪氨酸酶活性的抑制率。

结果参见图1。由图1可以看出，富硒绿豆发酵液对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用，且抑制强度与其浓度呈依赖性关系，表明富硒绿豆发酵液具有美白功效。

实施例3富硒绿豆发酵液对DPPH自由基的清除作用

自由基是氧代谢的产物，它的衍生物活性氧使组织细胞机构和代谢功能遭到破坏，引起机体一系列的衰老症状。羟自由基是毒性最强的一种自由基，它会和机体细胞的糖、蛋白质、脂质和核苷酸等生物大分子发生氧化反应，从而对细胞和机体造成伤害。所以对稳定的DPPH自由基清除作用是一种在短时间里衡量抗氧化作用的主要方法。

将实施例1最终制备得到的富硒绿豆发酵液(10/20/40/80/160/320/640μL)和2mL浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液均匀混合(保证反应体系为4mL，用蒸馏水补齐)，在室温下避光静置30min，随后在517nm处用无水乙醇作参比溶液测定其吸光值A1。同时将2mL无水乙醇和2ml浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液的混合溶液用无水乙醇作参比溶液测定的吸光值A0作为空白值，实施例1制备得到的富硒绿豆发酵液(10/20/40/80/160/320/640μL)和2mL无水乙醇的混合溶液用无水乙醇作参比溶液测定的吸光值A2作为背景值(保证反应体系为4mL，用蒸馏水补齐)。按照如下公式计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝A0-(A1-A2)/A0*100％

以抗坏血酸作为阳性对照。按照如上相同方法测定其DPPH自由基清除率。

结果见图2。由图2可以看出，富硒绿豆发酵液对自由基有很好的清除能力，且清除能力与其浓度呈依赖性关系，表明富硒绿豆发酵液具有抗衰老功效。

实施例4富硒绿豆发酵液对成纤维细胞AQP3基因表达的促进作用

真皮中最重要的细胞是成纤维细胞(HDF)，其数量、形态、生理状态与皮肤锁水保湿能力密切相关，而其中水通道蛋白3基因(AQP3)与皮肤保湿功能和弹性密切相关。

(1)HDF细胞在ScienCell完全培养基中培养，细胞长到90％密度时，将细胞按2×10⁴cells/mL密度接种于12孔板，于37℃，5％CO₂环境中培养48h；

(2)将实施例1最终制备得到的富硒绿豆发酵液分别按浓度为1.56％、3.13％和6.25％作用于HDF细胞，每个浓度做4个复孔，于37℃，5％CO₂环境中孵育24h，另一组于37℃，5％CO2环境中孵育48h；对照组加无菌水。

(3)吸取上清液，用PBS清洗一次后利用Trizol法提取mRNA；

(4)按照反转录试剂盒说明书的指示将mRNA反转录为cDNA，随后按照荧光定量PCR试剂盒说明书的指示检测基因表达情况，以2-ΔΔCt法相对定量基因表达量，所得结果均表述为以GAPDH基因表达量进行矫正后的数据。引物信息如下表2所示：

表2

结果见图3和图4。由图3和图4可以看出，富硒绿豆发酵液对保湿相关基因—AQP3的表达有明显的促进作用，且图4呈剂量依赖关系，表明富硒绿豆发酵液具有保湿功效。

实施例5含有富硒绿豆发酵液的泥浆面膜的制备

按照如下步骤，制备组成如下表3所示的泥浆面膜：

1)称取各组分，清洗消毒生产所用器具和设备，备用；

2)将甘油、氧化铁黄、氧化铁黑、氧化铬绿放入研磨机中，研磨2小时左右，使其细腻均匀，备用，记为预制品1；

3)将丙二醇、对羟基苯乙酮混合搅拌加热至55℃溶解，备用，记为预制品2；

4)将烟酰胺、3-o-乙基抗坏血酸用适量水分散溶解，备用，记为预制品3；

5)将其余水置于主锅，开低速均质，加入黄原胶，搅拌，加入高岭土，高速均质8-10分钟，加热至90℃，保温灭菌45分钟，加入预制品1，搅拌均匀；

6)将GP200GP200、A165、鲸蜡硬脂醇、大花可可树籽脂、棕榈酸乙基己酯、山茶油加入油锅中，加热至75-80℃后溶解均匀，加入羟苯甲酯、羟苯丙酯，搅拌溶解；

7)启动真空泵将油锅中的原料抽入到主锅，保持真空度-0.07Mpa，快速搅拌并均质8-10分钟，85℃保温15-20分钟后开始降温；

8)降温到45℃，依次加入预制品2、预制品3、PE9010、实施例1最终制备得到的富硒绿豆发酵液、铁皮石斛提取物、银杏叶提取物、野菊花提取物、D-泛醇、绿豆香精，搅拌均匀；

9)38～40℃停搅拌，关冷却水，取样对板，测pH值，自检合格出料。

表3

实施例6普通绿豆和富硒绿豆在美白、抗衰、保湿、排毒功效上的对比

富硒绿豆和普通绿豆除了硒含量明显不同外，蛋白质含量和总糖含量也明显不同，具体如下表4所示：

表4

注：结果表示为平均值±标准差。同列字母的不同表示差异显著(p<0.05)。

下面比较了普通绿豆和富硒绿豆在美白、抗衰、保湿、排毒方面的功效差异：

①普通绿豆和富硒绿豆在美白功效上的对比

豆类醇提物的制备：将普通绿豆或者富硒绿豆粉碎，加入8倍量的体积分数约70％的乙醇，在75℃搅拌1.5小时，离心取上清液，豆渣再加入等体积的体积分数约70％的乙醇，搅拌，离心取上清液，合并两次的上清液，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得豆类醇提物。

实验方法同实施例2

结果见图5。由图5可以看出，在同等浓度下豆类醇提物(10mg/ml)对酪氨酸酶的抑制率依次为：富硒绿豆＞普通绿豆。结果表明富硒绿豆的美白效果明显好于普通绿豆。

②普通绿豆和富硒绿豆在抗衰功效上的对比

实验方法同实施例3。

结果见图6。由图6可以看出，对DPPH来讲，在同等浓度下(10mg/ml)，富硒绿豆对其清除效果要好于普通绿豆，在C＝400ug/ml时，富硒绿豆的清除率为51.25±0.07％＞普通绿豆49.42±0.01％。

③普通绿豆和富硒绿豆在保湿功效上的对比

吸湿率测定

采用体外法测定。将干燥器置于20℃的生化培养箱中，干燥器底部分别加入饱和氯化钙溶液和饱和硫酸铵溶液后相对湿度(Relative humidity，RH)的理论值分别为32％、81％，平衡12h后实测得相对湿度分别为30％、81％。准确称取0.5g冷冻干燥后的富硒豆类醇提物和普通豆类醇提物样品于直径25mm的扁形称量瓶中，分别放入相对湿度恒定的干燥器内进行吸湿实验，并以甘油作对比。隔2h、12h、24h、36h和48h将扁形称量瓶取出称重，根据以下公式计算吸湿率：

吸湿率(％)＝(mn-m0)/m0×100

式中：m0为样品初始质量；mn为放置n小时后的样品质量。

保湿率测定

采用体外法测定。准确称取0.5g冷冻干燥后的富硒豆类醇提物和普通豆类醇提物样品放入直径为25mm的扁形称量瓶，加入样品质量40％的去离子水，缓慢晃动称量瓶，待样品充分吸收水分后将其放入底部装有200g变色硅胶干燥剂的干燥器，同时以甘油作对照。24h后将扁形称量瓶取出称重，按以下公式计算保湿率：

保湿率(％)＝mn/m0×100

式中：m0为样品初始质量，mn为放置n小时后的样品质量。

结果为图7、图8和图9。由图7和图8可以看出两种豆类醇提物在相对湿度大的环境下的吸湿率高于相对湿度低的吸湿率，甘油在两种相对湿度下的吸湿率都是最大的，所以吸湿效果最好。在高相对湿度(RH＝81％)环境下，豆类醇提物的吸湿性能见图7，在48h时，吸湿率：富硒绿豆＞普通绿豆，其中富硒绿豆醇提物吸湿率为29.8±0.3％。在低相对湿度(RH＝30％)环境下，豆类醇提物的吸湿性能见图8，在48h时，吸湿率仍然为：富硒绿豆＞普通绿豆，其中富硒绿豆醇提物吸湿率为1.04±0.1％。从图9可以看出，对照组甘油的保湿效果最佳，保湿率为70.99％。豆类醇提物的保湿率依次为：富硒绿豆＞普通绿豆，其分别为45.87％，40.32％。

④普通绿豆和富硒绿豆在排毒功效上的对比

小鼠高铅模型的构建：取5周龄昆明小鼠，随机分组，空白组13只，模型组、EDTA组、普通组和富硒组均8只。

除空白组外，其余组连续10天，每天腹腔注射一次乙酸铅溶液进行染毒构建小白鼠的高铅模型，染毒剂量定为乙酸铅溶液12mg/kg体重。乙酸铅溶液的配置：称取1g三水乙酸铅在1000mL去离子水中溶解，另外加入12.50μl/L的醋酸以防铅盐和铅氢氧化物的凝聚。待建模结束后，称量各组小鼠的体重。具体见下表5

表5

小鼠排铅实验

小鼠建模后，灌胃15天。灌胃剂量为0.2ml/10g。灌胃溶液的配制如下：

(1)EDTA二钠钙盐组：称取1g溶于50ml水中。

(2)富硒绿豆蛋白组：称取1g溶于50ml水

(3)普通绿豆蛋白组：称取1g溶于50ml水中。

其中，富硒绿豆蛋白和普通绿豆蛋白采用碱(NaOH)提酸(HCl)沉法提取，工艺条件为：pH9.5、温度50℃、时间60min、料液比1g:30mL，酸沉绿豆蛋白的pH值为4.2。提取后的绿豆蛋白离心去除上清液，将沉淀用少量的水溶解倒入透析袋中，透析2天(每半天换液一次)，透析完成后，冷冻干燥得到绿豆蛋白样品。

实验动物血液中矿质元素的测定

血液微波消解

消解罐需提前在10％的硝酸溶液中浸泡过夜，戴手套捞出消解罐并用自来水冲洗，然后将冲洗好的消解罐放在超声波清洗机中进行15min的超声清洗，再用去离子水冲洗干净、置于烘箱中烘干备用。实验时称取血液0.5g于消解罐中，加入8ml、65％硝酸(优级纯)，按照下表6的微波消解条件，消解完成后，放在电加热板上设定温度为200℃，赶酸，待消化管中液体为1-2ml时，加入6mol/L盐酸还原，继续加热到液体体积1-2ml。用20％的优级纯盐酸溶液定容到25ml待测。

表6微波消解条件

结果如下表7所示。由表7可以看出对小鼠进行铅染毒后，各组小鼠血铅含量明显高于空白组，与未治疗的模型组相比，各治疗组小鼠血铅含量均低于模型组，表明EDTA二钠钙，普通绿豆蛋白，富硒绿豆蛋白对血铅都有一定的驱除效果，其中富硒绿豆蛋白的排血铅效果最好。

表7小鼠血铅含量

“*”表示与模型组相比P＜0.05

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (25)

1.一种富硒绿豆发酵液，含有通过嗜热链球菌和丙酸杆菌在含有富硒绿豆粉和淀粉的培养基1中发酵制得的富硒绿豆发酵液1，和通过枯草芽孢杆菌在含有富硒绿豆粉、L-谷氨酸和柠檬酸的培养基2中发酵制得的富硒绿豆发酵液2，

所述富硒绿豆发酵液1与富硒绿豆发酵液2的重量比为(2-5):(5-8)，

所述富硒绿豆发酵液1通过将嗜热链球菌种子液和丙酸杆菌种子液接种于含有富硒绿豆粉和淀粉的培养基1中，在35-38℃发酵6-48小时后制得，所述培养基1中含有以重量百分比计3-20％的富硒绿豆粉、0.5-10％的淀粉和70-96％的水，嗜热链球菌种子液的接种量为培养基1重量的1-6％，嗜热链球菌种子液中嗜热链球菌的浓度为1×10⁶-1×10⁸CFU/ml，丙酸杆菌种子液的接种量为培养基1重量的5-10％，丙酸杆菌种子液中丙酸杆菌的浓度为1×10⁶-1×10⁸CFU/ml，

所述富硒绿豆发酵液2通过将枯草芽孢杆菌接种于含有富硒绿豆粉、L-谷氨酸和柠檬酸的培养基2中，在35-40℃发酵24-72小时后制得，通气量为1.5-2.5vvm，pH为6.5-7.2，所述培养基2中含有以重量百分比计3-20％的富硒绿豆粉、0.5-10％的L-谷氨酸、0.1-5％的柠檬酸、65-96％的水，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为培养基2重量的1-6％，枯草芽孢杆菌种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为1×10⁶-1×10⁸CFU/ml。

2.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，由富硒绿豆发酵液1和富硒绿豆发酵液2组成。

3.如权利要求1或2所述的富硒绿豆发酵液，所述富硒绿豆发酵液1与富硒绿豆发酵液2的重量比为(3-4):(6-7)。

4.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述培养基1中含有以重量百分比计7-15％的富硒绿豆粉、1-2％的淀粉和83-92％的水。

5.如权利要求1或4所述的富硒绿豆发酵液，所述培养基1由富硒绿豆粉、淀粉和水组成。

6.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述培养基1中富硒绿豆粉的粒径为1-50μm。

7.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述淀粉为可溶性淀粉。

8.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述嗜热链球菌种子液的接种量为培养基1重量的3-5％，嗜热链球菌种子液中嗜热链球菌的浓度为1×10⁷-5×10⁷CFU/ml。

9.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述丙酸杆菌种子液的接种量为培养基1重量的6-8％，丙酸杆菌种子液中丙酸杆菌的浓度为1×10⁷-5×10⁷CFU/ml。

10.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，其中，所述富硒绿豆发酵液1中曲酸含量大于3％。

11.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，其中，所述富硒绿豆发酵液1中曲酸含量3-5％。

12.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述培养基2中含有以重量百分比计7-15％的富硒绿豆粉、1-3％的L-谷氨酸、0.5-1％的柠檬酸、81-91％的水。

13.如权利要求1或12所述的富硒绿豆发酵液，所述培养基2由富硒绿豆粉、L-谷氨酸、柠檬酸和水组成。

14.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述培养基2中富硒绿豆粉的粒径为1-50μm。

15.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为培养基2重量的2-4％，枯草芽孢杆菌种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为1×10⁷-5×10⁷CFU/ml。

16.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，其中，所述富硒绿豆发酵液2中γ-聚谷氨酸含量大于2％。

17.如权利要求1所述的富硒绿豆发酵液，其中，所述富硒绿豆发酵液2中γ-聚谷氨酸含量2-5％。

18.一种化妆品组合物，含有如权利要求1-17中任一项所述的富硒绿豆发酵液。

19.如权利要求18所述的化妆品组合物，其中，所述富硒绿豆发酵液的重量百分含量为0.1-10％。

20.如权利要求19所述的化妆品组合物，其中，所述富硒绿豆发酵液的重量百分含量为0.5％-3.0％。

21.如权利要求18所述的化妆品组合物，所述化妆品组合物为面膜组合物。

22.如权利要求21所述的化妆品组合物，所述化妆品组合物为泥浆面膜组合物。

23.一种泥浆面膜组合物，含有如权利要求1-17中任一项所述的富硒绿豆发酵液。

24.如权利要求23所述的泥浆面膜组合物，所述泥浆面膜组合物中含有以重量百分比计如下组分：

25.如权利要求24所述的泥浆面膜组合物，所述泥浆面膜组合物中含有以重量百分比计如下组分：

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