CN112514980A - 一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种麦醇溶蛋白纳米粒子(GNPs)负载抗菌肽(Nisin)的海产品保鲜剂制备方法，将提取的麦醇溶蛋白与Nisin混合，得到麦醇溶蛋白‑Nisin纳米粒子；将得到的麦醇溶蛋白‑Nisin纳米粒子溶液与除杂后的纳米甲壳素晶须(ChNW)溶液混合，得到麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂。本发明以Nisin为主要原料并辅以其他助剂制备的海产品保鲜剂，利用GNPs包埋Nisin，提高Nisin的稳定性及生物利用度。同时利用ChNW加入到GNPs溶液中，挺高GNPs的稳定性。Nisin作用于细胞质膜，造成细胞质如三磷酸腺苷的渗出，即破坏使细胞质中的基质失去活性，从而起到抑菌、杀菌作用。实验结果表明，本发明的海产品保鲜剂各项性能优异，其指标均超过市售普通保鲜剂，具有优异的抗菌性，且生物降解时间短，安全环保，可完全替代现有普通保鲜剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种海产品保鲜剂及其制备方法，具体涉及一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对食品质量要求也越来越高。沿海城市盛产的海产品已经可以销往全国，甚至全世界。但在保藏和运输过程中保证海产品的价值是一大难题，如微生物的侵蚀，导致海产品发生腐败；包装不当，由于产品之间挤压，导致机械损伤，海产品的商品价值和食用价值都会受到很大影响。如今市面上存在的海鲜的保鲜剂也有很多的类型，但存在许多的的不足，如污染环境，保鲜时间短，成本高等。
Nisin是一种由34个氨基酸组成的抗菌肽，它对许多革兰氏阳性菌具有活性，但稳定性差。中国专利CN201310081187.8公开了“一种天然海产品保鲜剂及其制备方法”，其中公开了以Nisin、柑橘幼果提取物为基础原料，加入冰醋酸、水等液体制备的一种海产品保鲜剂，它能都起到有效的抑菌作用，对海产品保鲜具有一定的保鲜效果，但该发明的保鲜剂抑菌时间不够理想。中国专利CN201710114061.4的发明专利“一种海产品保鲜组合物、保鲜剂和海产品保鲜方法”，并具体公开了以茶多酚、普鲁兰多糖和山梨酸钾为原料制备的一种海产品保鲜剂。虽然该保鲜剂可以对海产品起到一定的保鲜作用，但是其抑菌时间仍旧不够理想。而中国专利CN201810537594.8公开了“一种可消除异味的海产品保鲜剂及其制备方法”，该发明公开了以山梨酸钾、纳他霉素、抗氧化剂、多孔二氧化硅、维生素C等为原料制备的一种可消除异味的海产品保鲜剂。虽然该发明所制备的保鲜剂在一定程度上抑制了海产品中氯化三甲胺的分解，提高了对海产品的保鲜作用，但该发明没有遵循绿色环保理念。
随着科技的发展，生活水平的不断改善，人们对饮食方面的要求越来越高了，从吃饱的基本要求上升到吃的健康的层面了。在环境问题突出，科技不断创新的当代，环境友好型的材料呼之欲出。在这样的背景下，现有的海鲜产品保鲜方法和保鲜剂显然不能被人们所满足。因此，寻找一种安全、环保、保鲜效果强的保鲜剂刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于提供一种区别于传统保鲜海洋产品的材料，绿色、无污染的一种新型保鲜剂及其制备方法，利用Nisin的抗菌性，通过麦醇溶蛋白制备成GNPs包埋Nisin，提高Nisin的稳定性，并利用ChNW将粒子吸附在晶须表面形成一个稳定体系，从而使所制备的新型保鲜剂具有良好的抗菌性、成本低、绿色无污染等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)麦醇溶蛋白的提取：取10份小麦面积溶解在70％(v/v)的100mL 的乙醇溶液中，在35℃下搅拌5h，离心15分钟后收集上清液，将得到的上清液经过旋蒸、冷冻干燥，得到麦胶蛋白粉末；
(2)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子的制备：将3-5份步骤(1)中所得到的麦醇溶蛋白粉末和0.05份Nisin溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在25℃下搅拌2h，取混合后的液20mL滴加到100mL蒸馏水中，在 25℃下搅拌3h，经过旋蒸和离心后，得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液，并在4℃下储存备用；
(3)ChNW溶液的制备：取1-2份ChNW粉末溶解在10％(v/v)的 100mL的乙酸溶液中，在25℃下搅拌2h，经过除杂后得到ChNW溶液，并在4℃下储存备用；
(4)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液：将步骤(2)得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液与步骤(3)得到的ChNW溶液混合，在25℃下搅拌1h，得到麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液。
所述步骤所述Nisin固体为食品级，ChNW固体为食品级，小麦面筋固体为食品级，乙醇为分析纯，乙酸为分析纯。
所述步骤(1)中的旋蒸过程的温度为55℃，压力为-0.1Pa，蒸发时间为20min。
所述步骤(1)中的冷冻干燥过程为先在-80℃下冷冻12h，再干燥48h。
所述步骤(2)中的旋蒸过程的温度为55℃，压力为-0.1Pa，蒸发时间为20min。
所述步骤(2)中的离心转速为3000转，离心时间为10min。
所述步骤(2)中的滴加过程的速度为8mL/h。
所述步骤(3)中的除杂过程为在离心机中以3000r/min离心5min。
本发明提供了一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，将提取的麦醇溶蛋白与Nisin混合，得到麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子；将得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液与除杂后的ChNW溶液混合，得到麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂。本发明以Nisin为主要原料并辅以其他助剂制备的海产品保鲜剂，利用GNPs包埋Nisin，提高 Nisin的稳定性及生物利用度。同时利用ChNW加入到GNPs溶液中，挺高 GNPs的稳定性。Nisin作用于细胞质膜，造成细胞质如三磷酸腺苷的渗出，即破坏使细胞质中的基质失去活性，从而起到抑菌、杀菌作用。实验结果表明，本发明的海产品保鲜剂各项性能优异，其指标均超过市售普通保鲜剂，具有优异的抗菌性，且生物降解时间短，安全环保，可完全替代现有普通保鲜剂。
具体实施方式
本发明提供了一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，包括以下步骤：
(1)麦醇溶蛋白的提取：取10份小麦面积溶解在70％(v/v)的100mL 的乙醇溶液中，在35℃下搅拌5h，离心15分钟后收集上清液，将得到的上清液经过旋蒸、冷冻干燥，得到麦胶蛋白粉末；
(2)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子的制备：将3-5份步骤(1)中所得到的麦醇溶蛋白粉末和0.05份Nisin溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在25℃下搅拌2h，取混合后的液20mL滴加到100mL蒸馏水中，在 25℃下搅拌3h，经过旋蒸和离心后，得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液，并在4℃下储存备用；
(3)ChNW溶液的制备：取1-2份ChNW粉末溶解在10％(v/v)的 100mL的乙酸溶液中，在25℃下搅拌2h，经过除杂后得到ChNW溶液，并在4℃下储存备用；
(4)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液：将步骤(2)得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液与步骤(3)得到的ChNW溶液混合，在25℃下搅拌1h，得到麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液。
在本发明中，步骤(1)中所述的旋蒸过程的温度为55℃，压力为-0.1Pa，蒸发时间为20min，步骤(1)中所述的冷冻干燥过程为先在-80℃下冷冻12 h，再干燥48h；步骤(2)中所述的旋蒸过程的温度为55℃，压力为-0.1Pa，蒸发时间为20min；步骤(2)中所述的滴加过程的速度为8mL/h；步骤(2) 中所述的离心转速为3000转，离心时间为10min；所述步骤(3)中所述的除杂过程为在离心机中以3000r/min离心5min。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，包括以下步骤：
(1)麦醇溶蛋白的提取：取10份小麦面积溶解在70％(v/v)的100mL 的乙醇溶液中，在35℃下，以400r/min搅拌5h，在离心机中以3000转，离心15min，收集上清液。将溶液放入旋转蒸发仪中除去溶液中的酒精，在 55℃下，以-0.1Pa蒸发20min。最后，将样品在-80℃下冷冻12h，再冷冻干燥48h后得到麦胶蛋白粉末；
(2)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子的制备：将4份麦醇溶蛋白和0.05份 Nisin溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在25℃下，用磁力搅拌在400r/min的速度下搅拌2h；取原溶液20mL以8mL/h的速度滴在100mL 蒸馏水中，在25℃下，在400r/min的速度下搅拌3h；将溶液放入旋转蒸发仪中以55℃、-0.1Pa的条件，旋转蒸发20min以除去溶液中的酒精。最后离心机中以3000转，离心10min，去除大颗粒，得到的麦醇溶蛋白-Nisin 纳米粒子溶液，并在4℃下储存备用；
(3)ChNW溶液的制备：取1份ChNW粉末溶解在10％(v/v)的100 mL的乙酸溶液中，在25℃下，以400r/min磁力搅拌2h，经过3000转离心10min除杂，得到ChNW溶液，并在4℃下储存备用；
(4)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液：将ChNW溶液溶液与(2) 中麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液混合，在25℃下，以400r/min磁力搅拌1 h，得到麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂。
实施例2
(1)麦醇溶蛋白的提取：取10份小麦面积溶解在70％(v/v)的100mL 的乙醇溶液中，在35℃下，以400r/min搅拌5h，在离心机中以3000转，离心15min，收集上清液。将溶液放入旋转蒸发仪中除去溶液中的酒精，在 55℃下，以-0.1Pa蒸发20min。最后，将样品在-80℃下冷冻12h，再冷冻干燥48h后得到麦胶蛋白粉末；
(2)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子的制备：将3份麦醇溶蛋白和0.05份 Nisin溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在25℃下，用磁力搅拌在400r/min的速度下搅拌2h；取原溶液20mL以8mL/h的速度滴在100mL 蒸馏水中，在25℃下，在400r/min的速度下搅拌3h；将溶液放入旋转蒸发仪中以55℃、-0.1Pa的条件，旋转蒸发20min以除去溶液中的酒精。最后离心机中以3000转，离心10min，去除大颗粒，得到的麦醇溶蛋白-Nisin 纳米粒子溶液，并在4℃下储存备用；
(3)ChNW溶液的制备：取1份ChNW粉末溶解在10％(v/v)的100 mL的乙酸溶液中，在25℃下，以400r/min磁力搅拌2h，经过3000转离心10min除杂得到ChNW溶液，并在4℃下储存备用；
(4)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液：将ChNW溶液溶液与(2) 中麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液混合，在25℃下，以400r/min磁力搅拌1 h，麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂。
实施例3
(1)麦醇溶蛋白的提取：取10份小麦面积溶解在70％(v/v)的100mL 的乙醇溶液中，在35℃下，以400r/min搅拌5h，在离心机中以3000转，离心15min，收集上清液。将溶液放入旋转蒸发仪中除去溶液中的酒精，在 55℃下，以-0.1Pa蒸发20min。最后，将样品在-80℃下冷冻12h，再冷冻干燥48h后得到麦胶蛋白粉末；
(2)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子的制备：将3.5份麦醇溶蛋白和0.05 份Nisin溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在25℃下，用磁力搅拌在400r/min的速度下搅拌2h；取原溶液20mL以8mL/h的速度滴在100 mL蒸馏水中，在25℃下，在400r/min的速度下搅拌3h；将溶液放入旋转蒸发仪中以55℃、-0.1Pa的条件，旋转蒸发20min以除去溶液中的酒精，最后离心机中以3000转，离心10min，去除大颗粒，得到的麦醇溶蛋白-Nisin 纳米粒子溶液，并在4℃下储存备用。
(3)ChNW溶液的制备：取2份ChNW粉末溶解在10％(v/v)的100 mL的乙酸溶液中，在25℃下，以400r/min磁力搅拌2h，经过3000转离心10min除杂后得到ChNW溶液，并在4℃下储存备用。
(4)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液：将ChNW溶液溶液与(2) 中麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液混合，在25℃下，以400r/min磁力搅拌1 h，麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂。
将制得的麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂与市面上销售的保鲜剂作如下相关性能测试：
(1)细胞毒性
小鼠巨噬细胞J774培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，经消化后，以5×104/孔铺板至96孔细胞培养板中，在3℃、5％的CO2条件下过夜培养。第二天加入保鲜剂，继续培养。5h后，离心，取上清液，按照1:1 比例加入LDH试剂，避光孵育20min，490nm处检测吸光度值，DMEM处理组为阴性对照，0.2％的Triton处理组为阳性对照，DMSO处理组为溶剂对照。
式中：OD-药物处理组490nm的吸光度值；
T-阳性对照。
(2)抗菌率
取一定量的保鲜剂置于50mL的锥形瓶中，在121℃下灭菌5min，加入10mL放104cfu/mL的大肠杆菌或金色葡萄球菌的营养汤液，在37℃下震荡5min。取0.1mL在试管中稀释2000倍，取1.0mL铺于琼脂培养基平板上，在37℃的恒温培养箱中培养24小时，进行活菌计数。
(3)持续杀菌实验(抑菌时长)
去一定量的保鲜剂加入培养好的50mL菌液中，调pH值为5.5后放入 30℃摇床中进行震荡，24h时取取0.1mL在试管中稀释至适宜浓度，取1.0 mL铺于琼脂培养基平板上培养24h。每天从中取0.1mL在试管中稀释并倒平板培养，观察Nisin溶液的持续杀菌效果。
(4)生物降解性
将本发明的GNPs负载Nisin海产品保鲜剂和市面上销售的海产品保鲜剂在水中，观察其降解所需时间。
所得到的结果如表1所示：
表1本发明Nisin海产品保鲜剂与市面上销售的海产品保鲜剂相关性能测试结果对比
实验结果表明，本发明的海产品保鲜剂各项性能优异，其指标均超过市售普通保鲜剂，具有优异的抗菌性，且生物降解时间短，安全环保，可完全替代现有普通保鲜剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)麦醇溶蛋白的提取：取10份小麦面积溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在35℃下搅拌5h，离心15分钟后收集上清液，将得到的上清液经过旋蒸、冷冻干燥，得到麦醇溶蛋白粉末；
(2)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子的制备：将3-5份步骤(1)中所得到的麦醇溶蛋白粉末和0.05份Nisin溶解在70％(v/v)的100mL的乙醇溶液中，在25℃下搅拌2h，取混合后的液20mL滴加到100mL蒸馏水中，在25℃下搅拌3h，经过旋蒸和离心后，得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液，并在4℃下储存备用；
(3)ChNW溶液的制备：取1-2份ChNW粉末溶解在10％(v/v)的100mL的乙酸溶液中，在25℃下搅拌2h，经过除杂后得到ChNW溶液，并在4℃下储存备用；
(4)麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液：将步骤(2)得到的麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子溶液与步骤(3)得到的ChNW溶液混合，在25℃下搅拌1h，得到麦醇溶蛋白-Nisin纳米粒子/ChNW溶液。
2.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，所述Nisin固体为食品级，ChNW固体为食品级，小麦面筋固体为食品级，乙醇为分析纯，乙酸为分析纯。
3.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的旋蒸过程的温度为55℃，压力为-0.1Pa，蒸发时间为20min。
4.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的冷冻干燥过程为先在-80℃下冷冻12h，再干燥48h。
5.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的旋蒸过程的温度为55℃，压力为-0.1Pa，蒸发时间为20min。
6.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的离心转速为3000转，离心时间为10min。
7.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的滴加过程的速度为8mL/h。
8.根据权利要求1所述的一种麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的除杂过程为在离心机中以3000r/min离心5min。
9.权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到的麦醇溶蛋白纳米粒子负载抗菌肽的海产品保鲜剂，其特征在于用于海产品的保鲜。
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