CN112512527A - 恩扎妥林和btk抑制剂的组合及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含恩扎妥林和BTK抑制剂的药物，特别是治疗性组合、药物组合物和方法。这些组合和使用这些组合的方法提供了可用于治疗多种病况(包括某些癌症，例如B细胞淋巴癌)的治疗效果。本文所提供的数据表明，当恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)一起使用时，可提供协同治疗效果。

Description

恩扎妥林和BTK抑制剂的组合及其用途

相关申请

本申请要求于2018年9月12日提交的PCT国际专利申请第PCT/CN2018/105217号的优先权，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入。

发明领域

本发明涉及药物组合物和组合，以及使用这些组合物和组合治疗病况例如癌症(包括淋巴瘤和相关病况，尤其是B细胞淋巴癌)的方法。在特定实施例中，本发明提供包含恩扎妥林(enzastaurin)和布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase；BTK)抑制剂(其实例于本文中公开)的组合，以及使用这些组合治疗淋巴瘤的方法。

发明背景

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是淋巴瘤的最常见形式，通过可能在形态、生物学、免疫表型和临床表现方面以及治疗结果方面均有不同的异质性肿瘤实体来表征[1,2]。根据基因表达谱，两种亚型是常见的，即：DLBCL的生发中心B细胞样(GCB)和活化B细胞样(ABC)亚群。这两种亚型合计占约80％的DLBCL病例，剩下大约10～20％的病例“无法归类”[2]。DLBCL的ABC和GCB亚型参与不同的细胞路径，这构成对理解肿瘤的发展和维持(包括所述肿瘤对疗法的反应)的主要障碍[3]。尽管这些患者中超过一半可以获得持久的缓解，但DLBCL仍然是极大的临床挑战，其中大约30％的患者未被治愈[4]。尤其对于存活率较低的复发性/难治性DLBCL患者，迫切需要新颖且有效的治疗策略。

异常的B细胞受体(BCR)信号传导已牵涉于B细胞恶性肿瘤的发病机制中，所述异常的信号传导被广泛理解为推动疾病进展的主要机制之一[5,6]。DLBCL中BCR的连续活化引起调节蛋白和衔接蛋白(例如脾酪氨酸激酶(SYK)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和蛋白激酶C-β(PKCβ))的磷酸化和活化，尤其是在ABC型DLBCL中[3,7,8]。相比之下，GCB型DLBCL中的致癌性信号传导的起始和增强共同依赖于PI3K/mTOR信号传导，所述PI3K/mTOR信号传导与核因子κB(NF-κB)无关[9,10]。近年来，越来越多的研究集中于对BCR信号传导的治疗性抑制，尤其是用于治疗DLBCL的组合类治疗方案[7,11,12]。

DLBCL是异质性淋巴瘤，并且尽管利妥昔单抗(rituximab)的引入已极大地改善许多病例的结果，但所有病例的约30％～40％仍然是不可治愈的[32]。此情形的一个重要原因是如上文所述的ABC和GCB型DLBCL涉及不同的信号传导路径。ABC亚型的突出特征为具有MYD88、CARD11、CD79A和CD79B突变，体现于其组成型地促进NF-κB路径信号传导，展现出不太有利的临床结果[8,33,34]。相比之下，GCB亚型更依赖于PI3K/AKT活性而非NF-κB路径[10]。这一信号多样性转化为不同程度的肿瘤侵袭性和对治疗方法的不同反应[35]。因此，对于DLBCL患者来说，BCR抑制剂，包括BTK、PI3K、SYK和PKCβ抑制剂，代表有前景的治疗策略。本文中的数据首次表明，使用恩扎妥林和依鲁替尼(ibrutinib)(BTK抑制剂)的组合治疗在体外和体内均对DLBCL产生增强的抗肿瘤效果。机理性数据表明此效果可能依赖于相关信号传导路径的失活和下调NOTCH1的表达。

恩扎妥林是相对充分研究的抗肿瘤剂。其以6nmol/L的IC50靶向PKCβ，并且还在较高浓度下抑制其它PKC同功异构物。对恩扎妥林的临床前研究已在皮肤T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia：WM)和其它实体肿瘤方面产生有前景的结果[36-39]。先前的研究已确定，如由>50％细胞的免疫染色所定义，22％的DLBCL肿瘤样品的PKCβ表达呈阳性；此外，PKCβ表达是DLBCL中不良预后的适用标记物[40,41]。I/II期研究显示，患者对恩扎妥林的耐受性良好，并且15％(8/55)的患者具有延长的无进展生存期(FFP≥4个周期)，7％(4/55)的患者甚至经历20～50个月的FFP[18,19]。然而，在III期临床试验(PRELUDE)中，单独的恩扎妥林在缓解B细胞淋巴瘤之后并未显著改善高风险DLBCL患者的无病生存率(DFS)。这停止了就恩扎妥林在DLBCL方面作为单一疗法的开发。

对失败疗法的分析对推进临床前和临床研究提供了机会，因为所述分析可针对治疗性组合的开发提供见解。之前的研究已经注意到，使用HDAC抑制剂(HDACi)和恩扎妥林的组合治疗在DLBCL中展现出协同作用，例如，因为HDACi可增加PKCβ的表达，从而导致存活信号的活化[16]。另外，已经开发了包含恩扎妥林以及其它药剂(例如来那度胺(lenalidomide)、NVP-BEZ235(PI3K抑制剂)和硼替佐米(bortezomib))的治疗方案来治疗非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)细胞系[14,42,43]。这些是尝试鉴别治疗性组合从而利用那些尽管在体外活性具有潜在价值但并未展现足以被开发的单药功效的药剂的实例。

仍需要针对B细胞淋巴癌例如DLBCL的新治疗，尤其是靶向多个生物化学路径并且因此能够更好地治疗异质性肿瘤和对抗耐药性机制的组合治疗。本发明提供此类组合和其使用方法。

发明内容

恩扎妥林，一种强力且选择性经口服施用的数种PKC同功异构物的抑制剂，被证明在实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤中调节PI3K/AKT/mTOR、MAPK和JAK/STAT路径[13-16]。有趣的是，一些研究人员已发现，PKCβ作为BTK活化的反馈回路抑制剂而起作用，其通过改变BTK膜定位来调节信号传导路径[23,24]。PKCβ可通过Tyr551处的转磷酸化和Tyr223处的自体磷酸化来下调BTK的活化。此外，抑制PKCβ会引起BTK的膜靶向增强、PLCγ2的磷酸化上调和BCR介导的Ca²⁺信号传导扩增[24]。

尽管在DLBCL的临床前研究和I/II期临床试验中证实了恩扎妥林在DLBCL中的效果，但其III期临床试验并不符合主要终点[17-19]，从而导致赞助者中断临床试验。虽然已经在不同临床试验中进行了若干尝试以显示使用恩扎妥林的治疗效果，但在美国尚未批准其用于任何治疗用途。

依鲁替尼(PCI-32765)是BTK抑制剂的口服活性抑制剂，其结合BTK激酶域上的半胱氨酸-481，从而导致Tyr-223处的不可逆抑制。近年来，已经在依鲁替尼的开发中取得了显著进展，表明了在多种B细胞恶性肿瘤中的功效。在DLBCL的ABC和GCB亚型中，信号路径的差异转化为对BTK的反应差异，这在复发性DLBCL患者中进行的依鲁替尼的II期试验中基本上得到确认。结果显示，37％的患有ABC-DLBCL的患者(14/38)但仅5％(1/20)的患有GCB-DLBCL的患者产生总体反应率(ORR)[3]。除此之外，具有CD79A/Bmut、CARD11mut、TNFAIP3mut或MYD88mut的ABC-DLBCL患者显示出对依鲁替尼的最初耐药性[3,7]。在用依鲁替尼进行治疗后最初反应良好的一部分患者最终复发，这显然是由于BTK或PLC-γ2(紧接在BTK下游的蛋白质)中的活化突变所致。这强调了当由于肿瘤异质性而存在或因治疗而产生耐药性时，需要开发新的靶向药剂和组合治疗以改善治疗结果[44]。最近的关注集中于药物组合，确切地说，集中于在DLBCL中用BTK抑制剂和来那度胺、硼替佐米、PI3K抑制剂和Pan-SRC激酶抑制剂的共治疗[7,12,45-48]。当将依鲁替尼添加到用这些药剂治疗的DLBCL细胞中时，药物对细胞展现了协同细胞毒性效果。也有临床数据支持依鲁替尼与利妥昔单抗和奥法木单抗(ofatumumab)以组合疗法使用以用于治疗复发性或难治性CLL/SLL[49]。当前进行中的试验将进一步定义依鲁替尼作为前期疗法和/或作为组合治疗在B细胞淋巴恶性肿瘤中的作用。

本文中的数据表明，PKCβ抑制剂恩扎妥林与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合在DLBCL中产生协同抗肿瘤效果。恩扎妥林与低剂量依鲁替尼(例如低于单药剂量)的组合协同地起作用以在体外和体内遏制DLBCL细胞生长。基于所述结果，对于患有DLBCL的患者来说，恩扎妥林与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合是有效的治疗性治疗，所述组合与分子亚型和信号传导依赖性无关，并且对于治疗细胞免疫系统的其它恶性肿瘤来说预期有效，尤其是对于B细胞来源的恶性肿瘤。

此外，基于本文所提供的数据，恩扎妥林似乎能够增强BTK抑制剂用于一般治疗性用途的功效。在不受理论束缚的情况下，认为生物化学相互作用允许恩扎妥林在与BTK抑制剂组合使用以用于治疗肿瘤病况、免疫病症、胃肠道病症、CNS病症、皮肤病症、血液病症和代谢病症时展现协同作用。

可用本发明组合治疗的免疫病症包括移植物抗宿主疾病(GVHD)、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、寻常天疱疮、舍格伦综合征(Sjogren's Syndrome)和其它自体免疫病症。

可用本发明组合治疗的胃肠道病症包括全身性肥大细胞增生症。

可用本发明组合治疗的CNS病症包括多发性硬化症，尤其是复发性多发性硬化症。

可用本发明组合治疗的皮肤病症包括慢性荨麻疹。

可用本发明组合治疗的血液病症包括血小板减少性紫癜。

可用本发明组合治疗的肿瘤学病症包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、复发性CLL、难治性CLL、滤泡性淋巴瘤、腺癌、转移性腺癌(例如胰腺癌)、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、转移性乳腺癌、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、难治性多发性骨髓瘤、复发性多发性骨髓瘤、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤(B细胞霍奇金淋巴瘤)、转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、原发性CNS淋巴瘤、肾细胞癌、继发性CNS淋巴瘤、移行细胞癌、尿路上皮细胞癌、结边缘B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、上皮卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、(反复性)头颈癌、鳞状细胞癌、(反复性)多形性胶质母细胞瘤(GBM)和B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在一个方面，本发明提供一种治疗选自肿瘤病况、免疫病症、胃肠道病症、CNS病症、皮肤病症、血液病症和代谢病症的疾病或病况的方法。所述方法包含向需要此类治疗的受试者施用有效量的恩扎妥林和BTK抑制剂；优选地，所述方法包含施用足以提供协同有效性的量的恩扎妥林和BTK抑制剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗癌症，尤其是B细胞相关癌症的方法。

在一个方面，本公开提供一种治疗淋巴瘤和相关病况的方法，其包含向有需要的受试者施用恩扎妥林或其药学上可接受的盐和第二治疗剂，其中第二治疗剂是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一些实施例中，所述方法用于治疗淋巴瘤，尤其是DLBCL。

在另一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂，所述BTK抑制剂通常为低分子量有机化合物，例如分子量在200与约2000之间的有机化合物。任选地，组合物可包括药学上可接受的载体或赋形剂。适当地，BTK抑制剂可以是依鲁替尼。

在另一个方面，本公开提供一种治疗性组合，其包含恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。两种治疗剂(恩扎妥林和BTK抑制剂)可一起或单独施用；通常，它们呈可一起服用或在不同时间服用的单独剂量单位(例如，丸剂或胶囊剂)。每一组分可单独地制备以用于施用，或所述二者可组合成单一组合物。

前述方面的BTK抑制剂可以选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼(acalabrutinib)、泽布替尼(zanubrutinib)、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼(spebrutinibbesylate)、维卡布替尼(vecabrutinib)、依武替尼(evobrutinib)、替拉布替尼(tirabrutinib)、芬尼布替尼(fenebrutinib)、泊塞替尼(poseltinib)、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，或这些中一者的药学上可接受的盐。本发明的组合物、组合和方法可用这些BTK抑制剂中的任一种或用其中的两种或更多种的混合物或用这些BTK抑制剂的药学上可接受的盐来实践。

GDC-0834是在体外酶和细胞实验中IC50分别为5.9nM和6.4nM的强力及选择性BTK抑制剂，且在小鼠和大鼠中展现分别为1.1μM和5.6μM的体内IC50。BMX-IN-1是选择性的、不可逆的染色体X上的骨髓酪氨酸激酶(BMX)抑制剂。在BMX ATP结合域中，化合物靶向Cys496，IC50值为8nM；并且在BTK中，其IC50值为10.4nM。RN486是高度活性Btk抑制剂，IC50为4.0nM。SNS-062是强力、非共价的BTK抑制剂和白介素-2诱导型T细胞激酶(ITK)抑制剂，其Kd值分别为0.3nM和2.2nM；对于ITK来说，SNS-062的IC50是24nM。LFM-A13是抑制BTK、Plx1和PLK3的活性的强力BTK、JAK2、PLK抑制剂，其IC50分别为2.5μM、10μM和61μM。PCI-32765是依鲁替尼的外消旋形式，并且是Btk选择性抑制剂，IC50为0.5nM；其展现出Bmx、CSK、FGR、BRK和HCK的适度抑制，以及EGFR、Yes、ErbB2和JAK3上的较低活性。CGI-1746是IC50为1.9nM的强力、高度选择性的BTK抑制剂。ONO-4059具有2.2nm的IC50值且为选择性BTK抑制剂。在B细胞中，ONO-4058结合到BTK，因此阻断B细胞受体信号传导并且阻碍B细胞的发育。QL47是IC50为7nM的不可逆BTK抑制剂。

优选地，BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼，或其药学上可接受的盐。依鲁替尼是用于所述组合物、组合和方法的优选BTK抑制剂。

在另一个方面，本发明提供体内治疗性组合，包含了恩扎妥林和BTK抑制剂的混合物，在同期向受试者施用恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)或其药学上可接受的盐时在受试者体内形成了所述混合物。当这两种活性剂一起施用时，或当这两种活性剂在一小时时段内或在两小时时段内施用时，或当这两种活性剂在时间上足够接近地一起施用以使二者中的每一个别组分来说以至少5％和通常至少10％Cmax的水平同时存在于受试者的血浆或血液中时，这两种活性剂的施用是同期的。优选地，治疗性组合包含每一成分(所使用的恩扎妥林和BTK抑制剂)以至少约20％的Cmax同时存在的血液或血浆。在此情形下，Cmax是指使用组合疗法中所述组分所用的相同施用途径、定量给药和配制物来当单独施用该组分时，可见的最大血液或血浆浓度。

如本文所使用，“BTK抑制剂”(BTK inhibitor和“BTK的抑制剂”(inhibitor ofBTK)具有相同含义，并且除非另外明确指示，否则所述术语包括药学上可接受的盐。

本文中的组合物和方法可以用于治疗任何合适的病况，最通常用于治疗B细胞淋巴病症，例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。本文中的数据显示，所述方法和组合物尤其适用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

在一些实施例中，待治疗的受试者是已诊断患有B细胞增生性病症(例如淋巴瘤形式)的受试者。在一些实施例中，基于生物标记物例如DGM1(索元基因标记物1(DenovoGenetic Marker1))的存在选择受试者。

在一些实施例中，所述方法和组合物与至少一种额外治疗剂组合使用，所述额外治疗剂可用于治疗待用本发明组合治疗的受试者。作为一实例，受试者可以用适用于治疗受试者中相同病况的常规化疗剂(例如利妥昔单抗)治疗，或受试者可以用本发明组合与组合治疗例如CHOP(包括药物环磷酰胺、阿霉素盐酸盐(羟基道诺霉素(hydroxydaunorubicin))、长春新碱硫酸盐(安可平(Oncovin))和泼尼松(prednisone)的常规化疗方案)结合治疗。在其它实施例中，包含恩扎妥林和BTK抑制剂的方法和组合物可与R-CHOP一起使用，所述R-CHOP是用于治疗非霍奇金淋巴瘤和套细胞淋巴瘤的化疗组合的缩写，且其正被研究用于治疗其它类型的癌症。R-CHOP包括药物利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素盐酸盐(羟基道诺霉素)、长春新碱硫酸盐(安可平)和泼尼松。可与恩扎妥林和BTK抑制剂的组合一起使用的其它治疗剂包括例如来那度胺、硼替佐米和PI3K抑制剂(例如BEZ235)。

此外，如越来越常见的，本文所公开的治疗性组合可以与帮助身体的自身免疫系统识别和对抗癌细胞的免疫肿瘤学治疗剂(例如PD-1或PD-L1抑制剂或其它已知的检查点抑制剂)结合施用。检查点抑制剂辅助受试者的免疫系统识别和攻击异常细胞(例如癌细胞)，并且可以显著增强化疗(如本文所公开的恩扎妥林与BTK抑制剂的组合)的功效。合适的检查点抑制剂包括生物制剂以及小分子治疗剂；这些的实例包括伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)和度伐利尤单抗(durvalumab)。

对于本发明的组合物、组合和方法来说，任何合适的BTK抑制剂可以与恩扎妥林组合使用。前述方面所述的BTK抑制剂可以选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，或这些中一者的药学上可接受的盐。优选地，BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼，或其药学上可接受的盐。依鲁替尼是用于本发明的组合、组合物和方法的优选BTK抑制剂。

所述组合物和方法优选地用于治疗DLBCL。

在本文的数据中，PKCβ抑制剂恩扎妥林与BTK抑制剂依鲁替尼的组合在ABC和GCB类型的DLBCL中显示协同抗肿瘤效果，由此为这些组合的临床前和临床研究提供基本原理并且允许开发针对DLBCL且尤其针对患有复发性或难治性DLBCL的受试者的特定、良好耐受性且有效的癌症疗法。

一些研究已表明PKCβ在BTK的负调节中的作用，且PKCβ抑制剂会改变BTK的磷酸化水平，这引起BTK信号传导增强[23,24]。本文所公开的结果支持所述关联。在用恩扎妥林治疗之后，p-BTK的表达展现出显著增加。因此，PKCβ强力充当BTK的负反馈信号，这意味着PKCβ抑制剂可以上调BTK的活化并且改变BCR下游的致癌信号。这可以解释为什么PKCβ抑制剂恩扎妥林与BTK抑制剂依鲁替尼的组合在DLBCL中具有协同抗肿瘤效果。这两种药剂的协同抗肿瘤效果在低于其IC50值的浓度下可见，并且包括减少增殖、促进细胞凋亡、诱导G1期停滞、阻止细胞侵袭和迁移以及下调下游信号传导的活化。在不受理论束缚的情况下，认为这种关系会使得恩扎妥林增加BTK抑制剂的治疗效力，从而产生如本文所描述的协同作用。

下游信号级联研究还表明，用恩扎妥林与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合治疗触发NOTCH1的mRNA水平的时间依赖性抑制，而单独的这些药物中的任一者仅稍微影响NOTCH1的表达。NOTCH1属于直接将胞外信号转导成基因表达变化的跨膜受体家族[29]。NOTCH1的致癌能力已经在血液疾病中得到验证，所述血液疾病包括T细胞急性成淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤(MM)、霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤[27,28,30]。许多最近研究还已经显示，大量DLBCL患者具有NOTCH1突变和畸变，这强调了NOTCH1作为DLBCL的基因驱动体的致癌作用[50-52]。此外，NOTCH1促进PI3K-AKT-mTOR和NF-кB信号传导路径的活化，所述路径不仅在T细胞赘瘤中而且在B细胞赘瘤中均在加速生长和抑制细胞凋亡方面发挥重要作用[28,29]。本发明研究显示，用恩扎妥林与依鲁替尼的组合治疗DLBCL显著降低NOTCH1的基因表达。NOTCH1表达方面的shRNA介导的降低极大地抑制了DLBCL细胞增殖。这些数据表明，NOTCH1的下调可能是在遏制细胞生长时在用恩扎妥林和BTK抑制剂进行共治疗的协同作用下的关键生物机制。这些研究可以解释为什么恩扎妥林在与BTK抑制剂组合使用时展现协同活性。

无论如何，在不受关于机制的理论束缚的情况下，本文中显示的恩扎妥林与依鲁替尼的组合在体外和体内DLBCL中的协同有效性表明，用恩扎妥林和BTK抑制剂的共治疗在DLBCL中产生了与分子亚型无关的抗肿瘤效果。这些结果表明此类组合是可行的治疗性治疗，并且同时遏制BTK和PKCβ似乎是用于治疗ABC和GCB亚型的DLBCL二者的新方法。

本文中所描述的组合物和方法可出于任何合适的目的使用。在一些实施例中，上文所描述的组合物可以用于疗法，尤其用于治疗B细胞相关的恶性肿瘤，例如淋巴瘤。如所示出，所述组合的协同作用适用于ABC和GCB形式的DLBCL。

在再另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含恩扎妥林和如本文所描述的那些BTK抑制剂。在这些实施例中，恩扎妥林和BTK抑制剂常常与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂掺合。在一些实施例中，恩扎妥林和BTK抑制剂与至少两种药学上可接受的载体或赋形剂掺合。

在又另一方面，本公开提供一种用于治疗和/或预防B细胞淋巴病症(例如淋巴瘤)的方法，其包含向有需要的受试者施用有效量的如上文所描述的包含恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合，或含有如本文所描述的这些物质的药物组合物。恩扎妥林和BTK抑制剂可以任选地以药学上可接受的盐的形式使用。在一些实施例中，B细胞淋巴病症为DLBCL，其包括ABC和GCB亚型的DLBCL。在这些方法的一些实施例中，基于生物标记物(例如生物标记物DGM1的存在)选择受试者。

在又另一方面，本公开提供一种降低已经针对B细胞淋巴病症(例如淋巴瘤)进行治疗的受试者的癌转移或复发的风险的方法，其包含向有需要的受试者施用有效量的如上文所描述的包含恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合，或含有如本文所描述的这些物质的药物组合物。恩扎妥林和BTK抑制剂可以任选地以药学上可接受的盐的形式使用。在一些实施例中，B细胞淋巴病症为DLBCL，其包括ABC和GCB亚型的DLBCL。在这些方法的一些实施例中，基于生物标记物(例如生物标记物DGM1的存在)选择受试者。

在另一个方面，本发明提供一种用于疗法的治疗性组合，确切地说是用于淋巴瘤例如DLBCL的治疗性治疗的治疗性组合，其中所述组合包含恩扎妥林和选自本文所公开的那些BTK抑制剂。治疗性组合可以是含有恩扎妥林和BTK抑制剂二者的单一药物组合物，或所述组合可以是用于一起但也能够单独施用的两种单独药物组合物。在以使得恩扎妥林和BTK抑制剂二者同时以相关血浆或血液浓度存在的方式向受试者施用恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)后，治疗性组合还可以体内产生。

在又另一方面，本公开提供一种上文所描述的治疗性组合(例如恩扎妥林和依鲁替尼)在制备药剂中的用途。虽然应理解，两种活性治疗剂可以单独施用，但在本发明的一些实施例中，其一起配制成单一剂量单位以作为药剂、尤其是用于治疗淋巴瘤(包括DLBCL)的药剂施用。

在又另一方面，本公开提供一种恩扎妥林与BTK抑制剂例如依鲁替尼的组合，其用于治疗和/或预防淋巴细胞癌、优选地B细胞淋巴瘤例如DLBCL。

在又另一方面，本公开提供一种恩扎妥林与BTK抑制剂例如依鲁替尼的组合，其用于降低已经针对淋巴细胞癌、尤其是B细胞淋巴瘤(例如DLBCL)进行治疗的受试者的癌转移或复发的风险。

在又另一方面，本公开提供一种用于治疗和/或预防淋巴细胞癌、优选地B细胞淋巴瘤(例如DLBCL)的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的上文所描述的组合。在一些实施例中，基于生物标记物例如DGM1(索元基因标记物1)的表达水平或存在选择受试者。在公开的专利申请WO2018/045240中公开并且描述了DGM1和其作为用于选择用恩扎妥林进行治疗的受试者的生物标记物的用途，并且所述方法可以类似地用于选择待用本文中的治疗性组合(例如恩扎妥林和依鲁替尼)进行治疗的受试者。

在又另一方面，本公开提供一种用于在细胞、器官或组织中抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(Btk或BTK)和PKCβ的活性以及相应路径的方法，所述方法包含使BTK或细胞、器官或组织与有效量的如上文所描述的恩扎妥林与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合或包含如上文所描述的组合的药物组合物接触。

在又另一方面，本公开提供一种恩扎妥林或其药学上可接受的盐与BTK抑制剂的组合在制备用于治疗或预防需要此类治疗或预防的受试者中的病症或疾病的药剂中的用途，所述病症或疾病选自肿瘤病况、免疫病症、胃肠道病症、CNS病症、皮肤病症、血液病症和代谢病症。

在又另一方面，本公开提供一种恩扎妥林或其药学上可接受的盐与BTK抑制剂的组合在制备用于治疗或预防需要此类治疗或预防的受试者中的淋巴瘤，或用于降低已经针对淋巴瘤进行治疗的受试者中的癌转移或复发的风险的药剂中的用途。

附图说明

图1(包括图1a-1c)示出ABC和GCB细胞系被恩扎妥林的抑制，以及BTK磷酸化的上调。

图2(包括图2a-2c)示出当恩扎妥林和依鲁替尼一起用于DLBCL细胞中时的协同作用。

图3(包括图3a-3d)示出恩扎妥林与依鲁替尼的组合在DLBCL细胞中促进细胞凋亡并诱导G1期停滞。

图4(包括图4a-4d)示出恩扎妥林与依鲁替尼的组合协同抑制DLBCL细胞的迁移和侵袭。

图5示出在三个细胞系中，恩扎妥林和依鲁替尼抑制下游信号传导的协同作用。

图6(包括图6a-6f)示出DLBCL中由恩扎妥林与依鲁替尼的组合引起的全转录组变化。

图7(包括图7a-7d)示出在DLBCL衍生的异种移植肿瘤中用恩扎妥林和依鲁替尼的协同抗肿瘤效果。

图8(包括图8a-8c)示出在恩扎妥林浓度为1μM、3μM和5μM下的通过单独的恩扎妥林和BTK抑制剂或以组合方式(持续72小时)引起的SU-DHL-6细胞生长抑制。以单独或组合分析形式测试三种BTK抑制剂，即泽布替尼、阿卡替尼和ARQ531。数据表示为相对于媒剂对照物处理的细胞的化合物抑制作用。结果表示了每次治疗的三次重复的均数加标准误(Mean+SEM)。*P<0.05，**P<0.01。

图9(包括图9a-9b)示出恩扎妥林和BTK抑制剂维卡布替尼在SU-DHL-5(上图)和SU-DHL-6(下图)细胞生长抑制分析中的协同作用。恒定比浓度法(constant ratioconcentration method)用于组合药物剂量选择。用恩扎妥林(0.08-5μM)和维卡布替尼(0.06-4μM)单独地或以相同比率的组合方式对细胞进行处理，持续72小时，每次治疗重复三次。计算组合指数(CI)值并列于以上曲线图中，以用于评估恩扎妥林的协同作用。结果表明，在SU-DHL-6细胞中除2.5μM下的恩扎妥林以外，在所有测试的剂量中CI<1的2种药物均具有协同活性。

具体实施方式

一般定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解相同的含义。本文中所提及的所有专利、申请、公开申请和其它公开物都是以全文引用的方式并入。如果这一部分中阐述的定义与以引用的方式并入本文中的专利、申请、和其它公开案中阐述的定义相反或不一致，那么这一部分中阐述的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。

如本文中所使用，“一(a/an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。

“治疗(Treating/treatment)”或“缓解”是指其中目标是减缓(减轻)(如果没有治愈)目标病理性病况或病症或预防病况复发的治疗性治疗。在接受治疗量的治疗剂或治疗之后，如果受试者显示出特定疾病的一种或多种病征和症状的可观测和/或可测量的降低或不存在，那么受试者被成功“治疗”。患者还可以感觉到疾病病征或症状的减轻。如果患者经历稳定疾病，那么也视为患者得到治疗。在一些实施例中，用治疗剂治疗可有效地使得患者在治疗之后3个月，优选地6个月，更优选地一年，甚至更优选地治疗之后2年或更多年没有疾病。在一些实施例中，用治疗剂治疗对于患者来说可有效地产生较长存活时间和/或较高存活率，例如增加患者的总存活期。这些用于评定疾病的成功治疗和改善的参数容易通过具有本领域的具有适当技能的医生所熟悉的常规程序测量。在一些实施例中，“治疗”意味着病况、病症或疾病的症状得到改善或以其它方式有益地变化的任何方式。治疗还涵盖本文组合物的任何药物用途。在一些实施例中，通过施用特定药物组合物“改善”特定病症的症状是指可归因于组合物的施用或与组合物的施用相关的任何减轻，不论是永久性还是暂时性，持续性或短暂性的。

术语“预测”或“预后”常常在本文中用于指患者将对药物或药物组有利地或不有利地作出反应的可能性或疾病的可能结果。在一个实施例中，所述预测涉及那些反应或结果的程度。在一个实施例中，所述预测涉及患者是否将在治疗(例如用特定治疗剂治疗)之后存活或改善且持续某一时间段而无疾病复发和/或其概率。本发明的预测方法可以在临床上用于通过选择对于任何特定患者来说最适当的治疗模式来作出治疗决策。本发明的预测方法为有价值的工具以预测患者是否有可能对治疗方案(例如给定治疗性方案)有利地作出反应，所述治疗方案包括例如施用给定治疗剂或组合、手术干预、类固醇治疗等。

如本文所用，表述“药学上可接受的载体”旨在包括与药学施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等张剂和吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途在本领域中是众所周知的。参见例如Remington,《药学科学与实践第20版(The Scienceand Practice of Pharmacy,20^th ed.)》(Lippincott,Williams&Wilkins 2003)。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑组合物中的此类用途。

“药学上可接受的盐”旨指本文展现的化合物的游离酸或碱的盐，其无毒、生物上可耐受或以其它方式在生物上适合于向受试者施用。一般来说，参见Berge等人,《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)》,1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是药理学有效并且适合于与受试者的组织接触但没有过度毒性、刺激或过敏反应的那些。本文所描述的恩扎妥林和布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂可具有足够酸性基团、足够碱性基团、两种类型的官能团或多于每种类型中的一者，且因此与许多无机或有机碱以及无机和有机酸反应，以形成药学上可接受的盐。

在一些实施例中，术语“药学上可接受的盐”意指对于向患者例如哺乳动物(例如人类)施用来说可接受的盐(对于给定剂量方案具有可接受哺乳动物安全性的平衡离子的盐)。此类盐可以衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱，以及衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。在一些实施例中，“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域中众所周知的多种有机和无机抗衡离子并且仅作为实例包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当所述分子含有碱性官能团时，是指有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、顺丁烯二酸盐、乙二酸盐等。

药学上可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐以及扁桃酸盐。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当向细胞、组织或受试者单独或与额外治疗剂组合施用时可有效地预防或改善受试者中的疾病或病症(即增殖疾病或病症)的治疗剂的量。治疗有效剂量进一步是指足以引起症状改善，例如相关医学病况的治疗、治愈、预防或改善，或此类病况的治疗率、治愈率、预防率或改善率增加的治疗剂的量。当应用单独施用的个别活性成分时，治疗有效剂量仅指所述成分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合施用、依序施用还是同时施用。在一些实施例中，“有效量的用于治疗特定疾病的化合物”是足以改善与疾病相关的症状或以某一方式减轻与疾病相关的症状的量。此类量可以单一剂量形式施用或可以根据方案施用，由此其可为有效的。所述量可治愈疾病，通常被施用以便改善疾病的症状。可能需要重复施用以实现症状的所需改善。

术语“组合”是指呈一个单位剂型的固定组合，或用于组合施用的部分的试剂盒，其中恩扎妥林和布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂(例如下文所解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“助剂”)可以在时间间隔内同时或单独地独立施用，尤其在这些时间间隔允许所述组合搭配物显示协作例如协同作用的情况下。如本文所用的术语“共施用”或“组合施用”等旨在涵盖向有需要的单个受试者(例如患者)施用所选组合搭配物，并且旨在包括其中所述试剂并非必须通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合”意指由混合或组合超过一种活性成分所产生并且包括活性成分的固定和非固定组合的产物。在一些实施例中，术语“固定组合”意指恩扎妥林和布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂都以单一实体或剂量的形式同时向患者施用。在一些实施例中，术语“非固定组合”意指恩扎妥林和布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂都以单独实体在没有特定时间限制的情况下同时、并行或依序向患者施用，其中此类施用在患者体内提供治疗有效水平的两种物质。后者(非固定组合)还应用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种活性成分。

术语“水平(level/levels)”用于指目标(例如，作为疾病或病症的病因的一部分的物质或生物体)的存在和/或量，并且可以定性地或定量地测定。目标水平的“定性”变化是指从正常对照获得的样品中无法检测到或存在的目标的出现或消失。一个或多个目标的水平的“定量”变化是指，当与健康对照相比时，目标水平的可测水平的增加或减小。

“健康对照”或“正常对照”是取自不患有疾病或病症(例如增殖疾病或病症)的个体的生物样品。“阴性对照”是缺乏分析经设计以检测任何特定分析物的样品且因此为所述分析提供参考基线。

如本文所用，“哺乳动物”是指哺乳动物物种类别中的任一种。如本文所用的术语“哺乳动物”常常是指人类、人类受试者或人类患者。“哺乳动物”还指非人类哺乳动物物种类别中的任一种，例如实验、伴侣或经济非人类哺乳动物。示例性非人类哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔、猫、犬、猪、牛、绵羊、山羊、马、猴、大猩猩和黑猩猩。

如本文所用，术语“受试者”不限于特定物种或样品类型。例如，术语“受试者”可指患者，且通常是人类患者。然而，这一术语不限于人类，且因此涵盖多种非人类动物或哺乳动物物种。

如本文所用，“前药”是在体内施用后代谢或以其它方式转换成物质的生物、药学或治疗活性形式的物质。为了产生前药，修饰药学活性物质以使得活性物质将通过代谢过程再生。前药可以经设计以改变药物的代谢稳定性或转运特征，掩饰副作用或毒性，改善药物的味道或改变药物的其它特征或特性。借助于体内药效动力学过程和药物代谢的知识，本领域技术人员可以在已知药学活性化合物后设计出所述化合物的前药(参见例如Nogrady(1985)《医药化学：生物化学方法(Medicinal Chemistry A Biochemical Approach)》,牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约,第388-392页)。

如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，那么在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可被非核苷酸组分间断。可以在聚合后例如通过与标记组分缀合而进一步修饰多核苷酸。其它类型的修饰包括例如“加帽(cap)”，一个或多个天然存在的核苷酸经类似物的取代，核苷酸间修饰例如具有不带电键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、含有侧接部分例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰、含有烷基化剂的修饰、具有经修饰键(例如α异头核酸等)的修饰，以及多核苷酸的未经修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基基团可例如被膦酸酯基、磷酸酯基置换，被标准保护基保护，或经活化以制备与额外核苷酸的额外键联，或可与固体支撑物缀合。5'和3'端OH可经具有1至20个碳原子的胺或有机封端部分磷酸化或取代。其它羟基也可以衍生成标准保护基。多核苷酸还可以含有本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-2'-O-烯丙基、2'-氟基-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、哌喃醣、呋喃糖、景天庚糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括但不限于磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR 2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH 2(“甲缩醛”)置换的实例，其中各个R或R'独立地是H或被取代或未被取代的烷基(1-20个C)，其任选地含有醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基。多核苷酸中所有的键不需要都一致。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文所用，“寡核苷酸”一般是指短的、一般是单链、一般是长度常见但不一定小于约200个核苷酸的合成多核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不相互排斥。上文关于多核苷酸的描述同等且完全适用于寡核苷酸。

如本文所用，术语“同源物”用于指通过对天然存在的核酸进行微小修饰而不同于天然存在的核酸(例如“原型”或“野生型”核酸)、但维持天然存在形式的基本核苷酸结构的核酸。此类变化包括但不限于：一个或几个核苷酸的变化，包括缺失(例如，核酸的截短型)、插入和/或取代。与天然存在的核酸相比，同源物可以具有增强的、降低的或基本上类似的特性。同源物可以与天然存在的核酸互补或匹配。可以使用本领域中已知的用于产生核酸的技术而产生同源物，所述技术包括但不限于重组DNA技术、化学合成等。

如本文所用，“基本上互补或基本上匹配”意指两个核酸序列具有至少90％序列一致性。优选地，两个核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。可替代地，“基本上互补或基本上匹配”意指两个核酸序列可在高严格度条件下杂交。

一般来说，杂交体的稳定性是离子浓度和温度的函数。通常，在严格度较低的条件下进行杂交反应，随后进行严格度不同但较高的洗涤。中等严格杂交是指允许核酸分子例如探针与互补核酸分子结合的条件。杂交的核酸分子一般具有至少60％一致性，包括例如70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性中的至少任一者。中等严格条件是相当于以下的条件：在42℃下在50％甲酰胺、5×邓哈特溶液(Denhardt's solution)、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，随后在42℃下在0.2×SSPE、0.2％SDS中洗涤。可以例如通过以下提供高严格度条件：在42℃下在50％甲酰胺、5×邓哈特溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，随后在65℃下在0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤。低严格度杂交是指相当于以下的条件：在22℃下在10％甲酰胺、5×邓哈特溶液、6×SSPE、0.2％SDS中杂交，随后在37℃下在1×SSPE、0.2％SDS中洗涤。邓哈特溶液含有1％聚蔗糖(Ficoll)、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二酰胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其它合适的中等严格度和高严格度杂交缓冲液和条件是本领域的技术人员众所周知的。

如本文所用，“载体(或质粒)”是指用于将异源DNA引入到细胞中以表达或复制该异源DNA的离散元件。此类媒剂的选择和使用在技术人员的技术范围内是众所周知的。表达载体包括能够表达与调节序列(例如启动子区)可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列能够实现此类DNA片段的表达。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构筑体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它在引入到适当宿主细胞中之后产生克隆DNA的表达的载体。适当表达载体为本领域技术人员众所周知的，并且包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些载体和保持游离的那些载体或整合到宿主细胞基因组中的那些载体。

如本文所用，“启动子区或启动子元件”是指控制与其可操作地连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA片段。启动子区包括对于RNA聚合酶识别、结合和转录起始来说是足够的特定序列。启动子区的这一部分被称为启动子。另外，启动子区包括调节RNA聚合酶的这一识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用的或可以响应于反式作用因子。取决于调节的性质，启动子可以是组成型或调节型的。预期用于原核生物的示例性启动子包括噬菌体T7和T3启动子等。

如本文所用，“可操作地连接”(operatively linked)或“操作地连接(operationally associated)”是指DNA与核苷酸的调节和效应序列(例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点)以及其它信号序列的功能关系。例如，DNA与启动子的操作性连接是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得此类DNA的转录通过RNA聚合酶从启动子起始，所述RNA聚合酶特异性地识别、结合DNA并且转录DNA。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5'未翻译部分，以消除可能干扰或降低表达(在转录或翻译水平)的另外潜在的不适宜的替代性翻译起始(即启动)密码子或其它序列。可替代地，共有位点(consensus site)可以紧接在起始密码子的5'插入并且可以增强表达。参见例如Kozak(1991)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》266:19867-19870。可凭经验确定此类修饰的合意性(或必要)。

如本文所用，“生物样品”是指从活体或病毒源或其它大分子和生物分子源获得的任何样品，并且包括可以从其中获得核酸或蛋白质或其它大分子的受试者的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物源获得的样品或经加工的样品。例如，经扩增的分离的核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于来自动物和植物的体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品以及从中衍生的经加工样品。

如本文所用，“通过重组手段产生”是指使用重组核酸方法的生产方法，所述重组核酸方法依赖于众所周知的分子生物学方法以表达由克隆的核酸编码的多肽或蛋白质。

应理解，本文所描述的本发明的各方面和实施方式包括了“由…组成”和/或“主要由…组成”的各方面和实施方式。

在整个本公开中，本发明的各个方面都以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅出于方便和简洁的目的，并且不应被解释为对本发明范围的固定限制。因此，对范围的描述应被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及在所述范围内的个别数值。举例说明，例如1至6的范围的描述应被视为已经具体地公开了子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及所述范围内的个别数值，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的广度例如何，这都适用。

根据以下内容并结合附图的说明本发明的其它目的、优点和特征将而变得显而易见。

示例性实施方式

在一些实例中，本发明通过以下所列举的实施方式进行说明：

1.一种组合物，其包含恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。在这些实施方式中的一些中，恩扎妥林以其盐酸盐形式存在。

2.根据实施方式1所述的组合物，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐。

3.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼，和其药学上可接受的盐，并且优选地是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

4.根据实施方式1至3中任一实施方式所述的组合物，其进一步包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。任选地，所述组合物包含两种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。

5.一种治疗性组合，其包含恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。

6.根据实施方式5所述的治疗性组合，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐。

7.根据实施方式5或6所述的治疗性组合，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼或其药学上可接受的盐；并且优选地，所述BTK抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

8.根据实施方式5至7中任一实施方式所述的治疗性组合，其中恩扎妥林和所述BTK抑制剂经制备以用于同时施用。

9.根据实施方式5至7中任一实施方式所述的治疗性组合，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂经制备以用于单独施用。

10.一种体内治疗性组合，其包含在受试者的血液或血浆中的恩扎妥林和BTK抑制剂。

11.一种治疗选自肿瘤病况、免疫病症、胃肠道病症、CNS病症、皮肤病症、血液病症和代谢病症的病症或疾病的方法，其中所述方法包含向需要此类治疗的受试者施用恩扎妥林和BTK抑制剂。在这些方法中，所述受试者通常为人类并且任选地为诊断患有淋巴瘤的人类。在这些实施方式中的一些中，恩扎妥林以其盐酸盐形式使用。在一些实施方式中，施用有效量的恩扎妥林和/或BTK抑制剂。在优选实施方式中，施用协同量的恩扎妥林和BTK抑制剂，即恩扎妥林和BTK抑制剂的量足以提供协同作用。

12.根据实施方式11所述的方法，其为用于治疗癌症的方法，所述癌症选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、复发性CLL、难治性CLL、滤泡性淋巴瘤、腺癌、转移性腺癌(例如胰腺癌)、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、转移性乳腺癌、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、难治性多发性骨髓瘤、复发性多发性骨髓瘤、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤(B细胞霍奇金淋巴瘤)、转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、原发性CNS淋巴瘤、肾细胞癌、继发性CNS淋巴瘤、移行细胞癌、尿路上皮细胞癌、结边缘B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、上皮卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、(反复性)头颈癌、鳞状细胞癌、(反复性)多形性胶质母细胞瘤(GBM)和B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤。

13.根据实施方式12所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，或其药学上可接受的盐。在一些此类实施方式中，BTK抑制剂为依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

14.一种用于治疗或预防淋巴瘤或降低已经针对淋巴瘤进行治疗的受试者的癌转移或复发的风险的方法，其中所述方法包含向有需要的受试者施用恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。

15.根据实施方式14所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐。

16.根据实施方式15所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

17.根据实施方式14、15或16所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼，或其药学上可接受的盐。

18.根据实施方式11至17中任一实施方式所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂一起施用。在这些实施方式中，恩扎妥林或其药学上可接受的盐任选地与BTK抑制剂共配制以作为单一药物组合物。在这些实施方式中的另一实施方式中，恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂呈单独的药物组合物形式，但在约相同时间下施用，即其单独地但在大约几分钟内或约一小时内服用，而非间隔超过一小时服用。

19.根据实施方式11至17中任一实施方式所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂单独施用。在这些实施方式中，恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂呈单独的药物组合物形式，且可在约相同时间下施用，即其可单独地但在大约几分钟内服用，或其可在不同时间下施用，例如在时间上间隔一个小时或更久，或由于介入膳食或其它事件而间隔，但二者均在24小时时段内或48小时时段内施用。

20.根据实施方式19所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂按使得二者一起存在于经治疗受试者的血液或血浆中的时间安排进行施用。在这些实施方式中，恩扎妥林和所述BTK抑制剂在时间上足够接近地施用，以使得二者以可测量水平存在于治疗的受试者的血液或血浆中，对于两种单独药剂中的各者来说，所述可测量水平通常为Cmax的至少5％和通常至少10％的水平。

21.根据实施方式11至20中任一实施方式所述的方法，其中淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

22.根据实施方式21所述的方法，其中淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。

23.根据实施方式22所述的方法，其中所述淋巴瘤是选自伯基特氏淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、小淋巴细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。在这一实施方式的优选版本中，所述淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

24.根据实施方式11至23中任一实施方式所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐经口服施用。在这些实施方式中的一些中，恩扎妥林以其盐酸盐形式施用。在这些实施方式中的一些中，向所述受试者施用的恩扎妥林或恩扎妥林盐酸盐的量为500mg/天，或小于500mg/天。

25.根据实施方式24所述的方法，其中所述BTK抑制剂经口服施用。

26.根据实施方式11至25中任一实施方式所述的方法，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。在这些实施方式中的一些中，所述BTK抑制剂的剂量为400mg/天，或小于400mg/天。在一些实施方式中，恩扎妥林与BTK抑制剂按重量计的比率(特别地，在所述BTK抑制剂为依鲁替尼的情况下)为1:1或更大，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1或8:1。

27.根据实施方式11至26中任一实施方式所述的方法，其中所述受试者是基于生物标记物的表达或存在而选择的。

28.根据实施方式26所述的方法，其中所述生物标记物是DGM1。

在通篇中提及的恩扎妥林或依鲁替尼旨在包括中性化合物或每种化合物的药学上可接受的盐。特别地，恩扎妥林可经制备、配制或以中性分子或其盐酸盐进行使用。依鲁替尼可经制备、配制或以任何合适的酸加成产物进行使用，包括国际申请第PCT/EP2016/056312号和第PCT/EP2015/069430号中所公开的盐和固体形式。优选地，依鲁替尼用作中性化合物。本文中所公开的重量和剂量是指中性化合物，例如当指500mg恩扎妥林或其药学上可接受的盐的量时，出于一致性，所述重量意图描述将使用的中性恩扎妥林的重量，而不管使用何种盐(如果存在)。除非另外指示，否则恩扎妥林或BTK抑制剂的重量包括指定数量的±10％范围。

本文所描述的化合物和组合物可向需要治疗细胞增殖病症(例如癌症，尤其是对用BTK抑制剂进行治疗作出反应的癌症)或治疗本文所公开的其它病征的受试者施用。

在一些实施方式中，病症为选自以下的癌症：白血病、淋巴瘤、肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌和胰腺癌。受试者通常为被诊断为需要治疗此类增生性病症中的一种或多种的哺乳动物，并且受试者常常为人类。所述方法包含施用有效量的所述组合中的至少一种化合物，即恩扎妥林或BTK抑制剂，和施用也可为有效量的其它化合物的量。在一些实施方式中，两种组分以提供协同活性的量或比例或比率施用，因此所施用的组合为有效量，即使在以所述量来单独施用个别药剂时，将不会预期其会提供治疗效果；因此在组合的情形下，“有效性”包括协同作用。任选地，治疗性组合或药物组合物可与一种或多种额外治疗剂组合施用，尤其是已知适用于治疗折磨特定受试者的癌症或增生性病症的治疗剂，和/或PD-1或PD-L1拮抗剂。

除本发明的组合之外或其使用之前，可以用其他的适应于待治疗的特定病况的治疗剂来治疗受试者。通常，与利妥昔单抗和/或阿霉素与其它批准通过的治疗剂进行组合来治疗患有淋巴瘤的受试者。可以与恩扎妥林加BTK抑制剂(例如依鲁替尼)组合或在用恩扎妥林加BTK抑制剂(例如依鲁替尼)治疗之前使用的常规化疗组合包括CHOP和R-CHOP。CHOP为包括环磷酰胺、羟基道诺霉素(阿霉素盐酸盐)、安可平(长春新碱硫酸盐)和泼尼松的治疗方案的首字母缩写。R-CHOP是用于治疗非霍奇金淋巴瘤和套细胞淋巴瘤的化疗组合的缩写且正被研究用于治疗其它类型的癌症。所述R-CHOP包括药物利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素盐酸盐(羟基道诺霉素)、长春新碱硫酸盐(安可平)和泼尼松。

在一些实施方式中，本发明提供一种在受试者已经通过针对淋巴瘤(例如DLBCL)的任何合适方法进行治疗之后保护受试者免于癌转移或复发的方法，其中所述方法包含向有需要此类保护的受试者施用恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)。

在前述方法中的每一种中，所述方法可以用于治疗患有淋巴瘤(例如DLBCL)的受试者，并且在一些方法中，受试者是已经通过至少一种其它方法(例如CHOP、R-CHOP等)进行治疗并且仍经历进展的受试者。在其它实施方式中，受试者是已通过这些方法进行治疗并且实现至少部分反应的受试者，在此情况下，可以用恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)治疗受试者以保护所述受试者免于复发或癌转移。此外，在一些实施方式中，受试者是基于生物标记物反应而选择的，例如当基于生物标记物的表达或存在选择了受试者时，可认为该受试者适合于用本文所公开的组合物和治疗性组合治疗。

药物组合物、组合和其它相关用途

在再另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含如本文所描述的恩扎妥林与BTK抑制剂的组合，与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂混合。任选地，药物组合物包含至少两种药学上可接受的载体或赋形剂。用于这些化合物的药物组合物中的合适赋形剂和载体是本领域中已知的。

上文所描述的组合和组合物可出于任何合适的目的使用。例如，其可用于疗法和/或测试。通常，其用于治疗对治疗B细胞病症，尤其是B细胞癌症(例如淋巴瘤)有需要的受试者。

在又另一方面，本公开提供一种如上文所描述的组合在制备药剂中的用途。

在一个方面，本发明提供一种适用于疗法的恩扎妥林与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的组合。

在一些实施方式中，所述组合用于治疗一种类型的淋巴瘤(例如DLBCL)的疗法。

在又另一方面，本公开提供一种用于抑制细胞、器官或组织中的BTK活性的方法，其包含使所述细胞、器官或组织与恩扎妥林和BTK抑制剂(优选地依鲁替尼)的组合接触。

配制物

可以使用本文所描述的化合物的任何合适配制物。可参见《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,(2000)Hoover,J.E.编辑,第20版,利平科特威廉斯及威尔金斯出版公司(Lippincott Williams and Wilkins Publishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.),第780-857页。选择适合于适当施用途径的配制物。恩扎妥林的可行的配制物是已知的且可作为用于设计新配制物(例如与BTK抑制剂的组合)的信息使用。类似地，一些BTK抑制剂(包括依鲁替尼)的安全且有效的配制物是已知的，且可按需要用于本发明中或按需要进行改性，例如用于还含有恩扎妥林的药物组合物中。

在化合物足够碱性或酸性以形成稳定无毒酸盐或碱盐的情况下，以盐形式施用化合物可以是适当的。药学上可接受的盐的实例是与形成生理学上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸根、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、丁二酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。还可形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。药学上可接受的盐是使用本领域中众所周知的标准程序获得的，例如通过足够碱性的化合物(例如胺)与合适的酸，从而提供生理学上可接受的阴离子。还制成碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)羧酸盐。在恩扎妥林的情况下，已知的盐酸盐可以用于本文所公开的组合物、组合和方法中。

在所涵盖的化合物以药理学组合物施用的情况下，预期化合物可以与药学上可接受的赋形剂和/或载体混合配制。例如，所涵盖的化合物可作为中性化合物或作为药学上可接受的盐经口服施用或以生理盐水溶液形式经静脉内施用。常规缓冲剂例如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐等可出于此目的使用。当然，本领域的普通技术人员可在本说明书的教导下改进配制物，以提供用于特定施用途径的大量配制物。特别地，可以使所涵盖的化合物改性，以使其更可溶于水或其它媒剂中，例如，这可以通过完全在本领域普通技术范围内的较小修改(盐配制物、酯化等)而容易地实现。为了患者中的最大有益作用修改特定化合物的施用途径和给药方案以便管理本发明化合物的药代动力学也完全在本领域普通技术范围内。

本文所描述的化合物一般可溶于有机溶剂中，所述有机溶剂例如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜等。在一个实施方式中，本发明提供通过将恩扎妥林与BTK抑制剂的组合与药学上可接受的载体混合而制备的配制物。在一个方面，可以使用包含以下的方法制备配制物：a)将所选化合物溶解于水溶性有机溶剂、非离子溶剂、水溶性脂质、环糊精、维生素(例如生育酚)、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂，或其组合中以提供溶液；以及b)添加生理盐水或含有1-10％碳水化合物溶液的缓冲剂。在一个实例中，碳水化合物包含右旋糖。使用本发明方法获得的药物组合物是稳定的且适用于动物和临床应用。

用于本发明方法的水溶性有机溶剂的说明性实例包括并且不限于聚乙二醇(PEG)、醇、乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或其组合。醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、甘油或丙二醇。

用于本发明方法的水溶性非离子表面活性剂的说明性实例包括并且不限于

EL、聚乙二醇改性的

(聚氧乙烯甘油三蓖麻酸酯(polyoxyethyleneglyceroltriricinoleat)35)、氢化

RH40、氢化

RH60、PEG-丁二酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、

HS(聚乙二醇660 12-羟基硬脂酸酯)、脱水山梨醇单油酸酯、泊洛沙姆、

(乙氧基化杏仁油)、

(辛酰基-己酰基聚乙二醇-8-甘油酯)、

(甘油酯)、

(PEG 6辛酸甘油酯)、丙三醇、乙二醇-聚山梨醇酯，或其组合。

用于本发明方法的水溶性脂质的说明性实例包括但不限于植物油、甘油三酯、植物油或其组合。脂质油的实例包括但不限于蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyl castoroil)、玉米油、橄榄油、棉籽油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化植物油、氢化大豆油、椰子油甘油三酯、棕榈籽油和其氢化形式或其组合。

用于本发明方法的脂肪酸和脂肪酸酯的说明性实例包括但不限于油酸、甘油单酯、甘油二酯、PEG的单或二脂肪酸酯或其组合。

用于本发明方法的环糊精的说明性实例包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精或磺丁基醚-β-环糊精。

用于本发明方法的磷脂的说明性实例包括但不限于大豆磷脂酰胆碱、或二硬脂酰基磷脂酰甘油和其氢化形式或其组合。

在一些实施方式中，恩扎妥林和所选BTK抑制剂(例如依鲁替尼)以单一药物组合物形式组合，通常与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂组合。用于单独化合物中的每一者的合适载体和赋形剂为本领域中已知的，且用于组合的载体和赋形剂可选自已知适合于单独配制物的那些载体和赋形剂。在这些实施方式中，可以基于本领域中已知的信息选择药物组合物中的恩扎妥林与BTK抑制剂的比例，并且取决于BTK抑制剂，所述比例通常在约5:1至约1:2范围内。可类似地基于本文中的数据以及例如单独活性成分的临床试验的信息来确定单位剂量大小。本文中的信息可提供进一步的引导，因为其表明了针对组合的预期的协同作用。

在一些实施方式中，恩扎妥林和BTK抑制剂单独地配制。用于这些化合物中的每一者的合适配制物在本领域中是已知的。

优选地，制备本发明的药物组合物和组合以用于口服施用，如丸剂、口含锭、糖衣锭、胶囊剂或类似固体剂型形式。组分可组合成单一组合物，但在一些实施方式中，其制备为单独单位剂量而非组合成单一组合物或单位剂量。这提供了在优化针对特定患者的组合方面的最大灵活性，因此可针对所治疗的特定受试者最佳地优化每一组分的施用频率、时间安排和剂量。恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼)的固体剂型为本领域中已知的：在本发明的一些实施方式中，向受试者施用已知的固体剂型，且使用对于所施用的个别治疗剂的指导(guidline)来确定剂量。

当经制备用于单独施用时，本发明的治疗性组合的组分可包含于单独剂量单位中，例如恩扎妥林和所选择的BTK抑制剂(例如依鲁替尼)可呈不同丸剂、胶囊剂、糖衣锭、口含锭或悬浮液形式。在组合的两种活性组分未混合的情况下，可以将单独剂量单位包装在一起，例如包装在泡罩包装中以供共施用，并且当两种活性物(例如恩扎妥林和BTK抑制剂，其可以是依鲁替尼)中的任一者或二者呈单独剂量单位时，可以将其与使恩扎妥林组合物与BTK抑制剂组合物一起使用的说明书一起包装，或反之亦然。因此，在一些实施方式中，治疗性组合可以包含药物组合物，所述药物组合物包含恩扎妥林或依鲁替尼(或另一所选择的BTK抑制剂)，其与根据本文方法的使用说明书一起包装，以向需要治疗B细胞淋巴癌(例如淋巴瘤，特别地是DLBCL)的受试者施用恩扎妥林和BTK抑制剂。在一些实施方式中，治疗性组合可以是包含有效量的恩扎妥林和依鲁替尼(无论是配制为单一组合物还是配制为单独的单位剂量)的试剂盒，其具有说明书，以向需要治疗B细胞淋巴癌(例如淋巴瘤，并且确切地说是DLBCL)的受试者施用恩扎妥林和BTK抑制剂。

剂量

在一些实施方式中，个别组分以用作单一药剂治疗剂的正常剂量范围的低端值施用或以更低剂量施用，即其可以以预期可有效作为单一药剂疗法的最低剂量施用或以更低剂量施用。因此，受试者可用含有比预期产生治疗效果的每日剂量更少的活性剂(例如恩扎妥林或依鲁替尼)的每日剂量来治疗。因此，受试者可以用比将施用以引发治疗效果更少的每天的单位剂量来治疗，或活性剂中的一种或两种的单位剂量可以以低于其将在意图引发作为单一药剂的治疗效果时的频率进行施用。如本文所使用的“单位剂量”是指以意图向受试者施用的最小单位所制备的治疗剂或组合的剂量，例如用于注射的单一安瓿或用于口服施用的单一片剂或胶囊剂。应理解，单一剂量可由两个或多个此类单位剂量组成，且每日剂量可全部一次性服用或以多个剂量服用，例如在一天过程中间隔两小时或更久的两次或三次单独施用。

此外，由于将恩扎妥林与BTK抑制剂组合所提供的协同活性，组合的个别组分可以比其在作为单一药剂疗法施用时没那么频繁地施用，以便产生低于针对单一药剂治疗效果为目标的血浆浓度的血浆浓度。在一些实施方式中，组合的两种组分中的至少一种以在单独使用时将不能预期其实现治疗结果的剂量来施用，例如以单一药剂剂量的约90％或小于90％，或以将用于单一药剂疗法的剂量的一半或小于所述剂量的一半来施用。

例如，在美国审批通过了依鲁替尼用于治疗某些B细胞癌症(套细胞淋巴瘤、CLL、小淋巴细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、边缘区淋巴瘤)并且可用作胶囊剂(70mg和140mg)和片剂(140mg、280mg、420mg和560mg)。取决于待治疗的病况，所推荐的剂量为420mg或560mg，每日一次。参见

处方信息。当与恩扎妥林组合使用时，依鲁替尼可以低于400毫克/天的剂量服用：在一些实施方式中，用于本文中的组合物、组合和方法的依鲁替尼的每日剂量可以是70mg、140mg、210mg、280mg或350mg。

恩扎妥林处于与称为R-CHOP的强效化疗方案(其包括利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)组合使用的临床试验中，并且恩扎妥林的起始剂量为每天500mg，即在一些早期癌症试验中使用的相同剂量，在所述早期试验中，恩扎妥林并不提供显著的治疗益处。当与BTK抑制剂组合使用时，对于本发明的组合物、组合和方法来说，可以以500mg、或小于500mg的每日剂量(例如250mg、300mg、350mg、400mg或450mg/天)施用恩扎妥林。

优选地，在本发明范围内的组合的两种组分(恩扎妥林和BTK抑制剂(例如依鲁替尼))以产生协同作用的剂量施用。如体外数据表明，这一组合在整个浓度和比例范围内提供协同作用。例如，如由图2中所汇总的数据所示，当与浓度在0.002μM至8μM范围内的依鲁替尼组合时，2-12μM恩扎妥林的浓度对五个不同DLBCL细胞系产生协同活性。实际上，协同作用指数(CI)在所有所测试的浓度和细胞系中都小于1，所述指数指示了协同作用，并且在所有但除一种情况(6μM恩扎妥林和7μM依鲁替尼组合下的SU-DHL2细胞系，CI＝0.923)下都小于0.8。因此，当这两种治疗剂一起用于治疗DBCLC时，预期有协同作用。此外，将恩扎妥林和依鲁替尼用于治疗体内DBCLC(小鼠异种移植物)时，当恩扎妥林和依鲁替尼每日以100比12的比例口服施用时，观测到协同作用。因此，当恩扎妥林与BTK抑制剂按重量计的比率(特别地，在BTK抑制剂是依鲁替尼的情况下)为1:1或更大，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1或8:1时，预期观测到协同作用。

作为一实例，可以100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、525mg或700mg的每日剂量向待治疗的受试者施用恩扎妥林，且所述剂量可以以单一剂量施用，或其可在一天过程中分成两次、三次或多于三次剂量。在一些实施方式中，恩扎妥林每日施用一次或每日施用两次。依鲁替尼可以以与恩扎妥林剂量相同的每日剂量或与恩扎妥林剂量相比更低的每日剂量施用，并且通常以单次每日剂量施用。

依鲁替尼通常以胶囊剂形式、以100与1000mg/天之间的每日剂量、常常以每天一次的150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、420mg或560mg的单次每日剂量施用，但施用的剂量和频率可通过治疗医生针对特定受试者来优化。此外，如本文所论述，当恩扎妥林与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)组合使用时观测到协同功效，因此其可适合于以比当每一药剂用作单一药剂用于疗法时通常所推荐的剂量更低的剂量施用两种药剂。

在分别施用本发明组合中的两种治疗剂的情况下，可按相同的给药时间安排(大约同时服用单独剂量单位)或不同的给药时间安排施用所述治疗剂，前提是所述治疗剂以使二者同时存在于受试者系统中的方式施用，即每一种都与另一种在同一天施用，通常在12小时或更短时间内、或在4小时或更短时间内，或使所述治疗剂各自与另一者在时间上足够接近地施用以使得两种化合物(恩扎妥林和BTK抑制剂)以其对应的最大血液或血浆水平(Cmax)的至少约10％的水平同时存在。

本领域的普通技术人员可以在本说明书的教导内使配制物改性以提供用于特定施用途径的大量配制物。特别地，所述化合物可以经改性以使得其更可溶于水或其它媒剂中。为了患者中的最大有益作用而修改特定化合物的施用途径和给药方案以便管理本发明化合物的药代动力学也完全在本领域普通技术范围内。

药物组合

所述实施方式的方法包含施用有效量的恩扎妥林和至少一种已知的抑制BTK的化合物；任选地，所述组合可以与一种或多种额外治疗剂、尤其是已知适用于治疗待用本发明组合治疗的淋巴增殖病症的治疗剂组合来施用。

额外活性成分可以以独立于本公开的组合的药物组合物施用，或可以与本发明组合的至少一种化合物一起包括于单一药物组合物中。额外活性成分可与本公开的至少一种示例性化合物同时施用，额外活性成分可在施用本公开的至少一种示例性化合物之前或之后施用。

实施例

提供以下实施例以说明本发明的某些方面且辅助其实践；不将实施例视为本发明的完整范围或对其范围的限制。

实施例1

材料和方法

细胞系和细胞培养

HBL-1、TMD8、OCI-LY7细胞系由内布拉斯加大学医学中心(University ofNebraska Medical Center)(美国内布拉斯加州奥马哈(Omaha,NE,USA)的Fu博士慷慨提供。从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))获得SU-DHL-2和SU-DHL-6细胞。细胞在补充有10-20％胎牛血清(吉毕科(Gibco)，生命技术公司(Life Technology)，美国加利福尼亚州(CA,USA))、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇的RPMI1640培养基(吉毕科，生命技术公司，美国加利福尼亚州)中生长。但不包括OCI-Ly7，其维持于补充有β-巯基乙醇、青霉素/链霉素和20％肝素化人类血浆的伊思考夫改良达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)(吉毕科，生命技术公司，美国加利福尼亚州)中。在37℃下将所有细胞系维持于加湿的5％CO₂培育箱中。所有DLBCL细胞系的鉴别均通过短串联重复DNA指纹识别分析(应用生物系统公司(Applied Biosystems),美国加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA,USA))确认。

药物和试剂

恩扎妥林是来自索元生物医药(Denovo Biopharma)(美国圣地亚哥(San Diego,USA))的馈赠物，并且依鲁替尼购自Medchem Express公司(美国新泽西州(NJ,USA))。其最初溶解于100％二甲亚砜(DMSO，西格玛化学(Sigma Chemical))中，浓度为10mM，并且存储于-80℃下。一级抗体和二级抗体在附加文件1中列出。

细胞增殖的分析

将细胞以3000细胞/100μl的密度接种于96孔培养板中，并且用不同浓度的恩扎妥林和依鲁替尼治疗72小时。计数细胞并且使用Cell Titer-Glo发光细胞活力分析系统(Luminescent Cell viability assay system)(普洛麦格(Promega)，美国威斯康星州麦迪逊(Madison,WI,USA))评估活力。通过LMax II(分子仪器公司(Molecular Devices)，美国加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA,USA))测量发光信号。抑制率根据下式计算：抑制率＝(1-剂量/媒剂)×100％。

凋亡细胞和细胞周期分析

用媒剂或指示浓度的恩扎妥林和依鲁替尼治疗细胞48小时，以用于细胞凋亡和细胞周期分析。对于细胞凋亡分析，根据方案用膜联蛋白V-APC(百进生技(Biolegend)，美国加利福尼亚州(CA,USA))染色细胞。对于细胞周期分析，根据制造商方案用PI染色缓冲液(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))染色细胞。最后，使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD，生物科学(Biosciences)，加利福尼亚州圣何塞(SanJose,CA))分析经标记的细胞。

实时逆转录-PCR(qRT-PCR)分析

使用Trizol试剂(生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))提取总细胞RNA，并且使用TransScript初链cDNA合成超混合液(First-Strand cDNA SynthesisSuperMix)(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)，中国北京(Beijing,China))合成cDNA。使用Go Taq qPCR预混液(Master Mix)(普洛麦格公司(Promega Corporation)，美国麦迪逊(Madison,USA))进行qRT-PCR分析。NOTCH1的特异性引物(正向：5'-TCCACCAGTTTGAATGGTCAAT-3'(SEQ ID NO:1)；反向：5'-CGCAGAGGGTTGTATTGGTTC-3'(SEQID NO:2))和GAPDH的特异性引物(正向：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'(SEQ ID NO:3)；反向：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'(SEQ ID NO:4))用于进行qRT-PCR。所有反应均在AppliedBiosystems 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，美国马萨诸塞州沃本(Woburn,MA,USA))中进行，使用以下等式计算mRNA表达数据：RQ＝2-ΔΔCt。

蛋白质印迹法和信号传导分析

使所收获的经培养细胞溶解于具有蛋白酶/磷酸酶抑制剂(罗氏(Roche)，德国曼海姆(Mannheim,Germany))的RIPA缓冲液(赛信通技术公司(Cell SignalingTechnology)，马萨诸塞州丹佛斯(Danvers,MA))中。如先前所描述，通过蛋白质印迹来检测信号传导蛋白质[25]。根据制造商说明书，使用化学发光检测系统(阿尔法创新科技公司(Alpha Innotech)，美国加利福尼亚州圣莱安德罗(San Leandro,CA,USA))可视化免疫阳性带。

侵袭和迁移分析

在不含FBS的RPMI1640中用媒剂或指示浓度的恩扎妥林和依鲁替尼处理细胞，持续指示时间。对于细胞侵袭分析，将细胞置于具有8.0μM孔的传斯维尔(transwell)培养板中的基质胶(Matrigel)基底膜基质涂布的上腔(康宁科斯塔(Corning Costar)，美国纽约州(NY，USA))中。对于细胞迁移分析，将细胞接种到具有8.0μM孔聚碳酸酯膜插入件的传斯维尔培养板(transwell plate，康宁科斯塔，美国纽约州)中。腔室的下部含有30％FBS以用作化学引诱剂。在24小时(48小时)之后，使用Cell Titer-Glo分析对迁移(侵袭)到下部腔室中的细胞数目计数。侵袭和迁移能力由下部腔室中的存活细胞的数目确定。

基因表达谱和京都基因与基因组百科全书(KEGG)路径富集分析

所指示的药物以单独地或以组合的方式处理HBL-1细胞24小时，并且随后分离总RNA。使用TransScript初链cDNA合成超混合液将总RNA(3μg)转化为cDNA。RNA定量和定性、库制备、集群和测序、读段映射和数据处理都在诺禾致源生命科学公司(NovogeneBioscience)(中国北京(Beijing,China))中进行。使用DESeq2 R包(1.16.1)进行两组(每个条件两个生物复本)的差异表达分析。将0.05的经校正p值和2的绝对差异倍数(absolutefoldchange)设置为显著差异表达的阈值。为了分析在每次治疗之后差异表达的基因集合的基础机制，我们使用clusterProfiler R包来测试京都基因与基因组百科全书(KEGG)路径中差异表达基因的统计富集。

慢病毒包装和感染

含有绿色荧光蛋白(GFP)(shControl)或NOTCH1特异性短发夹RNA(shNOTCH1，序列#1：5′-TGCCAACATCCAGGACAACAT-3′(SEQ ID NO:5))的慢病毒载体(GV493)由吉凯基因(Genechem)(中国上海(Shanghai,China))构筑、包装和纯化。用shControl、shNOTCH1(MOI1:100)感染细胞并且培养>72小时，以用于下游实验。通过蛋白质印迹分析评估耗尽效率。

体内治疗功效的检测

所有动物实验都按照实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)并且根据冠科生物(CrownBio)(中国北京)的伦理指导方针进行。从HFK生物科学有限公司(HFK Bioscience Co.Ltd.)(中国北京)获得雌性免疫缺陷型NPG小鼠(NOD-Prkdc^scid Il2rg^null)，六至八周龄。将具有基质胶的无血清培养基(1:1比率)中的HBL-1肿瘤细胞(2.5×10⁶)经皮下注射到每个小鼠的右侧腹下的区域中。当肿瘤达到100-150mm³时，将小鼠随机分成四组(对照组，用恩扎妥林治疗的组，用依鲁替尼治疗的组，用恩扎妥林和依鲁替尼二者治疗的组)。每天两次口服施用恩扎妥林(50mg/kg，溶解于10％阿拉伯胶)，和/或每天一次口服施用依鲁替尼(12mg/kg，溶解于1％甲基纤维素、0.4％

EL中)，持续21天。每周监测肿瘤体积(V)和体重两次至三次。肿瘤体积(V)以V＝(长度×宽度²)/2来计算。在最后一次给药之后4小时从所有组收集肿瘤组织样品。

统计分析

所有体外实验独立地进行至少三次。所有值表示为平均值±SEM。SPSS 22.0统计软件(IBM，美国纽约州纽约(New York,NY,USA))用于所有分析。使用配对或非配对t-检验比较(Student's t test comparisons)或单因素ANOVA分析数据。P值<0.05被公认为在统计学上有显著意义。根据周-特氏方法(Chou-Talalay method)使用CalcuSyn软件(第2版，Biosoft，英国剑桥(Cambridge,UK))确定药物组合的组合指数(CI)[26]。CI值<1，＝1，和>1分别指示协同作用、相加作用和拮抗作用。

结果

恩扎妥林以剂量依赖性方式抑制ABC和GCB细胞系的增殖并上调BTK的磷酸化

为了确定恩扎妥林对DLBCL细胞系存活的影响，我们在恩扎妥林(0至20.0μM)存在下培养9个细胞系72小时。将细胞系用单独的DMSO(载体)或含恩扎妥林的DMSO中培养。通过Cell Titer-Glo发光细胞活力分析来测量细胞活力。每一细胞系一式三份分析，且图1a示出三次重复分析的平均值和标准差。如图1a中所示，用恩扎妥林处理引起细胞增殖的剂量依赖性抑制，其中50％抑制浓度(IC50)在6.7到16μM之间(图1a)。这些结果表明，恩扎妥林在ABC和GCB类型的DLBCL细胞系中触发细胞毒性。

PKCβ是BTK的常见下游靶点。出人意料地，我们观测到，HBL-1和TMD8细胞在用恩扎妥林处理后展现出p-BTK的显著上调(图1b示出用含恩扎妥林的DMSO或单独媒剂处理2小时后每一细胞系中p-BTK水平的蛋白质印迹分析)。因此，抑制PKCβ对DLBCL细胞有治疗效果，但引起BCR信号传导的正调节。恩扎妥林的药理抑制仅阻断BCR信号传导的一些分支，并且路径的失活可以通过其它路径补偿。图1c示出BCR路径，其中补偿性路径可限制恩扎妥林(尤其作为单一疗法)在DLBCL中的有效性。

DLBCL细胞的抑制率与分子亚型或对依鲁替尼的反应性无关。

为了评估恩扎妥林和依鲁替尼的协同作用，在多种浓度下在五个细胞系(HBL-1、TMD8、SU-DHL-2、SU-DHL-6和OCL-LY7)中测量单独的恩扎妥林、单独的依鲁替尼或这二者的组合对细胞生长的抑制作用：恩扎妥林以2-12μM浓度进行测试，依鲁替尼以0.002至10μM浓度进行测试，如图2a所示，持续72小时。Cell Titer-Glo发光分析用于检测抑制率。根据数据，使用CalcuSSyn软件计算组合指数(CI)值(图2b)。CI值小于1.0指示协同作用。组合治疗在所有测试剂量下均显示对HBL-1、TMD8、SU-DHL-6和OCL-LY7细胞系生长的强力协同抑制作用，其中CI值在0.239至0.686范围内。SU-DHL2中的协同作用在较低依鲁替尼浓度下是弱的(CI＝0.92)，但在10μM依鲁替尼下是显著的。恩扎妥林与依鲁替尼的组合在几乎所有所检验的剂量组合下在GCB和ABC DLBCL细胞系中展现出协同作用(CI<1，图2b)。

细胞死亡的时间过程分析进一步证实，暴露于组合处理的时间越长，对细胞增殖的抑制越显著(图2c)。对于此实验，在如图2c所指示的恩扎妥林(ENZ)、依鲁替尼(IB)或二者一起(组合)的浓度下，用恩扎妥林和依鲁替尼处理细胞24、48和72小时，并且通过CellTiter-Glo发光分析来监测细胞活力。抑制率以(1-处理/媒剂)×100％来计算。数据呈现为一式三份观测结果的平均值，加上或减去标准差。综上所述，恩扎妥林和依鲁替尼的组合显示了对DLBCL细胞的存活和增殖的长期协同作用，这与其亚型无关。

恩扎妥林和依鲁替尼的组合促进DLBCL细胞的凋亡并诱导其G1期停滞

为了确定用恩扎妥林和依鲁替尼进行的共处理对细胞生长的抑制是否与细胞凋亡和/或细胞周期停滞相关，在暴露于指示浓度的恩扎妥林和/或依鲁替尼48小时后，在四个细胞系中监测细胞凋亡——参见图3a。细胞用膜联蛋白V染色，并且通过流式细胞测量术评估细胞凋亡。将细胞凋亡评估为APC+细胞。在HBL-1中，如通过膜联蛋白V染色所测量，恩扎妥林与两种不同剂量的依鲁替尼的组合诱导43.8±8.7％或51.4±5.9％的细胞凋亡，超过单独使用的每个单一药剂(恩扎妥林＝25.5±5.4％，依鲁替尼＝15.9±6.0％和19.0±6.7％，图3a)。这些结果表明，用恩扎妥林和依鲁替尼进行的共处理对促进细胞凋亡产生协同作用。

与流式细胞测量术结果一致，HBL-1细胞中与细胞凋亡相关的蛋白质相应地改变(图3b)。在此实验中，细胞按指示暴露于恩扎妥林和/或依鲁替尼(参见图3c)，持续48小时，接着提取蛋白质，并确定与细胞凋亡相关的蛋白质(PARP、XIAP、MCL-1、胱天蛋白酶-3、Bcl-2、β-肌动蛋白)的水平。更具体地说，恩扎妥林和依鲁替尼能够稍微增加PARP和胱天蛋白酶-3的裂解，但当将恩扎妥林和依鲁替尼一起应用时，这一作用显著增强(图3b)。组合治疗还诱导数种抗细胞凋亡Bcl-2家族成员(包括Mcl-1、XIAP和Bcl-2)的表达的急剧衰减。在TMD8、SU-DHL-6和OCL-LY7细胞中也观测到类似作用(图3b)。总之，以上结果证明，恩扎妥林和依鲁替尼的组合使用通过胱天蛋白酶依赖性和线粒体路径导致DLBCL细胞凋亡增加，其最终诱导DLBCL细胞的细胞毒性。

细胞周期直方图进一步表明药物组合对细胞周期的影响(图3c)。对于这一研究，细胞按指示用依鲁替尼和/或恩扎妥林处理48小时，接着细胞用碘化丙锭(PI)染色。使用流式细胞测量术评估细胞周期。G1期的HBL-1细胞从对照组中的28.5±0.05％增加至组合处理组中的46.4±0.84％和47.2±3.12％，这与S期细胞的减少相关。对于TMD8、SU-DHL-6和OCL-LY7细胞，也获得了类似结果(图3c)。所述图表示三次重复的平均值，且误差条显示标准差。当与对照组相比时，统计学上有显著意义的结果由条上方的*(p<0.05)、**(p<0.01)或***(p<0.001)指示，且当与单独的恩扎妥林组相比时，用条上方的#(p<0.05)或##(p<0.01)指示。

此外，在这些细胞中评估与G1/S转换相关的标记蛋白(CDK2、CDK4、CDK6和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1))的表达水平或存在水平，如图3d中所示。在用恩扎妥林和/或依鲁替尼处理48小时后，提取蛋白质，并且通过蛋白质印迹来分析靶蛋白。组合处理使标记蛋白的水平急剧下降，而用任一单一药物处理对与G1/S转换相关的蛋白质的表达或存在具有微小影响。在其它三个细胞系中可以看到类似趋势(图3d)。这些数据表明，恩扎妥林和依鲁替尼的组合诱导G1期停滞，并且共处理疗法遏制细胞增殖，部分由细胞周期停滞以及部分由细胞凋亡路径引起。

低剂量的恩扎妥林和依鲁替尼的处理协同抑制DLBCL的迁移和侵袭

为了评估用低剂量的恩扎妥林和依鲁替尼处理对细胞运动的可能影响，使用DLBCL细胞进行细胞迁移和侵袭分析。HBL-1细胞用2微摩尔恩扎妥林和/或0.02微摩尔依鲁替尼预处理指定的时间(30-60分钟)，接着置于康宁(Corning)迁移腔室的传斯维尔培养板中。对于侵袭测试(不用于迁移测试)，传斯维尔培养板预涂布有基质胶。在48小时之后，通过对下部腔室中的细胞进行计数来评估迁移或侵袭的程度(以24小时测量)，并且表示为对照的百分比。对于侵袭能力，在HBL-1细胞中，用单独的恩扎妥林或依鲁替尼处理分别使侵袭能力稍微降低至对照的97.0％和85.0％。相对于对照细胞，用恩扎妥林和依鲁替尼处理的组合组(32.8％)的侵袭能力明显受到遏制(图4a)。在迁移测试中，在HBL-1细胞中，单一药剂使迁移能力分别降低至对照的79.0％和70.2％。相比之下，用恩扎妥林和依鲁替尼处理的细胞穿过膜的数目减少至对照水平的大约25.5％(图4b)。当在TMD8、SU-DHL-6和OCL-LY7细胞系中重复实验时，发现了类似的趋势，如侵袭和迁移直方图(图4b，图4d)中所示。对于图4b和4d中的直方图，当与对照相比时，统计意义由条上方的*(p<0.05)或**(p<0.01)或***(p<0.001)指示，或当与单独的恩扎妥林组相比时，由条上方的#(p<0.05)或##(p<0.01)指示。这些发现表明，恩扎妥林和依鲁替尼的共施用可协同地起作用以减少细胞迁移和侵袭，这在DLBCL细胞运动中起至关重要的作用且预期与疾病进展相关。

恩扎妥林和依鲁替尼的组合协同抑制下游信号传导路径

为了深入了解恩扎妥林与依鲁替尼的组合在DLBCL模型中的增生作用的机制，检验了由单独的每个药剂和由组合引起的信号转导路径的变化。HBL-1、TMD-8和SU-DHL-6细胞用低剂量的恩扎妥林单一疗法处理60分钟和120分钟，如图5中所汇总，并且从细胞收集蛋白质以用于通过蛋白质印迹来分析。单独的恩扎妥林明显地降低了糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的磷酸化，所述激酶充当恩扎妥林活性的生物标记物。短期和低剂量的恩扎妥林处理对PKCβ磷酸化没有显著影响(数据未显示)，甚至会增加p-BTK、p-ERK和p-AKT表达。类似地，单独用依鲁替尼处理降低了BTK和AKT的磷酸化，伴有对mTOR、PLCγ2、ERK和P38磷酸化的轻微影响。然而，与单独的每种单一疗法相比，用恩扎妥林和依鲁替尼的处理引起了ERK、mTOR、PLCγ2、P38磷酸化的进一步降低(图5)。这些结果在TMD8和SU-DHL-6细胞中也得到了证实。总的来说，与单一治疗相比，恩扎妥林和依鲁替尼的组合似乎在ABC和GCB细胞模型中抑制信号转导方面更有效，这意味着共暴露会引起对BCR下游多个信号的遏制的进一步增强。

低剂量的恩扎妥林加依鲁替尼诱导DLBCL的全转录组改变

为了更好地理解用低剂量的恩扎妥林和依鲁替尼共处理在DLBCL细胞中的作用，我们通过RNA-seq分析恩扎妥林和/或依鲁替尼处理相比于媒剂细胞的全转录组改变。对于这一实验，使HBL-1细胞暴露于2微摩尔恩扎妥林或0.02微摩尔依鲁替尼或二者一起24小时。收集RNA进行测序。确定了被各种处理上调或下调的数百种转录物。因为上调的基因与这些抑制剂并不紧密相关，所以仅进一步研究下调的基因。图6a中的维恩图(Venndiagram)绘示了通过不同处理产生的这些下调最多的基因变化(<2倍，p<0.05)。恩扎妥林和依鲁替尼的效率低于组合处理：与组合处理的605种相比，恩扎妥林和依鲁替尼分别有339和336种转录物显著下调。组合处理组中含有大约91％的由恩扎妥林下调的转录物(365种基因)和73％的由依鲁替尼下调的转录物(246种基因)。另外，组合处理还有效地减少163种转录物，这些转录物在单独的每一单一疗法中未呈现(图6a)。

从排名靠前的路径(通过KEGG)中进一步分析鉴别出显著下调的基因。与媒剂处理对照相比，来自排名靠前的路径(通过KEGG)的通过处理显著下调的基因呈现于热图(图6b)中。色标条表示较高(红色)至较低(蓝色)表达水平，以FPKM值表示；在Z分数变换(Z-scoretransformation)之后以色标显示差异。通过log2差异倍数<0确定下调的基因。FKPM是每百万片段映射的每千碱基外显子的片段。用低剂量的恩扎妥林和依鲁替尼共处理可有效下调与BCR、NF-κB、JAK和MAPK信号传导路径相关的基因，并且所述路径分析结果与免疫印迹分析一致(图3和5)。总之，这些结果显示恩扎妥林和依鲁替尼的组合协同地起作用以调节全转录组变化。

为了进一步评估恩扎妥林和依鲁替尼的协同抗肿瘤作用，我们使用qRT-PCR检测在组合处理中改变的转录物的mRNA表达。特别地，使用qRT-PCR和蛋白质印迹检测DLBCL细胞系中NOTCH1的表达。在HBL-1、TMD9、OCI-LY7和SU-DHL-6细胞中通过蛋白质印迹验证由shRNA引起的NOTCH1基因敲除。β-肌动蛋白用作上样对照。NOTCH1的表达通过qRT-PCR进一步确认。参见图6c，图6d。

与恩扎妥林和依鲁替尼单一疗法相比，组合处理能够更显著地降低NOTCH1的mRNA表达(图6e)。强有力的大量证据揭示，NOTCH1在促进细胞代谢、生长和增殖方面以及在增强信号传导路径的活性方面的重要致癌作用[27-30]。DLBCL细胞中NOTCH1 mRNA和蛋白质的表达为中高水平(图6c)。异常NOTCH1活性已成为血液恶性肿瘤的重要致癌调节因子[30,31]。恩扎妥林和依鲁替尼在抑制DLBCL细胞增殖方面的组合作用可能是通过遏制NOTCH1表达来实现的。

为了验证NOTCH1在DLBCL细胞存活和增殖中的作用，使用shRNA转染来敲除NOTCH1(图6d)。DLBCL细胞用靶向NOTCH1的shRNA转染或用恩扎妥林和依鲁替尼处理48小时和72小时。接着使用Cell Titer-Glo发光细胞活力分析来确定细胞活力。图6e中所示的结果表示来自三个独立重复的平均值和标准差；当与对照相比时，统计意义由条上方的*(p<0.05)或**(p<0.01)或***(p<0.001)指示，或当与单独的恩扎妥林组相比时，由条上方的#(p<0.05)或##(p<0.01)指示。

DLBCL细胞中的沉默NOTCH1引起对于肿瘤细胞的抗增殖活性，表明NOTCH1表达对于DLBCL细胞的存活是关键的。出人意料地，在NOTCH1 shRNA和共处理疗法中检测到类似的增殖抑制作用，并且与时间一致，表明组合治疗还可能通过下调NOTCH1表达来产生协同抗DLBCL效果(图6f)。

恩扎妥林和依鲁替尼在DLBCL细胞衍生的异种移植物中的协同抗肿瘤作用。

最后，我们评估恩扎妥林单独和与依鲁替尼组合减少淋巴瘤异种移植物模型中的肿瘤生长的能力，在所述模型中，ABC-DLBCL HBL-1细胞被移植于NPG小鼠中(图7)。NPG小鼠皮下注射HBL-1细胞(2.5×10⁶个细胞)且随机分成四组(每组n＝5)。各组分别用恩扎妥林、依鲁替尼、恩扎妥林和依鲁替尼的组合以及媒剂处理。恩扎妥林以50mg/kg，一天两次(BID)的剂量口服施用。依鲁替尼以12mg/kg，一天一次(QD)的剂量口服施用(总每日剂量为每天100mg/kg恩扎妥林，和每天12mg/kg依鲁替尼)。肿瘤大小和重量描述为平均值+/-标准差；当与对照相比时，统计意义由*(p<0.05)或**(p<0.01)或***(p<0.001)指示，或当与单独的恩扎妥林组相比时，由#(p<0.05)或##(p<0.01)指示。

在上述剂量下以单一疗法形式给药恩扎妥林或依鲁替尼在减小肿瘤体积方面产生弱的活性，且单独的治疗剂都不能统计学上显著降低肿瘤生长。与对照和单一疗法相比，在接种后第18天开始处理后2-3周，经组合处理而治疗的小鼠中的肿瘤体积显著较小(p<0.01，图7a)。所有治疗均耐受性极好，任何治疗组中体重无显著变化(图7b)。

在实验结束时(第39天)，与媒剂组(1321.50±168.84mg)相比，单独的恩扎妥林(1151.62±163.79mg)或单独的依鲁替尼(1141.80±235.57mg)均未产生显著的肿瘤生长抑制作用，而组合有力地遏制肿瘤生长并且限制肿瘤重量(871.80±111.44mg，图7c、7d)。总之，这些结果展现了在临床前模型中使用恩扎妥林与依鲁替尼组合的协同活性，其证实了上文的体外发现。因此，恩扎妥林和依鲁替尼的组合对ABC(HBL-1、TMD8、SU-DHL-2)和GCB(SU-DHL-6、OCI-LY7)DLBCL细胞系的存活和增殖产生持久的协同作用。

用于患者选择的生物标记物

索元(Denovo)对恩扎妥林的DLBCL临床数据进行了分析并且确定了存活率提高的患者子集。使用其专有生物标记物发现平台，所述公司确定了一种新型生物标记物，其被命名为索元基因组标记物1(Denovo Genomic Marker 1，DGM1)。在公开的专利申请WO2018/045240中公开并且描述了DGM1和其作为生物标记物用于选择用恩扎妥林进行治疗的受试者的用途。数据显示，在恩扎妥林的DLBCL试验中，DGM1阳性患者的存活率相比DGM1阴性患者显著提高。恩扎妥林正处于III期临床试验中，其中使用DGM1表达或存在来选择可能对治疗有反应的DLBCL患者。

ENGINE试验(NCT03263026)正在评估在具有或不具有DGM1生物标记物的一线DLBCL患者中恩扎妥林结合R-CHOP方案(其由利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松组成)，对比单独的R-CHOP。试验的主要终点为具有生物标记物的患者的总存活率，且其主要完成日期为2020年10月。

实施例2

材料和方法

细胞系和细胞培养

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系，SU-DHL-5和SU-DHL-6购自美国典型培养物中心(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞在补充有10％胎牛血清(吉毕科，生命技术公司，美国加利福尼亚州)的RPMI1640培养基(吉毕科，生命技术公司，美国加利福尼亚州)中生长。将所有细胞系维持于37℃下加湿的5％CO₂培育箱中。

药物和试剂

恩扎妥林(LY317615)、阿卡替尼(ACP-196)、司布替尼(CC-292，AVL-292)和ARQ531购自赛力克化学(Selleckchem)(美国德克萨斯州休斯顿(Houston,TX,USA))，泽布替尼(BGB-3111)购自麦德科生物科学(MedKoo BioSciences)(美国北卡罗来纳州莫里斯维尔(Morrisville,NC,USA))，并且维卡布替尼(SNS-062)购自MedChemExpress公司(美国新泽西州蒙茅斯章克申(Monmouth Junction,NJ,USA))。所有化合物最初溶解于100％二甲亚砜(DMSO，西格玛化学)中，浓度为10mM，并且加以等分并储存于-20℃下。

细胞增殖分析

将细胞以每孔2.5×10⁴的密度一式三份地接种在96孔细胞培养板中，并且单独或以组合方式用不同浓度的恩扎妥林或布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)处理72小时。在处理后，使用Cell Titer AQueous One Solution细胞增殖分析试剂盒(普洛麦格，美国威斯康星州麦迪逊)评估细胞活力。通过伯腾(BioTek)Elx800微板读数仪在490nm吸光度下测量细胞的细胞毒性。每个药物的IC50值由药物浓度0.014μM至10μM的曲线计算。

统计分析

所有实验独立地进行至少两次。所有值表示为平均值±SEM。使用t检验(Student’s ttest)对数据进行了P值分析。P值<0.05被公认为在统计学上有显著意义。通过比较未处理的对照细胞来计算化合物抑制作用。根据周-特氏方法使用CalcuSyn软件(第2版，Biosoft，英国剑桥)确定药物组合的组合指数(CI)。CI值<1，＝1，和>1分别指示协同作用、相加作用和拮抗作用。

结果

药物组合广泛用于许多疾病(例如癌症)的治疗。为了确定恩扎妥林和BTK抑制剂对DLBCL细胞增殖的组合作用，通过0.014μM-10μM下的药物处理来确定每一药物的剂量反应曲线。计算功效和50％抑制浓度(IC50)，并且将其用于组合剂量选择。恩扎妥林的处理产生细胞增殖的剂量依赖性抑制，其中在SU-DHL-5中，IC50为3.6μM，在SU-DHL-6细胞系中，IC50为5.9μM(数据未示出)。对于组合研究，选择1μM、3μM和5μM的恩扎妥林与不同浓度的BTK抑制剂，即泽布替尼、阿卡替尼和ARQ531进行治疗组合。如图8中所示，3种不同剂量的恩扎妥林与0.125μM的泽布替尼组合治疗显示出对SU-DHL-6细胞的显著抗增殖活性，而3种类似剂量的恩扎妥林与阿卡替尼和ARQ531组合则在0.06μM的较低浓度下实现类似作用。

对于恩扎妥林协同作用定量研究，将Chou-Talalay开发的恒定比浓度方法用于组合实验设计。实践中采用CalcuSyn软件进行数据分析和组合指数(CI)计算。所得CI为药物组合中的相加作用(CI＝1)、协同作用(CI<1)和拮抗作用(CI>1)提供了定量定义。在这一分析中研究恩扎妥林和BTK抑制剂维卡布替尼。恩扎妥林单独以5μM的浓度开始或与维卡布替尼组合以4μM的浓度开始，按恒定比率(IC50比率)，并且按相同IC50比率将两种药物分别以1:1稀释度稀释至最终0.08μM和0.06μM。如图9中所示，恩扎妥林和维卡布替尼的组合在两种细胞系中处理72小时后使得细胞活力与单一药物相比协同的降低。对于在SU-DHL-5细胞中恩扎妥林0.08-5μM(CI为0.135-0.78)和在SU-DHL-6细胞中恩扎妥林0.08-0.6μM(CI为0.143-0.852)的所有选择剂量，组合治疗显示出对细胞增殖的强力协同抑制性作用(CI<1)。

提供上文所阐述的实施方式以辅助本领域技术人员实践本发明。然而，本文中所描述和要求保护的发明不受本文中所公开的具体实施例的范围限制：所述实施例和实施方式旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等效实施方式都旨在于在本发明的范围内。实际上，根据不脱离本发明发现的宗旨或范围的前述描述，除本文中所示出和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改也旨在于在权利要求书的范围内。

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下文列出某些引用的参考文献。

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序列表

<110> 杭州索元生物医药股份有限公司

<120> 恩扎妥林和BTK抑制剂的组合及其用途

<130> 4594-2000641

<150> PCT/CN2018/105217

<151> 2018-09-12

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

tccaccagtt tgaatggtca at 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

cgcagagggt tgtattggtt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

tggtgaagac gccagtgga 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

tgccaacatc caggacaaca t 21

Claims (30)

1.一种组合物，其包含恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼，和其药学上可接受的盐，并且优选地是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其进一步包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。

5.一种治疗性组合，其包含恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。

6.根据权利要求5所述的治疗性组合，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求5或6所述的治疗性组合，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼或其药学上可接受的盐；并且优选地，所述BTK抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的治疗性组合，其中恩扎妥林和所述BTK抑制剂经制备以用于同时施用。

9.根据权利要求5至7中任一项所述的治疗性组合，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂经制备以用于单独施用。

10.一种体内治疗性组合，其包含在受试者的血液或血浆中的恩扎妥林和BTK抑制剂。

11.一种治疗或预防选自肿瘤病况、免疫病症、胃肠道病症、CNS病症、皮肤病症、血液病症和代谢病症的病症或疾病的方法，其中所述方法包含向需要此类治疗的受试者施用恩扎妥林和BTK抑制剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其为用于治疗或预防癌症的方法，所述癌症选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、复发性CLL、难治性CLL、滤泡性淋巴瘤、腺癌、转移性腺癌(例如胰腺癌)、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、转移性乳腺癌、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、难治性多发性骨髓瘤、复发性多发性骨髓瘤、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤(B细胞霍奇金淋巴瘤)、转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、原发性CNS淋巴瘤、肾细胞癌、继发性CNS淋巴瘤、移行细胞癌、尿路上皮细胞癌、结边缘B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、上皮卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、(反复性)头颈癌、鳞状细胞癌、(反复性)多形性胶质母细胞瘤(GBM)和B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，或其药学上可接受的盐。

14.一种用于治疗或预防淋巴瘤或降低已经针对淋巴瘤进行治疗的受试者的癌转移或复发的风险的方法，其中所述方法包含向有需要的受试者施用恩扎妥林或其药学上可接受的盐和BTK抑制剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、依武替尼、替拉布替尼、芬尼布替尼、泊塞替尼、BMS-986142、ARQ-531、LOU-064、PRN-1008、ABBV-599、AC-058、ARQ-531、BIIB-068、BMS-986195、HWH-486、PRN-2246、TAK-020、GDC-0834、BMX-IN-1、RN486、SNS-062、LFM-A13、PCI-32765(依鲁替尼的外消旋体)、CGI-1746、ONO-4059和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼、CT-1530、DTRMWXHS-12、苯磺酸司布替尼、维卡布替尼、ARQ-531和SHR-1459，和其药学上可接受的盐，并且优选地，所述BTK抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自M7583、依鲁替尼和阿卡替尼，或其药学上可接受的盐。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂一起施用。

19.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂单独施用。

20.根据权利要求19所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐和所述BTK抑制剂按使得二者一起存在于经治疗受试者的血液或血浆中的时间安排进行施用。

21.根据权利要求11至20中任一项所述的方法，其中淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

22.根据权利要求21所述的方法，其中淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述淋巴瘤选自伯基特氏淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、小淋巴细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。

24.根据权利要求11至23中任一项所述的方法，其中恩扎妥林或其药学上可接受的盐经口服施用。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述BTK抑制剂经口服施用。

26.根据权利要求11至25中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐。

27.根据权利要求11至26中任一项所述的方法，其中所述受试者是基于生物标记物的表达或存在而选择的。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物标记物是DGM1。

29.一种恩扎妥林或其药学上可接受的盐与BTK抑制剂的组合在制备用于治疗或预防需要此类治疗或预防的受试者中的病症或疾病的药剂中的用途，所述病症或疾病选自肿瘤病况、免疫病症、胃肠道病症、CNS病症、皮肤病症、血液病症和代谢病症。

30.一种恩扎妥林或其药学上可接受的盐与BTK抑制剂的组合在制备用于治疗或预防需要此类治疗或预防的受试者中的淋巴瘤，或用于降低已经针对淋巴瘤进行治疗的受试者中的癌转移或复发的风险的药剂中的用途。

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