CN112501319B - 一种检测4种食源性致病寄生虫的探针、芯片、试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测4种食源性致病寄生虫的探针、芯片、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测4种食源性致病寄生虫中一种或多种的探针组合，属于微生物检测技术领域。其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫。本发明还公开了利用上述探针组合制备的基因芯片、试剂盒和检测方法。利用本发明对4种食源性致病寄生虫进行检测，特异性强、灵敏度高，准确性好，并且方便、快速，尤其适用于寄生虫载量低的样本检测，为感染诊疗和食品安全检测提供更好的技术支持。

Description

一种检测4种食源性致病寄生虫的探针、芯片、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测4种食源性致病寄生虫的探针、芯片、试剂盒及方法。
背景技术
食源性致病寄生虫病是当今世界上最关注的公共卫生问题之一，是由寄生虫通过多种途径污染食品和饮水后，因生食或半生食含有感染期寄生虫的食物和水进入人体，引起人的食源性致病寄生虫病的发生。近年来，食源性致病寄生虫病已成为新“富贵病”，特别是沿海经济发达地区的城镇居民的感染人数呈上升势头，且我国食源性致病寄生虫病具有分布广、对人畜危害严重等特点。
食源性致病寄生虫主要包括吸虫、绦虫、弓形虫和旋毛虫和孢子虫等。传统的食源性致病寄生虫的检测技术有染色涂片检查、漂浮集卵法、沉淀集卵法、麦氏计数法和影像学等，传统的方法操作复杂、周期过长、阳性率低等局限，不能满足食品安全快速检测的需求，也不利于食源性致病寄生虫感染等事件的处理。而近年来发展了一系列病原体核酸分子检测技术，包括PCR、基因芯片、高通量测序基因检测等。PCR具有较好的特异性及灵敏度，但每次只能检测一种致病菌，存在通量低的缺陷，而二代测序技术虽然检测的病原范围大，但周期较长（24h以上）、灵活度低、成本高、整个过程比较复杂，尤其是数据的解读，目前仍然存在一定的困难。而基因芯片既具备高灵敏性和特异性，且成本较低、操作灵活、时效性高、针对性强，使得其十分适用于对特定类型样本的病原检测，适合临床和食品安全检测的应用。
基因芯片（GeneChip）又称为微阵列技术（MicroArray），主要包括5个技术环节：探针构建、芯片制备、样品制备、芯片实验、信号检测及结果判读。基因芯片上的探针设计是体现芯片检测效能的核心因素之一，然后现有的特异性探针序列设计算法均从微生物的保守基因如细菌的16SrRNA、真菌的ITS等进行挖掘，且采用长序列比对的方式，故算法程序缺乏足够的灵活性，且探针序列缺乏足够的覆盖度和灵敏性。不能满足大规模的寄生虫检测基因芯片的设计要求。此外，现有的芯片设计方法未考虑微阵列上荧光信号的区域不均匀性而对各类探针的排布进行设计，现有的芯片设计方法缺乏荧光信号的标准化处理。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种检测4种食源性致病寄生虫中一种或多种的探针组合，其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫。
广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）是引起广州管圆线虫病（食源性寄生虫病）的病原体，其成虫寄生于鼠的肺动脉内，人是该虫的非正常宿主。人因生食或半生食含有该寄生虫幼虫的褐云玛瑙螺、福寿螺、蜗牛或蔬菜而感染该虫幼体，感染人体后其幼虫移行至机体中枢神经系统，并引发嗜酸性脑炎和脑膜脑炎，其症状常表现为剧烈头痛、恶心、喷射性呕吐和颈项强直等神经系统症状。该病在热带和亚热带地区流行，在我国呈散在分布，多发生于沿海地区。
微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种呈全球性分布的重要食源性/水源性人兽共患的机会性致病，专性胞内寄生虫，感染后寄生于哺乳动物和人体小肠中，是重要的腹泻病原之一，该虫体感染引起的隐孢子虫病多见于免疫功能低下或免疫缺陷人群，表现为急慢性腹泻，并伴有发热、恶心、咳嗽及呼吸困难等症状。
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）也称为三尸虫，是一种专性胞内寄生虫，其终宿主是猫科动物。人体常因接触或食用被污染的水与食物而感染，虫体可随血液流动，到达大脑、心脏和眼底等部位，引起弓形虫病。免疫力正常者多数无明显症状，但当机体免疫力低下或免疫缺陷时可因散播性感染致死。此外，孕妇感染弓形虫可导致流产、死胎或畸形胎。
猪肉绦虫（Taenia solium）是中国主要的人体寄生绦虫，其终宿主是人。人体感染的发生常因误食生的或未煮熟的含猪肉绦虫幼虫--囊尾蚴的猪肉。囊尾蚴的寄生部位很广，包括皮下组织、中枢神经系统、眼部、肝和肺等部位，引起的病症主要是皮下及肌肉囊尾蚴病、眼囊尾蚴病和脑囊尾蚴病。
在本发明的一些实施方案中，所述探针组合包括能够检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫中至少两种食源性致病寄生虫的探针。在本发明的一些优选实施方案中，所述探针组合包括能够检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫中至少三种食源性致病寄生虫的探针。在本发明的一些更优选实施方案中，所述探针组合包括能够检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫四种食源性致病寄生虫的探针。
在本发明中，所述探针组合也称为探针组合物，是指有多种探针组成的组合物。
在本发明的一些实施方案中，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ ID No.1~6所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ IDNo. 7~12所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQID No. 13~18所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 19~24所示核苷酸序列的探针中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ IDNo. 1~6所示核苷酸序列的探针；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 7~12所示核苷酸序列的探针；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 13~18所示核苷酸序列的探针；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 19~24所示核苷酸序列的探针。
在本发明中，针对特定食源性致病寄生虫的探针是利用以下方法设计得到的：
S1，获得所述食源性致病寄生虫的参考基因组序列；
S2，将获得的参考基因组序列打断成50nt k-mer集，首先将k-mer集比对到人参考参考基因组序列hg19，过滤identity大于等于85的k-mer；然后所述食源性致病寄生虫的k-mer集与其他食源性致病寄生虫利用同样方法打断的50nt k-mer集进行两两比较，过滤连续比对碱基数大于20nt的探针，筛选出所述食源性致病寄生虫的初始特异性探针序列集，并统计探针序列丰度；
S3，对初始特异性探针序列集进行过滤：
S31，将所述物种特异性探针集中的探针序列与细菌、病毒、真菌和其他寄生虫的RefSeq核酸数据库进行序列比对，如比对长度大于20nt以上，则计算探针序列与目标序列的核酸自由能，如核酸自由能小于-30，则去除该探针序列；
S32，若探针的连续相同碱基出现5次，则去除该探针序列；
S4，从剩余的探针序列中保留丰度最高的前N条探针序列作为所述食源性致病寄生虫的探针序列。其中，N=1~50，优选地，N=5-10，更优选地，N=6。
在本发明的一些实施方案中，如果同时检测多种食源性致病寄生虫，则需要同时获得其他食源性致病寄生虫的参考基因组。
进一步地，将其他食源性致病寄生虫参考基因组序列打断成18nt k-mer集，对上述在步骤S2后、步骤S3前，将获得的探针分别与18nt k-mer序列集进行序列比对，如序列比对结果中，某个探针与18nt k-mer集中至少一条序列比对的identity大于等于85，则去除该探针序列。
在本发明的一些实施方案中，同时获得上述4种食源性致病寄生虫的探针，步骤如下：
S1，获得4种食源性致病寄生虫的参考基因组序列和人参考基因组序列hg19；
S2，将获得的4种食源性致病寄生虫的参考基因组序列打断成50nt k-mer集，首先将k-mer集比对到人参考参考基因组序列hg19，过滤identity大于等于85的k-mer；然后以每种寄生虫为单元，对单元之间的k-mer集进行两两比较，过滤连续比对碱基数大于20nt的探针，筛选出所述食源性致病寄生虫的初始特异性探针序列集，并统计探针序列丰度；
进一步，将4种寄生虫的参考基因组序列集生成以每种寄生虫为单元的18nt k-mer集，使用blastn对18nt k-mer集和上一步得到的初始特异性探针序列集进行序列比对，如不同种的序列比对结果中，某个探针与18nt k-mer集中至少一条序列比对的identity大于等于85，则去除该探针序列；
S3，对初始特异性探针序列集进行过滤：
S31，将所述初始特异性探针集中的探针序列与细菌、病毒、真菌和其他寄生虫的RefSeq核酸数据库进行序列比对，如比对长度大于20nt以上，则计算探针序列与目标序列的核酸自由能，如核酸自由能小于-30，则去除该探针序列；
S32，若探针的连续相同碱基出现5次，则去除该探针序列；
S4，从剩余的探针序列中保留丰度最高的前6条探针序列作为所述食源性致病寄生虫的探针序列。
本发明的第二方面提供一种基因芯片，所述基因芯片本发明第一方面所述的探针组合。
进一步地，所述基因芯片还包括有阴性对照探针。在本发明的一些优选实施方案中，所述阴性对照探针包括具有SEQ ID No. 25所示核苷酸序列的探针。在本发明的一些具体实施方案中，所述阴性对照探针为具有SEQ ID No. 25所示核苷酸序列的探针。
进一步地，所述基因芯片还包括全局质控探针。在本发明的一些优选实施方案中，所述全局质控探针包括具有SEQ ID No. 26所示核苷酸序列的探针。在本发明的一些具体实施方案中，所述全局质控探针为具有SEQ ID No. 26所示核苷酸序列的探针。
进一步地，所述基因芯片还包括阳性对照探针。在本发明的一些优选实施方案中，所述阳性对照探针包括分别具有SEQ ID No. 27~32所示核苷酸序列的探针中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述阳性对照探针包括分别具有SEQ ID No. 27~32所示核苷酸序列的探针。在本发明的另一些具体实施方案中，所述阳性对照探针由分别具有SEQID No. 27~32所示核苷酸序列的探针组成。
在本发明的一些实施方案中，所述基因芯片包括检测4种食源性致病寄生虫中一种或多种的探针组合，还包括阴性对照探针、全局质控探针和阳性对照探针，其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 1~6所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 7~12所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 13~18所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 19~24所示核苷酸序列的探针中的至少一种，所述阴性对照探针包括具有SEQ ID No. 25所示核苷酸序列探针，所述全局质控探针包括具有SEQ ID No. 26所示核苷酸序列的探针，所述阳性对照探针包括分别具有SEQ IDNo. 27~32所示核苷酸序列的探针中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因芯片包括检测4种食源性致病寄生虫的探针组合，还包括阴性对照探针、全局质控探针和阳性对照探针，其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 1~6所示核苷酸序列的探针；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 7~12所示核苷酸序列的探针；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQID No. 13~18所示核苷酸序列的探针；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 19~24所示核苷酸序列的探针，所述阴性对照探针为具有SEQ ID No. 25所示核苷酸序列的探针，所述全局质控探针为具有SEQ ID No. 26所示核苷酸序列的探针，所述阳性对照探针包括分别具有SEQ ID No. 27~32所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一个具体实施方案中，所述基因芯片采用安捷伦CGH芯片（微阵列），包含16行×12列，共192个特征点（阵列点）。微阵列上探针的布局如下：
点样位置控制探针（安捷伦CGH芯片自带）：共40个位点，其中24个位点分布于微阵列的四个角，剩余16个位点随机分散在微阵列中；
阴性对照探针：共1条探针序列，重复15次，组成15个监测位点，随机分布于微阵列中；
阳性对照探针：共6条探针序列，重复2次组成12个监测位点，位于微阵列1行4~9列和16行4~9列；
全局质控探针：共1条探针序列，重复5次组成5个监测位点，位于微阵列中央呈辐射状向四角扩散。
食源性致病寄生虫探针：共4种寄生虫，每个物种各6条探针序列，各重复5次，组成120检测位点，随机分布于微阵列中。
本发明的第三方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面任一所述探针组合或本发明第二方面任一所述的基因芯片。
进一步地，所述试剂盒还包括待测样本基因组DNA提取试剂。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸扩增试剂和荧光标记试剂。
更进一步地，所述试剂盒还包括纯化试剂。
本发明的第四方面一种检测食源性致病寄生虫的方法，包括以下步骤：
S1，获取待测样本的基因组DNA；
S2，对获取的基因组DNA进行核酸扩增、荧光标记并进行纯化；
S3，利用本发明第二方面任一所述的基因芯片进行杂交检测；
S4，根据检测到的探针信号判断检测结果。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，所述核酸扩增为非特异性随机扩增；使用Cyanine3-dUTP进行荧光标记。
在本发明的一些实施方案中，步骤S3的基因芯片具体为：包括检测4种食源性致病寄生虫的探针组合，还包括阴性对照探针、全局质控探针和阳性对照探针，其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 1~6所示核苷酸序列的探针；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 7~12所示核苷酸序列的探针；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQ ID No. 13~18所示核苷酸序列的探针；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ IDNo. 19~24所示核苷酸序列的探针，所述阴性对照探针为具有SEQ ID No. 25所示核苷酸序列的探针，所述全局质控探针为具有SEQ ID No. 26所示核苷酸序列的探针，所述阳性对照探针包括分别具有SEQ ID No. 27~32所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些实施方案中，所述基因芯片采用安捷伦CGH芯片（微阵列），包含16行×12列，共192个特征点（阵列点）。微阵列上探针的布局如下：
点样位置控制探针（安捷伦CGH芯片自带）：共40个位点，其中24个位点分布于微阵列的四个角，剩余16个位点随机分散在微阵列中；
阴性对照探针：共1条探针序列，重复15次，组成15个监测位点，随机分布于微阵列中；
阳性对照探针：共6条探针序列，重复2次组成12个监测位点，位于微阵列1行4~9列和16行4~9列；
全局质控探针：共1条探针序列，重复5次组成5个监测位点，位于微阵列中央呈辐射状向四角扩散。
食源性致病寄生虫探针：共4种寄生虫，每个物种各6条探针序列，每个探针重复5次，组成120个检测位点，随机分布于微阵列中。
进一步地，步骤S4的步骤为：
S41，扫描及特征提取：清洗后的芯片使用安捷芯片扫描仪在Multi-TIFF模式下进行扫描，得到芯片特征数据，接着使用特征提取软件提取信号特征，得到探针信号特征数据；
S42，数据质检：对上一步的探针信号特征数据进行质检，设置信号检出阈值为100，若：a)所有阴性对照探针均未检出（荧光信号值均低于阈值）；b)检出了50%以上的阳性对照探针；c）所有全局质控探针均检出，且均未出现信号过饱和，则本次检测数据质检合格；
S43，数据质控：a）检出高于检测信号阈值（信号值100）的全局质控探针和寄生虫探针；b）计算全局质控探针的信号平均值QC_intensitymean；c）荧光信号值的标准化处理：对每一个检出的寄生虫探针i（Parasitei）按公式1校正探针信号值，并得到质控数据：
Correct_Parasitei_intensity=Parasitei_intensity/QC_intensitymean （公式1）
（4）寄生虫检出判定：因寄生虫探针均重复了5次，故针对特定寄生虫：a)首先统计重复检出次数大于等于3的探针；b)然后统计符合a条件的探针数目；c）若b中统计的探针数量大于等于2，则认为该寄生虫检出阳性。
在本发明中，所述待测样本可以为任意体液，包括但不限于血液、脑脊液、肺泡灌洗液、痰液和组织液。
在本发明的一些实施方案如此，步骤S1中，可使用本领域常规方法进行核酸提取，进行所述获取待测样本的基因组DNA。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
（1）本发明设计探针的方法，利用高效筛选算法，可以方便、快速地完成探针设计，不仅适用于食源性致病寄生虫，还适用于其他病原的探针设计。
（2）本发明针对食源性致病寄生虫的探针，特异性强、灵敏度高，稳定性好。
（3）本发明的基因芯片除包括针对食源性致病寄生虫的探针，还包括阴性对照探针、阳性对照探针及全局质控探针，并通过对各类探针设计空间排列特征，进一步提高了基因芯片检测的灵敏性和准确性。
（4）利用本发明，可以快速（小于10小时）、灵敏、准确地检测样本中的食源性致病寄生虫，尤其适用于寄生虫载量不高的样本检测。
（5）利用本发明，可以为食源性致病寄生虫感染的鉴别诊断和抗感染治疗提供依据，并为食品安全检测（寄生虫污染）的筛查提供有效、快速、稳定地的手段。
附图说明
图1示出了本发明基因芯片探针分布示意图。
图2示出了本发明基因芯片扫描仪扫描得到的样片（tiff格式）示意图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 1 4种食源性致病寄生虫的特异性探针设计
本实施例针对4种食源性致病寄生虫：广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫进行探针设计，具体步骤如下：
（1）4种食源性致病寄生虫的基因组数据库构建：该数据库包含的参考基因组序列是用于4种食源性致病寄生虫的特异性探针的构建。发明人从NCBI NT库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nt.gz）、RefSeq和GenBank库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes）、寄生虫参考序列库（https://eupathdb.org/eupathdb）等多个本领域权威数据库中获取4种食源性致病寄生虫的基因组序列，发明人进一步去除了冗余重复及可信度较低的基因组序列，去除原则为：每种寄生虫的虫株数量设上限值：50，如虫株数量超过50条，则随机保留50条参考基因组，确保微生物序列的精简、完整、准确和全面，提高探针序列的覆盖度、灵敏度和质量。
经过上述步骤处理，最终得到的数据库中包含全面、完整的4种寄生虫的基因组序列，具体地，各寄生虫种包含的具有完整参考基因组的虫株数量分别为：广州管圆线虫7株、微小隐孢子虫20株、刚地弓形虫18株、猪肉绦虫8株。
（2）特异性探针设计：
a. 输入上述构建参考基因组数据库中的4种寄生虫的参考基因组序列和人参考基因组序列（hg19）。
b. 使用GSMer v1.0软件预测物种特异性初始探针集：
i. 将4种寄生虫的参考基因组序列集使用meryl（kmer软件模块）打断成50nt k-mer集后，首先使用blastn v2.2.26将k-mer集比对到hg19，过滤identity大于等于85的k-mer；然后以每种寄生虫为单元，对单元之间的k-mer集使用mapMers（kmer软件模块）进行两两比对，过滤连续比对碱基数大于20nt的k-mer，最后筛选出各个寄生虫的初始特异性探针集（50nt kmer），并统计探针序列丰度；
ii. 将4种寄生虫的参考基因组序列集生成以每种寄生虫为单元的18nt k-mer集，使用blastn对18nt k-mer集和上一步得到的初始特异性探针序列集进行序列比对，如不同种的序列比对结果中，identity大于等于85，则去除该探针序列，最后得到各个寄生虫的初始特异性探针集。
c. 物种特异性初始探针集的进一步过滤：
i. 使用blastn将上述探针与细菌、病毒、真菌和其他寄生虫的RefSeq核酸数据库进行序列比对，如比对长度大于20nt以上，则计算探针序列与目标序列的核酸自由能（Freeenergy，单位kcal/mol），如核酸自由能小于-30，则去除该探针序列；
ii. 若探针的连续相同碱基出现5次，则去除该探针序列，得到特异性好的探针序列集。
d. 最后从剩余的探针序列中保留丰度最高的前6条探针序列作为各个寄生虫的探针序列，得到保守性好的探针序列集。
具体核苷酸序列（均为50nt）如表1所示：
表1 探针信息
Figure 464703DEST_PATH_IMAGE002
Figure 86570DEST_PATH_IMAGE004
进一步，可将上述探针组合制备试剂盒，用于4种食源性致病寄生虫中的一种或多种检测。
实施例 2 基因芯片及其制备
利用实施例1的设计的探针基因芯片，该基因芯片除包含上述针对4种食源性致病寄生虫的探针外，还包括对照探针及全局质控探针，其设计方法如下：
1. 对照探针及全局质控探针的设计
阴性对照探针设计：发明人使用计算机模拟生成1万条50nt的人工序列，并使用blastn将序列集比对NCBI NT库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nt.gz），保留连续比对碱基数小于18nt，且identity小于85的序列集，共得到424条序列。随机挑选1条序列作为阴性对照探针，在本实施例中，挑选的阴性对照探针序列如下：
Probe No. 25（SEQ ID No. 25）：
CAATGGCCAATTAAGATCATATCGAGTGAGATTCTCTCAGAATGTTTATT
全局质控探针设计：方法同阴性对照探针的设计，所述的全局质控探针序列如下：
Probe No. 26（SEQ ID No. 26）：
AATGACCCTTTCGTACTGTATAGACCGATGGTGCCATGTTGAAACAACTT
阳性对照探针设计：从细菌及古菌的16S核酸序列数据库Silva（https://www.arb-silva.de/）筛选出人体常见定植菌属（葡萄球菌属、气单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、肠球菌属、和假单胞菌属）和自然界常见菌属（脱硫弧菌属、芽孢杆菌属、黄单胞菌属、亚硝化球菌属、根瘤菌属和Eggerthia属等）的16S序列上均共有的50nt保守序列，共挑选6条阳性探针序列，所述阳性对照探针序列如Probe No 27~32所示，分别靶向的细菌属列表如表2所示：
表2 阳性对照探针
Figure 7253DEST_PATH_IMAGE005
2. 基因芯片的制备
发明人采用安捷伦（https://www.agilent.com/）平台的CGH（全基因组杂交）芯片，该芯片包括固相载体，制备时将探针固定于该固相载体上。
通常，探针以微阵列的方式按一定空间分布的特征固定在固相载体上，发明人特别设计了16行×12列微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。各类探针的分布特征见图1，更具体的描述如下：
点样位置控制探针（安捷伦CGH芯片自带）：共40个位点，其中24个位点分布于微阵列的四个角，剩余16个位点随机分散在微阵列中。
阴性对照探针：共1条探针序列，重复15次，组成15个监测位点，随机分布于微阵列中。根据上述设计规则，利用阴性对照探针检测任何样品都应呈现阴性结果。
阳性对照探针：共6条探针序列，重复2次组成12个监测位点，位于微阵列1行×4~9列和16行×4~9列。根据上述设计规则，利用阳性对照探针检测任何样品都应有至少50%的阳性探针呈现阳性结果。
全局质控探针：共1条探针序列，重复5次组成5个监测位点，位于微阵列中央呈辐射状向四角扩散。
为了对致病寄生虫探针的荧光信号进行标准化处理发明人将此探针委托捷伦进行寡核苷酸合成时，使用Cyanine 5荧光染料进行荧光标记，获得定制试剂（作为对照样本）。
食源性致病寄生虫探针：每个探针各重复5次，组成检测位点，随机分布于微阵列中。
例如，针对2种食源性致病寄生虫，每种6个探针，各重复5次，可得到60个检测位点。
再例如：针对4种食源性致病寄生虫，每种6个探针，各重复5次，可得到120个检测位点。
进一步，可将上述基因芯片制备成试剂盒，用于4种食源性致病寄生虫中的一种或多种检测。
实施例 3 利用基因芯片检测待测样本
本实施例中，发明人利用实施例2制备的包含4种食源性致病寄生虫共24个探针的基因芯片检测待测样本，在本实施例中，分别从花椰菜、荠菜、莲藕和水芹菜共4种蔬菜（常容易受到寄生虫污染）各采集1份标本（样本1-4），样本信息如表3所示：
表3 实施例3的样本信息
Figure 298733DEST_PATH_IMAGE006
检测具体包括以下步骤：
1. 待测样品制备基因组DNA（gDNA）
发明人使用Agilent CGH MicroArray的DNA提取试剂盒对待测样本进行gDNA提取：
（1）核酸提取和质检：各样品的DNA提取后，使用Nanodrop测定样本DNA浓度（ng/ul）及A260/A280（样品的核酸纯度指标）；
（2）取样：按500ng的DNA量，计算各样本的取样体积，即体积为：500ng/DNA浓度，按各样品的对应体积取样，并置于打断管中，补足H2O至50μL。设置打断时间为90秒；
（3）预先室温平衡OnePure MagBeads 30min，并充分振荡混匀，确保无明显磁珠沉淀；
（4）向低吸附管/八联管中加入60μL OnePure MagBeads（1.2×），再加入步骤（2）的打断产物，涡旋混匀，瞬离收集管壁液体，室温静置5min；
（5）将低吸附管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，弃去上清液；
（6）向1.5mL低吸附管或八联管中加入200μL 80%新鲜配制的乙醇，静置30秒后弃去上清液，重复操作步骤，直至上清去除较为干净；
（7）将低吸附管或八联管置于磁力架上，室温静置1到2min至磁珠干裂或将管子开盖放于45℃金属浴上，待磁珠表面无水光干裂，管底无乙醇残留；
（8）将离心管从磁力架上移开，并加入15μL温育好的Nuclease-free water重悬磁珠，涡旋或吹打混匀后，瞬离收集管壁液体，室温放置3min；
（9）将低吸附管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，转移13μL上清液到新的PCR管中，用于下一步标记。
本实施例各样本的核酸总量和荧光标记比活度信息如表4所示：
表4 实施例3的样本核酸质检信息表
Figure 83412DEST_PATH_IMAGE007
2. 核酸扩增及荧光标记
发明人使用Agilent SureTag Complete DNA Labeling Kit试剂盒对gDNA进行核酸扩增和荧光标记，包括以下步骤：
（1）向上述13μL打断后纯化好的gDNA中加入2.5μL Random primer，混匀后，进行如下变性反应：98℃ 3min、4℃保持；
（2）向上述变性反应体系中直接加入以下试剂：15.5μL gDNA和primer mix、5μL 5×Reaction buffer、2.5μL 10×dNTPs、1.5μL Cyanine 3-dUTP、0.5μL Exo(-)Klenow，共25μL；
（3）使用移液枪吹打或涡旋振荡混匀后，快速离心收集管壁上的液体，去除气泡；
（4）将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为75℃，并运行以下程序：37℃ 2h、65℃ 10min、4℃保持。
纯化荧光标记后的gDNA
（1）标记后的样品瞬离后转移到1.5mL低吸附管中，管子上做好相应的标记，加430μL 1×TE（PH 8.0）到标记后的样品中，混匀备用；
（2）把纯化装置的纯化柱装到配套的收集管中，做好相应的标记，吸取上一步全部标记好的gDNA到收集柱中，盖好盖子14000g离心10min；
（3）弃掉滤液，收集管放回收集柱中，加入480μL 1×TE（PH 8.0）到收集柱中，盖好盖子14000g离心10min；
（4）把收集柱取出来，倒置在一个新的2mL离心管中，管上做好相应标记，1000g离心1min，得到的就是纯化后的样品（体积：20~32μL）；
（5）检测荧光标记后的核酸总量、荧光标记比活度：在Nanodrop上选择芯片模式，对应的荧光选择Cyanine 3，用1×TE调零后进行检测，记录机器反馈的核酸总量（Yield）、荧光标记比活度（Specific Activity）。
本实施例各样本的核酸总量和荧光标记比活度信息如表5所示：
表5 实施例3的样本核酸总量和荧光标记比活度
Figure 204077DEST_PATH_IMAGE008
4. 芯片杂交及清洗
发明人使用Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit试剂盒进行芯片杂交，包括以下步骤：
（1）将纯化后的样品提及浓缩至14.3μL（总量5μg），并按表6配置杂交体系好后，吹打混匀，瞬离后将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为105℃，并运行以下程序：98℃3min、37℃ 30min、37℃保持。
表6 实施例3的杂交体系
Figure 910258DEST_PATH_IMAGE009
（2）杂交：
a.首先将一个干净的垫片放入安捷伦chamber里面，垫片标签朝上，与chamber底部的矩形部分对准，确保垫圈与腔室底座齐平；
b.然后吸取上一步37℃的样品55μL到垫片上的橡胶圈中间，避免产生气泡，将芯片倒扣在垫片上；
c.接着将chamber盖子盖上去，拧紧旋钮；
d.将每个组装好的装置装入恒温箱旋转架，取一个配平的chamber，垂直旋转杂交室，使载玻片湿润，并评估气泡的流动性；
e.设置杂交旋转器旋转速度为20 rpm，67℃杂交4h。
（3）芯片清洗：杂交后在室温下取出芯片，放在洗液1（Agilent试剂盒的试剂）中，设置250rpm，在室温下震荡清洗5min；接着再用洗液2（Agilent试剂盒的试剂），设置200rpm，在39℃下震荡清洗1min，最后去除芯片表面的液体，并在4h内扫描。
信号检测及结果判读
（1）扫描及特征提取：清洗后的芯片使用安捷芯片扫描仪在Multi-TIFF模式下进行扫描，得到芯片特征数据（tiff图片格式，一个样片如图2所示），接着使用特征提取软件（Agilent Feature extraction）v12.1从tiff文件中提取信号特征，得到探针信号特征数据。
（2）数据质检：对上一步的探针信号特征数据进行质检，设置信号检出阈值为100，若：a)所有阴性对照探针均未检出（荧光信号值均低于机器检出阈值）；b)检出了50%以上的阳性对照探针；c）所有全局质控探针均检出，且均未出现信号过饱和，则本次检测数据质检合格。
（3）数据质控：a）检出高于检测信号阈值（信号值100）的全局质控探针和寄生虫探针；b）计算全局质控探针的信号平均值QC_intensitymean；c）荧光信号值的标准化处理：对每一个检出的寄生虫探针i（Parasitei）按公式1校正探针信号值，并得到质控数据：
Correct_Parasitei_intensity=Parasitei_intensity/QC_intensitymean (公式1)。
（4）寄生虫检出判定：因寄生虫探针均重复了5次，故针对特定寄生虫：a)首先统计重复检出次数大于等于3的探针；b)然后统计符合a条件的探针数目；c）若b中统计的探针数量大于等于2，则认为该寄生虫检出阳性。
（5）实验结果判定标准如下：
a）若核酸提取的质检未能通过质量标准，即核酸浓度低于20ng/μL或A260/A280低于1.2。则该样本实验处理不合格，重新进行样本实验处理环节；
b）若核酸提取的质检符合质量标准，但核酸扩增后的核酸总量低于4μg或大于8μg，以及荧光标记比活度低于10或高于30，表明核酸扩增及荧光标记步骤未能通过质量标准，该样本实验处理不合格，仅展示实验质检报告；
c）若核酸提取的质检、核酸扩增、荧光标记步骤均符合质量标准，则进行完整的芯片杂交实验，芯片扫描后，进行数据质检，若数据质检不合格，则仅展示实验和生信质检报告；
d）若a，b，c均通过质量标准，则进行数据质控分析、寄生虫检出判定分析，并得到食源性致病寄生虫鉴定结果。
利用上述方法，待测样本的检测结果如表7所示：
表7 实施例3的食源性致病寄生虫检出结果
Figure 261822DEST_PATH_IMAGE010
表7说明：-表示未检出
经过分析发现样本1存在微小隐孢子虫的污染，而样本4存在刚地弓形虫的污染。
实施例 4 基因芯片检测寄生虫方法的时效性
为了测试本发明实施例3利用基因芯片检测寄生虫的方法的运算时间，首先将收集的5例疑似食源性致病寄生虫感染的脑脊液标本一分为二，其中一份标本使用本发明进行检测（按实施例3的处理方法），另一份进行宏基因组测序，测20Mb reads，宏基因组计算分析采用12个CPU。最后比较基因芯片检测与宏基因组测序基因检测的检测周期的差异。
结果如表8所示：
表8 基因芯片检测方法与宏基因组测序基因检测的时效性对比表
Figure 838690DEST_PATH_IMAGE011
从表8可知，宏基因组测序基因检测方法全流程耗时~26h，而利用基因芯片检测仅需10h，周期缩短了2.5倍。此外，基于基因芯片的数据分析及报告解读均要比宏基因组测序基因检测方法更为简单，故应用的门槛更低，可更为快速检测待测样本中潜在致病寄生虫的效果。
实施例 5 基因芯片检测寄生虫方法的准确性
为了验证本发明实施例3利用基因芯片检测寄生虫的方法的准确性，发明人收集了5例临床诊断和PCR检测结果均指征发生食源性致病寄生虫感染的脑脊液标本（样本1-5），另外采集1例健康人唾液样本（样本6）作为阴性对照。所有标本一分为二，其中1份标本使用实施例3的基因芯片检测方法进行检测；另一份进行宏基因组测序基因检测分析方法进行检测。比较基因芯片检测方法与宏基因组测序基因检测方法的检测结果的差异。
利用实施例3描述的基因芯片检测方法进行检测，其核酸提取、核酸总量、荧光标记比活度、信号数据质检均通过标准，故进行后续的数据分析与结果判定。结果如表9所示：
表9 基因芯片检测方法与宏基因组测序基因检测方法的病原检出对比
Figure 740044DEST_PATH_IMAGE012
注：+表示检出（阳性）；-表示未检出/发现（阴性）
从表9可了解到，基因芯片的检测灵敏性和特异性均为100%，而宏基因组测序的特异性为100%，但灵敏性仅为80%（4/5）。
上述结果表明，本发明设计的特异性探针检测4种食源性致病寄生虫更为灵敏，尤其适用于病原微生物载量低的情况。此外，本发明的基因芯片可以对引起食源性疾病的4种寄生虫进行准确的检测，灵敏性和特异性均表现优异，可以用于食源性致病寄生虫的快速筛查。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广东美格基因科技有限公司
<120> 一种检测4种食源性致病寄生虫的探针、芯片、试剂盒及方法
<130> AJ2010277
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 7
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
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<211> 50
<212> DNA
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<400> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<211> 50
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gatgggtggg atagctaagt cctcacgaca tgtatcggag acaatcaatt 50
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
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<400> 23
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<210> 24
<211> 50
<212> DNA
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<211> 50
<212> DNA
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<210> 26
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<400> 26
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<210> 27
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<400> 27
atccacatgc tccaccgctt gtgcgggacc ccgtcaattc ctttgagttt 50
<210> 28
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<212> DNA
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<400> 28
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<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggccacactg gaactgaaac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 50
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgaaatg ttgggttaag 50

Claims (11)

1.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、猪肉绦虫和刚地弓形虫的探针组合，其中，检测广州管圆线虫的探针包括分别由SEQ IDNo.1～6所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种；检测微小隐孢子虫的探针包括分别由SEQ ID No.7～12所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种；检测猪肉绦虫的探针包括分别由SEQ ID No.19～24所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种；检测刚地弓形虫的探针包括分别由SEQ ID No.13～18所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括有阴性对照探针。
3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述阴性对照探针包括由SEQ IDNo.25所示核苷酸序列组成的探针。
4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括全局质控探针。
5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述全局质控探针包括由SEQ IDNo.26所示核苷酸序列组成的探针。
6.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括阳性对照探针。
7.根据权利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针包括分别由SEQ IDNo.27～32所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种。
8.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括检测4种食源性致病寄生虫的探针组合，还包括阴性对照探针、全局质控探针和阳性对照探针，其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫，检测广州管圆线虫的探针包括分别由SEQ ID No.1～6所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种；检测微小隐孢子虫的探针包括分别由SEQ ID No.7～12所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种；检测刚地弓形虫的探针包括分别由SEQ ID No.13～18所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种；检测猪肉绦虫的探针包括分别由SEQ ID No.19～24所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种，所述阴性对照探针包括由SEQ ID No.25所示核苷酸序列组成的探针，所述全局质控探针包括由SEQ ID No.26所示核苷酸序列组成的探针，所述阳性对照探针包括分别由SEQ ID No.27～32所示核苷酸序列组成的探针中的至少一种。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～8任一所述的基因芯片。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括待测样本基因组DNA提取试剂、核酸扩增试剂、荧光标记试剂和/或纯化试剂。
11.一种检测食源性致病寄生虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获取待测样本的基因组DNA；
S2，对获取的基因组DNA进行核酸扩增、荧光标记并进行纯化；
S3，利用权利要求8所述的基因芯片进行杂交检测；
S4，根据检测到的探针信号判断检测结果。
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