CN112501188A

CN112501188A - 水稻生长素糖基转移酶基因在培育耐淹水稻品种中的应用

Info

Publication number: CN112501188A
Application number: CN202011389564.0A
Authority: CN
Inventors: 何永奇; 王州飞; 赵佳; 孙珊; 黄成威
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112501188B

Abstract

本发明公开了水稻生长素糖基转移酶基因在培育耐淹水稻品种中的应用。所述的基因OsIAGLU核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及编码相应的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明在水稻中首次报道了OsIAGLU基因能调控淹水条件下胚芽鞘的生长，通过试验表明突变该基因降低种子淹水条件下胚芽鞘生长能力，过量表达该基因提高种子淹水条件下胚芽鞘生长能力。证明本发明OsIAGLU基因调控了水稻淹水下种子胚芽鞘的生长，利用该基因有助于筛选和培育耐淹水稻品种，有利于直播稻生产。

Description

水稻生长素糖基转移酶基因在培育耐淹水稻品种中的应用

技术领域

本发明属于种子生物技术领域，涉及水稻生长素糖基转移酶基因的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国栽培历史最悠久的粮食作物之一。近年来，随着经济的发展，农村劳动力日益短缺，直播稻生产变得越来越普遍。直播稻生产中，由于整地不平或者种子直播后遇到淹水情况会导致种子发芽率降低、田间成苗差、幼苗长势参差不齐，甚至会严重影响作物产量。生长素是调控植物生长发育的重要因子，有关生长素糖基转移酶基因调控水稻耐淹的研究未有报道，有关利用生长素糖基转移酶基因筛选和培育耐淹水稻品种的应用也未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个控制水稻耐淹的生长素糖基转移酶基因OsIAGLU的分离克隆、功能验证和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的一个来自水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU编码的蛋白，其氨基酸序列SEQID NO.2所示。

本发明所述的水稻OsIAGLU基因或蛋白在筛选或培育耐淹水稻品种中的应用。

所述的水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU在提高水稻种子耐淹性，促进淹水条件下水稻胚芽鞘生长中的应用。

所述的应用优选，过表达OsIAGLU基因以提高水稻的耐淹性。

本发明所述的水稻OsIAGLU基因突变体获得和基因功能验证，包括如下步骤：

(1)获得水稻OsIAGLU基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)设计靶位点及其引物，以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得MT1T2-PCR载体；

(3)将步骤(2)得到的带有OsIAGLU基因的目标片段的MT1T2-PCR胶回收产物构建到pHUE411载体上，获得pHUE411+MT1T2-PCR载体；

(4)将步骤(3)得到的带有OsIAGLU基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；

(5)水稻突变体筛选与鉴定，并在淹水条件下鉴定表型。

进一步的，在步骤(1)中利用水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，所述PCR的上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步的，在步骤(2)中构建的水稻OsIAGLU CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列(OsIAGLU基因中19bp的目标片段)如序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增的引物序列如序列表SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10；

在步骤(3)中，用BsaI酶切pHUE411载体，利用同源重组法获得pHUE411+MT1T2-PCR载体。

在步骤(5)中，筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.12所示。水稻耐淹鉴定包括淹水条件下胚芽鞘的长。

本发明所述的水稻OsIAGLU基因过表达材料的获得和基因功能验证，包括如下步骤：

(1)获得水稻OsIAGLU基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)以水稻cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得OsIAGLU基因CDS片段；

(3)将步骤(2)获得OsIAGLU基因CDS片段，利用带同源重组接头的引物进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得带同源重组接头的CDS片段；

(4)将步骤(3)得到的带有OsIAGLU基因的目标片段构建到pUN1301体上，获得重组质粒；

(5)将步骤(4)得到的带有OsIAGLU基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；

(6)水稻过表达材料筛选与鉴定，并在淹水条件下鉴定表型。

进一步的，在步骤(2)中利用水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，所述PCR的上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步的，在步骤(3)中利用OsIAGLU基因CDS片段为模板PCR克隆出该基因带同源重组接头的引物序列，所述PCR的上游引物序列如序列表SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.14所示。

进一步的，在步骤(4)中，用KpnI和SacI酶切pUN1301载体，利用同源重组法获得重组载体。

在步骤(6)中，利用潮霉素抗性标签筛选阳性过表达材料所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.16所示。水稻耐淹鉴定包括淹水条件下胚芽鞘的长。

本发明所述的一种检淹水条件下OsIAGLU基因表达水平的方法，包括如下步骤：

(1)取不同淹水时间水稻种子；

(2)用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；

(3)用

II Reverse Transcriptase system(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；

(4)用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.17所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.18所示。

进一步的，在步骤(1)中水稻种子在8cm深淹水中25℃条件下培养，分别在淹水0、12、24、36、48、60、72、96h后取样；种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃，每个时间点取样三份。

在步骤(4)中，采用水稻内参基因OsActin引物，所述上游引物的序列如序列表SEQID NO.19所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.20所示。

有益效果：

(1)本发明从水稻中分离、克隆获得OsIAGLU基因，通过构建CRISPR/Cas9突变体首次证明了该基因参与水稻种子耐淹调控。

(2)本发明为筛选耐淹水稻品种提供了基础，也为改良提高水稻种子耐淹提供了重要的基因资源，对生产具有重要意义。

因此，利用参与水稻种子耐淹调控的生长素糖基转移酶基因OsIAGLU，对筛选和培育耐淹水稻品种提供帮助，对直播稻生产具有重要意义。

附图说明

图1：水稻OsIAGLU基因在淹水不同时间中的表达情况

图2：水稻OsIAGLU突变体和过表达材料在淹水条件下的表现

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由广州天一辉远基因科技有限公司完成；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、Tag DNA聚合酶、dNTPs等购自广州硕恒生物科技有限公司；反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于北京擎科生物科技有限公司，方法均参照说明书进行。

实施例1：基因克隆

利用粳稻品种日本晴cDNA为模板PCR克隆出OsIAGLU基因的序列，PCR的上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。获得水稻OsIAGLU基因的核苷酸序列及氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。

实施例2：种子淹水不同时间OsIAGLU基因表达分析

利用粳稻品种日本晴，每次重复挑选健康饱满的种子15粒，用0.1％的氯化汞溶液表面消毒5min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，置于试管中，加入8cm深的蒸馏水，放置25℃条件下光照/黑暗各12h培养，淹水0、12、24、36、48、60、72、96h后，分别取样。种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。试验重复3次。

用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；用

II Reverse Transcriptase system(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测OsIAGLU的引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.17所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.18所示。采用水稻内参基因OsActin引物，所述上游引物的序列如序列表SEQ ID NO.19所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.20所示。结果表明，在种子淹水过程中OsIAGLU基因的表达量存在上升的变化趋势(图2)。在种子淹水72h时，OsIAGLU基因表达最高。可见，该基因在种子淹水过程中得到诱导表达，基因表达对种子提高耐淹性具有重要作用。

实施例3：突变体构建

登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶点。靶点序列如序列列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，以靶点序列设计引物，引物结构如序列列表SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10。以pCBC-MT1T2为模板进行四引物PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得MT1T2-PCR载体。用BsaI酶切pHUE411载体，利用同源重组法将MT1T2-PCR胶回收产物构建到pHUE411载体上，获得pHUE411+MT1T2-PCR载体。

得到的含有pHUE411+MT1T2-PCR载体的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化野生型的粳稻品种日本晴；利用PCR扩增产物测序，与野生型比对，筛选纯合突变体，所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.12所示。

实施例4：过表达转基因材料构建

以水稻cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得OsIAGLU基因CDS片段，所述PCR的上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。将获得OsIAGLU基因CDS片段为模板，利用带同源重组接头的引物进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得带同源重组接头的CDS片段，所述PCR的上游引物序列如序列表SEQ IDNO.13所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.14所示。利用同源重组法把带有OsIAGLU基因的目标片段构建到pUN1301载体上，获得重组质粒；将重组质粒转化农杆菌，将带有转化质粒的农杆菌转化野生型的粳稻品种日本晴；利用PCR扩增潮霉素抗性标签筛选阳性过表达材料，所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如序列表SEQ IDNO.16所示。

实施例5：基因突变体和过表达转基因材料表型分析

利用构建的OsIAGLU CRISPR/Cas9突变体osiaglu-1、osiaglu-2、osiaglu-3，过表达OE-1、OE-2、OE-3和野生型日本晴(WT)水稻品种，进行耐淹试验。具体方法如下：每次重复挑选健康饱满的种子15粒，用0.1％的氯化汞溶液表面消毒5min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，置于试管中，加入8cm深蒸馏水，放置25℃条件下光照/黑暗各12h培养9d后，最后统计胚芽鞘长。试验重复3次。结果表明，与野生型比较，突变OsIAGLU基因显著降低了种子淹水条件下胚芽鞘的长度，过量表达OsIAGLU基因可以显著提高种子淹性条件下胚芽鞘的长度(图1)。可见，该基因对提高种子耐淹具有重要作用。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻生长素糖基转移酶基因在培育耐淹水稻品种中的应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1515

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgcatttct tgatcgtgtc gggggcggcg caggggcaga tcacgccggc gaggcggctg 60

gcgcgcgcgc tggtggcggc ggcggagcct ggggtgatca tcagggccac gctggccgtg 120

ccgctgtcgg cgctgaggag gatgttcccc gggaaggcgg ccggcgcagc cgccggtgaa 180

ggggccgtgg tgctgtcgga cggggccggc gtcgactacg ccgcgttcac cgacgggttc 240

gacgacgggt tccagcccga gcggtgcgac ggcgcggcgt tcgtcgggag gctccagctc 300

gtcggcccgg cgtcgctggc ccggctggcg gcggcgctgc gcgcgcgggg gaggcccgtg 360

acgtgcgtcg tgtacaccct gctccttccg ttcgccgccg ccgtcgccag ggacctcgac 420

gtgccggcgt acttcttctg gaccatgccg gcggccgtgc tttcagtcta ctaccattac 480

ttccacggcc gccatggcct cgtcgacgcc gccgccggag tccgggacga ccccaaccgc 540

cgcgtccaag tccccggcct cgagttcctc cgcgcccgcg acctcccgtc gctgctcacc 600

gggtcaagcc cctacctccc ggccttccgg gagatgttcc acgtcgtcga ggccaccgcc 660

gccgcgtcgt gccatgccca tggccagagt ggcgcgaagc cgtgggtgct tgtgaacacc 720

ttcgacgcgc tcgagccgaa ggcgctcgcg tccgtccccg gcattgacct catcccggtt 780

ggacccatgg tcaccgacac ggaggccgac ggcggcggcg acctcttcga gcaagacgac 840

gacgcaggct acatgcaatg gctcgacaag cagcgggacg cctccgtcgt gtacgtcgcg 900

ttcggcagcc tcgccgtgct ctcgccgagg cagctggagg agatacgcca ctgcctcgag 960

gtgaccggac ggcccttcct ctgggtggtc cggcgcgaca gccgcgacgg cggcggcggc 1020

ggcggcgcgg ccaccggatt attgccgccg gcaggcggga tggtggtgga gtggtgcagc 1080

caggcgcgcg tgctggcgca ccgggcggtg gggtgcttcg tcacccactg cgggtggaac 1140

tcgacgctgg agaccgtcgc gtgcggcgtg ccagcggtaa tggcgccgca gtggtccgac 1200

caggcgacga acgcgcgcat ggccgaggcg cggtggggcg tcggcgtgcg cgcggagacc 1260

gcggccgacg gcaccgtgct ctcgtcggag ctctcacgcg gcatcgacgc cgtcatgggg 1320

gacagcgacg gcgcccgcgc gatacgccgg cgcgcaagaa catggaaggc gcgcgccgcc 1380

atggcgctgg acgccgccgc cgacgacgcc gagtttgacg gggacgccac ggcggcgcgc 1440

aacctgagac gatttgtgca gggcgtacgt agcagagaac gggagcgcga gcaaaagcaa 1500

gcagggcaga gttaa 1515

<210> 2

<211> 504

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met His Phe Leu Ile Val Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln Ile Thr Pro

1 5 10 15

Ala Arg Arg Leu Ala Arg Ala Leu Val Ala Ala Ala Glu Pro Gly Val

20 25 30

Ile Ile Arg Ala Thr Leu Ala Val Pro Leu Ser Ala Leu Arg Arg Met

35 40 45

Phe Pro Gly Lys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Glu Gly Ala Val Val

50 55 60

Leu Ser Asp Gly Ala Gly Val Asp Tyr Ala Ala Phe Thr Asp Gly Phe

65 70 75 80

Asp Asp Gly Phe Gln Pro Glu Arg Cys Asp Gly Ala Ala Phe Val Gly

85 90 95

Arg Leu Gln Leu Val Gly Pro Ala Ser Leu Ala Arg Leu Ala Ala Ala

100 105 110

Leu Arg Ala Arg Gly Arg Pro Val Thr Cys Val Val Tyr Thr Leu Leu

115 120 125

Leu Pro Phe Ala Ala Ala Val Ala Arg Asp Leu Asp Val Pro Ala Tyr

130 135 140

Phe Phe Trp Thr Met Pro Ala Ala Val Leu Ser Val Tyr Tyr His Tyr

145 150 155 160

Phe His Gly Arg His Gly Leu Val Asp Ala Ala Ala Gly Val Arg Asp

165 170 175

Asp Pro Asn Arg Arg Val Gln Val Pro Gly Leu Glu Phe Leu Arg Ala

180 185 190

Arg Asp Leu Pro Ser Leu Leu Thr Gly Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Ala

195 200 205

Phe Arg Glu Met Phe His Val Val Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ser Cys

210 215 220

His Ala His Gly Gln Ser Gly Ala Lys Pro Trp Val Leu Val Asn Thr

225 230 235 240

Phe Asp Ala Leu Glu Pro Lys Ala Leu Ala Ser Val Pro Gly Ile Asp

245 250 255

Leu Ile Pro Val Gly Pro Met Val Thr Asp Thr Glu Ala Asp Gly Gly

260 265 270

Gly Asp Leu Phe Glu Gln Asp Asp Asp Ala Gly Tyr Met Gln Trp Leu

275 280 285

Asp Lys Gln Arg Asp Ala Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu

290 295 300

Ala Val Leu Ser Pro Arg Gln Leu Glu Glu Ile Arg His Cys Leu Glu

305 310 315 320

Val Thr Gly Arg Pro Phe Leu Trp Val Val Arg Arg Asp Ser Arg Asp

325 330 335

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Gly Leu Leu Pro Pro Ala Gly

340 345 350

Gly Met Val Val Glu Trp Cys Ser Gln Ala Arg Val Leu Ala His Arg

355 360 365

Ala Val Gly Cys Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu

370 375 380

Thr Val Ala Cys Gly Val Pro Ala Val Met Ala Pro Gln Trp Ser Asp

385 390 395 400

Gln Ala Thr Asn Ala Arg Met Ala Glu Ala Arg Trp Gly Val Gly Val

405 410 415

Arg Ala Glu Thr Ala Ala Asp Gly Thr Val Leu Ser Ser Glu Leu Ser

420 425 430

Arg Gly Ile Asp Ala Val Met Gly Asp Ser Asp Gly Ala Arg Ala Ile

435 440 445

Arg Arg Arg Ala Arg Thr Trp Lys Ala Arg Ala Ala Met Ala Leu Asp

450 455 460

Ala Ala Ala Asp Asp Ala Glu Phe Asp Gly Asp Ala Thr Ala Ala Arg

465 470 475 480

Asn Leu Arg Arg Phe Val Gln Gly Val Arg Ser Arg Glu Arg Glu Arg

485 490 495

Glu Gln Lys Gln Ala Gly Gln Ser

500

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcatttct tgatcgtgtc gg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaactctgc cctgcttgct tt 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccgccttcc cggggaaca 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgatcacc ccaggctcc 19

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aataatggtc tcaggcggcc gccttcccgg ggaaca 36

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggccgccttc ccggggaaca gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgatcacc ccaggctccc gcttcttggt gcc 33

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attattggtc tctaaacgat gatcacccca ggctcc 36

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggcgcaggg gcagatcac 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaccgctcg ggctggaac 19

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gactctagag gatccccggg taccatgcat ttcttgatcg tgtcgg 46

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaacgatcgg ggaaattcga gctcttaact ctgccctgct tgcttt 46

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaaatcac gccatgtagt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

actatccttc gcaagacctt 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcgtacttct tctggaccat gc 22

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gccgtggaag taatggtagt agac 24

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggaaggctg gaagaggacc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgggaaattg tgagggacat 20

Claims

1.水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU在筛选或培育耐淹水稻品种中的应用。

2.权利要求1所述的水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU在提高水稻种子耐淹性，促进淹水条件下水稻胚芽鞘生长中的应用。