CN112493127A

CN112493127A - 一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法

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Publication number: CN112493127A
Application number: CN202011330701.3A
Authority: CN
Inventors: 韩金玲; 李向岭; 张敏; 王健; 杨晴; 杨敏
Original assignee: Hebei Normal University of Science and Technology
Current assignee: Hebei Normal University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112493127B

Abstract

本发明涉及一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法，属于可食用植物生物技术领域。本发明利用荷兰豆的幼胚或子叶诱导产生体细胞胚并建立再生植株无性系，步骤包括：1、荷兰豆荚果的无菌消毒处理及外植体的选取；2、愈伤组织的诱导；3、胚性愈伤组织的诱导；4、体细胞胚的发生及发育；5、体细胞胚的增殖及生根；6、移栽成苗。本发明提供的可食用植物荷兰豆的体细胞胚诱导及植株再生方法，为荷兰豆快繁加速产业化生产，及荷兰豆遗传转化、基因改良等研究奠定基础。

Description

一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法

技术领域

本发明涉及可食用植物生物技术领域，具体提供一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法。

背景技术

荷兰豆又名软荚豌豆、食荚豌豆、青荷兰豆、小寒豆、淮豆、麻豆、青小豆、留豆、金豆、回回豆等，是豆科中以嫩豆粒或嫩豆荚供菜食的蔬菜。荷兰豆还含有一种其特有的植物凝集素、止杈素及赤霉素GA20等，这些物质对增强人体新陈代谢功能有重要作用。荷兰豆具有很高的经济利用价值，必将成为具有竞争力的商品，有计划、科学的开发利用会收到良好的社会效益其应用前景广阔。

通过体细胞胚发育成植株是细胞工程的一大进步，迄今已有200多种植物通过体细胞胚方式再生植株，在我国已成功的将杂交鹅掌楸体细胞胚发生技术应用于产业化生产，带来显著的社会效益。而国内外学者对荷兰豆的研究仅限制于它的栽培、种子萌发、杂交育种、抗性品种及种质资源调查等方面的研究，有关荷兰豆体细胞胚再生系统的建立目前在国内外尚未见报道。因此，利用细胞工程快繁技术开发出一种稳定、可控的荷兰豆体细胞胚发生、发育及生根体系，对于实现荷兰豆快繁加速产业化生产奠定理论基础和提供切实可行的方法来说尤为必要。同时，为今后其它豆科植物人工种子和远源杂交的研究探索提供理论基础及技术。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法，本发明通过自主研发的体细胞胚诱导方法，成功诱导出了胚状体并萌发发育成苗。

本发明提供一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法，包括：

步骤1)荷兰豆荚果的无菌消毒处理及外植体的选取；2)愈伤组织的诱导；3)胚性愈伤组织的诱导；4)体细胞胚的发生及发育；5)体细胞胚的增殖及生根；6)移栽成苗。

进一步地，针对步骤1)，其特征在于，无菌消毒处理具体为：将荷兰豆荚果经酒精、升汞溶液、无菌水浸泡、冲洗、干燥；所述外植体为荚果的幼胚或子叶。

进一步地，针对步骤2)，其特征在于，愈伤组织的诱导具体为：将步骤1)所得幼胚或子叶剪成1.0-2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上，在恒温25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。

所述步骤2)中，愈伤组织诱导培养基为：MS+0.5mg/l BA+0.3mg/l IBA。

进一步地，针对步骤3)，其特征在于，胚性愈伤组织的诱导具体为：将步骤2)所得的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+0-3.0mg/l BA或MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+0-3.0mg/l KT，优选为MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+2.0mg/l BA。

进一步地，针对步骤4)，其特征在于，体细胞胚的发生及发育具体为：将步骤3)所得的胚性愈伤组织接种于体细胞胚诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养；所述体细胞胚诱导培养基为：MS+0.4mg/l 2,4-D+0-2.0mg/l KT或MS+0-0.7mg/l KT+0.4mg/l NAA/IBA或MS+0-0.7mg/l BA+0.4mg/l NAA/IBA或MS₀。

优选的，体细胞胚诱导培养基为：MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+2.0mg/l BA。

进一步地，针对步骤5)，其特征在于，体细胞胚的增殖及生根具体为：当步骤4)中的体细胞胚接种到增殖培养基上继续培养，待幼苗长到3cm以上时，将幼苗接种到诱导生根的培养基中，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。

体细胞胚增殖培养基优选为MS+2.0mg/l ZT。

体细胞胚生根培养基优选为1/2MS+1.0mg/l NAA。

进一步地，针对步骤6)，其特征在于，移栽成苗具体为：当步骤5)中的幼苗根长达到1.0-1.3cm，有3-5片真叶展开时，经炼苗后移栽。

所有培养基中的加添的蔗糖浓度均为30g/L，琼脂均为9g/L，pH均为5.7-5.8。

此外，本发明还公开了以上任一所述的荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法在荷兰豆遗传转化体系建立、原生质体培养、优良无性系繁殖、基因工程和突变体筛选中的用途。

本发明的有益效果在于：

本发明首次提出可食用植物荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法，愈伤组织及体细胞胚的诱导率均接近100％，为荷兰豆通过体细胞胚发生方式获得再生植株提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有较好的社会经济效益。

本发明处于领先地位，对于实现荷兰豆体细胞胚的工厂化育苗奠定理论基础和提供切实可行的方法来说尤为必要，也为其它豆科植物人工种子和远源杂交的研究探索提供理论基础及技术。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为胚性愈伤组织；

图2-3为培养10天时，在(16)号体细胞胚诱导培养基中获得的球形胚；

图4为培养30天后，在(16)号体细胞胚诱导培养基中获得的心形胚；

图5为培养30天后，在(16)号体细胞胚诱导培养基中获得的鱼雷胚；

图6为培养30天后，在(16)号体细胞胚诱导培养基中获得的子叶胚；

图7为培养30天后，在(16)号体细胞胚诱导培养基中获得的成熟体细胞胚；

图8-10为培养30天后，在(16)号体细胞胚诱导培养基中获得的幼苗；

图11为在体细胞胚增殖培养基上形成的3cm以上的幼苗；

图12为培养15天后，在(3)号诱导生根培养基上的生根情况。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明所述内容作进一步详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或更变，均应包括在本发明的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、荷兰豆无菌培养体系的建立

试验材料为购买于超市的荷兰豆幼嫩荚果。选取长势好的荷兰豆荚果在流水下轻轻刷洗表面污物，然后用滤纸吸干水后置于干净的烧杯中。用75％的酒精浸泡30s后迅速倒掉，浸入0.1％升汞溶液灭菌10min，在超净工作台上用无菌水冲洗5-6次，待接种材料表面水分沥干后剪去荚果边缘部分取其幼胚或子叶作为外植体。

实施例2、愈伤组织的诱导

将实施例1中的幼胚或子叶剪成1.0-2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上。愈伤组织诱导培养基为MS+0.5mg/l BA+0.3mg/l IBA。

并且，培养基中含3％的蔗糖，0.9％琼脂，加琼脂前将pH调至5.5-5.7，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。恒温25℃黑暗条件下分别培养10d、20d、30d至诱导出愈伤组织。

15天后，整个子叶逐渐膨大，切口处出现皱褶，20天后在切口处开始产生质地疏松、颗粒状、呈乳黄色(乳白色)的愈伤组织，30天后整个子叶愈伤化产生大量愈伤组织。

实施例3、胚性愈伤组织的诱导

将实施例2中诱导的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基在MS培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)MS+4mg/l 2,4-D+2.0mg/l NAA

(2)MS+4mg/l 2,4-D+2.0mg/l BA

(3)MS+4mg/l 2,4-D+2.0mg/l KT

(4)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+0.5mg/l BA

(5)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+0.5mg/l KT

(6)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+1.0mg/l BA

(7)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+1.0mg/l KT

(8)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+2.0mg/l BA

(9)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+2.0mg/l KT

(10)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+3.0mg/l BA

(11)MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+3.0mg/l KT

(12)MS₀

并且，培养基中含3％的蔗糖，0.9％琼脂，加琼脂前将pH调至5.5-5.7，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在15-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下培养25d以上至诱导出胚性愈伤组织。

在12种培养基中，BA、KT分别与2,4-D、NAA组合时，当两种细胞分裂素在1.0～2.0范围内时，BA的组合诱导率均高于KT，当BA浓度为2.0mg/l时诱导率最佳，其诱导率为100％。生长素2,4-D与NAA、KT、BA分别组合时同样是与BA组合最佳。但是没有NAA的参与时，其胚性愈伤诱导率减少了28.12％，说明少量的NAA有利于胚性愈伤组织的诱导(表1)。

不同激素组配方式及不同质量浓度对愈伤组织质量影响不同，经解剖镜下观察分为淡黄色，疏松颗粒状称其为胚性愈伤(图1)。(8)号培养基处理时，生长速度较快，胚性愈伤组织呈现乳白色、松软状态，经显微镜观察其细胞质稀薄，液泡较大，经继代培养也能诱导产生少量胚性愈伤。

表1不同质量浓度激素对荷兰豆诱导胚性愈伤组织的影响单位：mg/l

同时不同温度对胚性愈伤的诱导及其体细胞胚产生也有着不同的影响，结果分析(表2)，将质地疏松乳黄色或乳白色的愈伤组织接种后进行15℃、20℃培养，在25天后却以15℃的胚性愈伤发生率效果好。在第40天时可以观察体胚的发生。在15℃培养时，(8)培养基中发育出了心形胚、子叶胚，(9)培养基发育出了心形胚、鱼雷胚。20℃培养时其进程较15℃慢一个时期。其余培养基中多数为胚性愈伤组织，极少数为球形胚。

表2不同温度对荷兰豆胚性愈伤发生的影响单位：mg/l

实施例4、体细胞胚的发生及发育

将实施例3中胚性愈伤组织接种于体细胞胚诱导培养基上，体细胞胚诱导培养基在MS培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)MS+0.4mg/l 2,4-D

(2)MS+0.4mg/l 2,4-D+1.0mg/l KT

(3)MS+0.2mg/l KT

(4)MS+0.4mg/l 2,4-D+0.2mg/l KT

(5)MS+0.7mg/l KT+0.4mg/l IBA

(6)MS+0.7mg/l KT+0.4mg/l NAA

(7)MS+0.5mg/l KT+0.4mg/l IBA

(8)MS+0.5mg/l KT+0.4mg/l NAA

(9)MS+4mg/l 2,4-D+1.0mg/l KT+0.2mg/l NAA

(10)MS+0.3mg/l KT+0.4mg/l NAA

(11)MS+0.7mg/l BA+0.4mg/l IBA

(12)MS+0.7mg/l BA+0.4mg/l NAA

(13)MS+0.5mg/l BA+0.4mg/l IBA

(14)MS+0.5mg/l BA+0.4mg/l NAA

(15)MS+0.5mg/l BA+0.3mg/l IBA

(16)MS+0.5mg/l BA+0.3mg/l NAA

(17)MS+0.3mg/l BA+0.4mg/l NAA

(18)MS+0.3mg/l BA+0.4mg/l IBA

(19)MS₀

并且，培养基中含3％的蔗糖，0.9％琼脂，加琼脂前将pH调至5.5-5.7，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在23-25℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导体细胞胚萌发并发育。分别在培养10d、20d、30d时，在解剖镜下进行观察。

将胚性愈伤组织接种于19个不同的培养基中，(16)号培养基中体胚诱导率最高达83.33％(表3)。10天后经解剖镜观察为球形胚(图2、3)，继续培养到30天后可依次观察到心形胚、鱼雷胚、子叶胚、成熟胚以至发育到最后形成幼芽(图4-10)。而(14)、(17)号培养基中BA浓度分别为0.5mg/l、0.3mg/l与0.4mg/l NAA组合时诱导效果次之，诱导率分别为60.00％、63.33％，培养到10天时经解剖镜观察为球形胚，继续培养到30天可依次观察到心形胚、鱼雷胚、子叶胚而没有发现成熟胚。(1)～(13)号培养基处理10天后进行解剖镜下观察只看到原胚，继续培养到30天，只有(13)号处理观察到鱼雷胚，(1)～(12)号培养基处理只发育到心型胚。(18)～(19)号培养基处理也是如此。这说明细胞分裂素(BA、KT)与生长素同等浓度混合使用时，BA组合效果要优于KT组合，能够促使体细胞胚发育到成熟胚。同时BA与IBA、NAA组合时则以NAA的效果最优(表4)。

表3不同质量浓度激素对荷兰豆体细胞胚诱导的影响单位：mg/l

表4不同质量浓度激素对荷兰豆体细胞胚发育期的观察单位：mg/l

实施例5、体细胞胚的增殖及生根

当实施例4中的成熟体胚接种到增殖培养基中继续培养20天后发育成苗。当幼苗长到3cm以上，有4片展开叶时，将幼苗切下分别接种到诱导生根的培养基中，增殖培养基在MS培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)MS+0.5mg/l ZT

(2)MS+1.0mg/l ZT

(3)MS+2.0mg/l ZT

(4)MS+3.0mg/l ZT

(5)MS+0.5mg/l BA

(6)MS+1.0mg/l BA

(7)MS+2.0mg/l BA

(8)MS+3.0mg/l BA

诱导生根培养基在1/2MS培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)1/2MS+0.5mg/l NAA

(2)1/2MS+0.5mg/l IBA

(3)1/2MS+1.0mg/l NAA

(4)1/2MS+1.0mg/l IBA

(5)1/2MS+1.5mg/l NAA

(6)1/2MS+1.5mg/l IBA

(7)1/2MS+2.0mg/l NAA

(4)1/2MS+2.0mg/l IBA

并且，培养基中含3％的蔗糖，0.9％琼脂，加琼脂前将pH调至5.5-5.7，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导体细胞胚生根。

增殖培养基中含有0.5mg/l-3.0mg/l ZT时能促进芽的生长，当ZT浓度范围在0.5-2.0mg/l之间时，随着质量浓度的提高，ZT对芽的诱导效应有不断增强的趋势；当ZT浓度为3.0mg/l时，芽的生发又趋于缓慢，成芽率也有此趋势。以(3)号增殖培养基处理的效果最好(表5)，此时萌芽率、成芽率达100％。使用细胞分裂素BA时，浓度在0.5-2.0mg/l时能够诱导芽的产生，以(6)号增殖培养基处理的效果最好，成芽率达60％，但其萌芽率和成芽率均不如ZT，说明ZT的活性优于BA。

表5细胞分裂素对荷兰豆幼芽增殖的影响单位：mg/l

当幼苗长到3cm以上时(图11)，展开叶4片将其切下并带生长点接种于诱导生根培养基中，培养基中含有0.5-2.0mg/l NAA或0.5-2.0mg/l IBA时，10-15天后即可生根(表6)。

不同生长素种类和浓度对荷兰豆诱导生根存在着影响，NAA在0.5-1.0mg/l范围内，随着NAA质量浓度的增加，生根率也随之增加，当NAA为1.0mg/l时(3号培养基)生根率最高(图12)，为87.50％。IBA为0.5mg/l时，幼苗的平均根长和根条数最高，但根系细弱。当IBA的质量浓度增加到1.0mg/l时则产生愈伤(4号培养基)，用IBA诱导生根的效果差于NAA。

表6不同生长激素对生根诱导的影响

实施例6、移栽成苗

当实施例5中(3)号生根培养基上的幼苗根长达到1.5～2.0cm，有6片真叶展开时，可以将小苗移栽入已灭菌的蛭石中。移栽时将根部的培养基冲洗干净，并尽量少损伤根系。移栽后浇透水，防止小苗失水死亡，加盖薄膜，保持水分在80％-90％之间，温度为20±1℃。在小苗展开新叶前，每天喷洒清水，待有新叶长出后可以适量施用营养液，促进苗壮。

Claims

1.一种荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)荷兰豆荚果的无菌消毒处理及外植体的选取；2)愈伤组织的诱导；3)胚性愈伤组织的诱导；4)体细胞胚的发生及发育；5)体细胞胚的增殖及生根；6)移栽成苗。

2.如权利要求1所述的方法，针对步骤1)，其特征在于，无菌消毒处理具体为：将荷兰豆荚果经酒精、升汞溶液、无菌水浸泡、冲洗、干燥。

3.如权利要求1所述的方法，针对步骤1)，其特征在于，所述外植体为荚果的幼胚或子叶。

4.如权利要求1所述的方法，针对步骤2)，其特征在于，愈伤组织的诱导具体为：将步骤1)所得幼胚或子叶剪成1.0-2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上，在恒温25℃黑暗条件下诱导愈伤组织；

所述愈伤组织诱导培养基为：MS+0.5mg/l BA+0.3mg/l IBA。

5.如权利要求1所述的方法，针对步骤3)，其特征在于，胚性愈伤组织的诱导具体为：将步骤2)所得的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导胚性愈伤组织；

所述胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+2.0mg/l BA。

6.如权利要求1所述的方法，针对步骤4)，其特征在于，体细胞胚的发生及发育具体为：将步骤3)所得的胚性愈伤组织接种于体细胞胚诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养；

所述体细胞胚诱导培养基为：MS+0.4mg/l 2,4-D+0-2.0mg/l KT或MS+0-0.7mg/l KT+0.4mg/l NAA/IBA或MS+0-0.7mg/l BA+0.4mg/l NAA/IBA或MS₀，优选为MS+4mg/l 2,4-D+0.2mg/l NAA+2.0mg/l BA。

7.如权利要求1所述的方法，针对步骤5)，其特征在于，体细胞胚的增殖及生根具体为：当步骤4)中的体细胞胚接种到增殖培养基上继续培养，待幼苗长到3cm以上时，将幼苗接种到诱导生根的培养基中，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养；

所述增殖培养基为：MS+2.0mg/l ZT；

所述诱导生根培养基为：1/2MS+1.0mg/l NAA。

8.如权利要求1所述的方法，针对步骤6)，其特征在于，移栽成苗具体为：当步骤5)中的幼苗根长达到1.0-1.3cm，有3-5片真叶展开时，经炼苗后移栽。

9.根据权利要求1-8任一所述的荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，所有培养基中的加添的蔗糖浓度均为30g/L，琼脂均为9g/L，pH均为5.7-5.8。

10.权利要求1-9任一项所述的荷兰豆体细胞胚诱导及植株再生的方法在荷兰豆遗传转化体系建立、原生质体培养、优良无性系繁殖、基因工程和突变体筛选中的用途。