CN112481173B - 一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌gbw-f008及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌GBW‑F008及其应用。所述植物内芽孢杆菌GBW‑F008的分类命名为植物内芽孢杆菌Bacillus endophyticus，保藏编号为CGMCC No.20919，其菌落呈白色，不透明，圆形，边缘整齐，表面湿润光泽，直径1‑5mm；菌体为圆柱状，直径2‑3μm；芽孢近端生呈长椭圆形，周生鞭毛，且生长温度范围较广。所述植物内芽孢杆菌GBW‑F008具有产多种酶类和吲哚乙酸的能力，并可促进番茄种植土壤中速效磷、速效钾的释放，提高土壤游离氨基酸与吲哚乙酸含量，显著提高番茄茎粗、壮苗指数，增加番茄的平均果重，从而提高番茄的产量和品质，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌GBW-F008及其应用。
背景技术
番茄因其果实营养丰富，口感酸甜，多汁液且食用方法多样，深受人们的喜爱。而在番茄种植的过程中，经常会出现番茄果实过小、根系不发达、坐果率低等现象，针对这些问题，果农们常会选择使用激素或农药提升养分，促进植物的生长，但激素或农药不仅会影响番茄的口感，也会使番茄植株出现耐药性，造成土壤污染。
根际细菌是可以利用植物根际包括根系分泌物、裂解物等在内的营养物质进行生长繁殖的一类微生物，还可以通过合成和分泌一些代谢产物到根际，进而影响植物的生长；这些菌有的能利用根系土壤浸液增殖，有的分泌生长素为代表的植物激素类物质；还有的是通过解磷解钾促进土壤中养分释放。但目前，集上述多种功能于一体的、能用于土壤微生物技术的菌类非常少，也就导致了很多微生物产品中使用萘乙酸等激素类物质、海藻糖等营养物质替代微生物用于植物种植，虽然其也会对植物产生促生的作用，但同时也会对土壤和植物造成一定的危害和负面影响。而用于植物种植的微生物菌剂的重点在菌，所以，寻找到一种能在土中存活并定植增殖，同时能够给植物提供促生长类物质或诱导植物分泌生长类激素、辅助土壤释放难溶性磷钾元素等作用的根际菌株势在必行。
发明内容
本发明提供了一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌GBW-F008及其应用。所述植物内芽孢杆菌GBW-F008具有产吲哚乙酸、多种酶类、解磷解钾、低温生长的能力，且能促进植物的生长。
为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌GBW-F008，其分类命名为植物内芽孢杆菌Bacillus endophyticus，保藏编号为CGMCC No.20919。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌落呈白色，不透明，圆形，边缘整齐，表面湿润光泽，直径1-5mm；菌体为圆柱状，直径2-3μm；芽孢近端生呈长椭圆形，周生鞭毛。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的生长温度范围为20～42℃。
优选的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的最适生长温度为37℃。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的生长pH值范围为4.5～9.6。
优选的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的最适生长pH值范围为6.5～7.5。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的生长盐度范围为0-10％。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008具有产吲哚乙酸的能力。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008具有产淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶的能力。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008具有良好的解磷和解钾的能力。
本发明还提供了所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008在用于制备促进植物生长的微生物菌剂中的应用。
进一步的，在应用时，将所述植物内芽孢杆菌GBW-F008制备成菌含量为1.2～1.8×108CFU/ml的稀释菌液，以55-60kg/亩的用量与常规肥料混合后，于植物苗定植前施加到种植土壤中。
进一步的，所述常规肥料包括腐熟有机肥、腐殖酸和草木灰。
进一步的，在应用时，将所述植物内芽孢杆菌GBW-F008制备成菌含量为1.2～1.8×108CFU/ml的稀释菌液，以培养介质体积或质量的10～20％的用量给予植物苗灌根处理，每15-30天灌根一次，共培养45-60天。
进一步的，所述培养介质包括土壤、营养液、培养基质。
进一步的，所述植物包括番茄。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008能够明显增加番茄的根量、茎粗、壮苗指数和平均果重。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008能够明显增加土壤中速效磷、速效钾、游离氨基酸和IAA含量。
本发明还提供了所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008在用于制备发酵生产吲哚乙酸的微生物制剂中的应用。
进一步的，在应用时，将所述植物内芽孢杆菌GBW-F008制备成发酵液后，与诱导剂共同培养24-48h，吲哚乙酸的产量大于8.0mg/L。
进一步的，所述诱导剂包括色氨酸Try。
进一步的，所述诱导剂的浓度为1-5g/L。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液与浓度为1g/L的诱导剂色氨酸Try培养48h。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液与浓度为5g/L的诱导剂色氨酸Try培养24h。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液的制备步骤为：将活化的植物内芽孢杆菌GBW-F008以5％体积比接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，35～38℃恒温，180-200rpm/min震荡培养46h～48h，得到植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液的制备步骤为：将所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液使用空白产吲哚乙酸发酵培养基稀释200～300倍后，得到所述植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌发酵液的菌含量不低于360×108CFU/ml。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌稀释菌液的菌含量为1.2～1.8×108CFU/ml。
进一步的，所述产吲哚乙酸发酵培养基的配方为玉米淀粉8g，豆饼粉2g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.5g，CaCO3 0.1g，FeCl3·6H2O 5mg，色氨酸Try 1g，蒸馏水1L，pH 7.0～7.5。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
1、本发明所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008分离自番茄根部，并应用于番茄，因此具有较强的原位促生效应。
2、本发明所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008具有较强的产吲哚乙酸IAA能力，在诱导剂Try为1g/L时，在产吲哚乙酸发酵培养基上最高IAA含量在48h时能达到12.58mg/L，远远超过了NYT 1847-2010微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求提到的5mg/L的要求。
3、本发明所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008在20℃-42℃均可正常生长，有利于其在土壤较低的温度中的生长繁殖；其可产淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶类，这有利于各类有机物质的降解与促进养分的释放；该菌还具有较强的解有机磷、无机磷、解钾能力，能够促进其对磷、钾等大量营养元素的释放，有利于植物对营养的吸收和利用。
4、本发明所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008在产吲哚乙酸诱导培养基内发酵获得的发酵液，在番茄营养钵、盆栽与田间不同级别试验体系中，均表现出较强促生长能力，可促进土壤中速效磷、速效钾释放，提高土壤游离氨基酸与吲哚乙酸含量，显著提高番茄根量、茎粗和壮苗指数，并且还显著提高番茄的平均果重，从而提高番茄的种植产量和品质，增加番茄的种植收益，因此具有该菌广阔的应用前景。
5、本发明所述的植物内芽孢杆菌发酵液的制备方法简单、合理，且操作快捷，具有良好的工业化实施前景。
附图说明
图1：筛选72株芽孢菌产IAA能力定性比较图。
图2：植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌落、菌体与芽孢照片。
图3：植物内芽孢杆菌GBW-F008的20℃与37℃生长曲线。
图4：Salkowski比色法定量测定IAA含量的标准曲线。
图5：HPLC法定量测定IAA含量的标准曲线。
图6：HPLC法测定植物内芽孢杆菌GBW-F008的IAA含量。
图7：植物内芽孢杆菌GBW-F008在不同色氨酸Try浓度下的IAA含量。
图8：植物内芽孢杆菌GBW-F008在不同培养时间的IAA含量。
图9：植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他7株菌的解磷解钾能力对比图，其中，A为有机磷，B为无机磷，C为钾。
图10：植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他5株菌的产酶能力对比图，其中A为淀粉酶，B为木聚糖酶，C为纤维素酶，D为脂肪酶，E为蛋白酶。
图11：营养钵试验的番茄植株整体对比图。
图12：营养钵试验的番茄根部对比图。
图13：盆栽试验的番茄根部对比图。
图14：田间试验的植株对比图。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的试验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例中所需培养基或试验试剂配方如下：
1.营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂20g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1L。
2.改良LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉g，氯化钠10g，色氨酸Try 1g，pH 6.9～7.1，蒸馏水1L。
3.改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(NH4)2SO4 2g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.05g，pH 7.2-7.4～馏水1L。
4.产吲哚乙酸发酵培养基：玉米淀粉8g，豆饼粉2g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.5g，CaCO3 0.1g，FeCl3·6H2O 5mg，pH 7.0～7.5，色氨酸Try 1g，蒸馏水1L。
5.解有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，酵母粉0.5g，NaCl 0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 1.0g，卵磷脂0.5g，pH 7.0～7.5，蒸馏水1000mL，琼脂20.0g。
6.解无机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，酵母粉0.5g，NaCl 0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4 7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，Ca3(PO4)25.0，pH 7.0～7.5，蒸馏水1000mL，琼脂20.0g。
7.解钾培养基：酵母膏0.5g，蔗糖10g，(NH4)2SO4 1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCO3 1.0g，钾长石粉(K2O·Al2O3·6SiO2)1.0g，pH 6.9～7.1，蒸馏水1000mL、琼脂20.0g。
8.产淀粉酶分析培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，pH 7.1～7.3，蒸馏水1L，琼脂20g。
9.产木聚糖酶分析培养基：桦木10g，酵母膏1g，pH5.3～5.4，蒸馏水1L，琼脂20g。
10.产纤维素酶分析培养基：羧甲基纤维素钠20g，酵母粉0.5g，磷酸氢二钠2.5g磷，酸二氢钾1.5g，蛋白胨2.5g，pH 7.1～7.3，蒸馏水1L，琼脂20g。
11.产脂肪酶分析培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，三丁酸甘油酯2mL，pH7.4～7.6，蒸馏水1L，琼脂20g。
12.产蛋白酶分析培养基：干酪素10g，酵母膏1g，pH 6.9～7.1，蒸馏水1L，琼脂20g。
13.Salkowski比色液：50mL 35％HClO4±1mL 0.5mol/L FeCl3。
14.碘液：碘5g，KI 10g，蒸馏水1000mL。
15.酸性汞试剂：HgCl2 150g，浓盐酸200mL，蒸馏水1000mL。
16.刚果红染液：刚果红1g，蒸馏水1000ml。
17.1mol/L NaCl溶液：NaCl 58.5g，蒸馏水1000ml。
18.DNS显色液：酒石酸钾钠182g，3.5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21g，苯酚5g，加热搅拌溶解，蒸馏水1000ml。
以上培养基在使用前，均需在116℃下灭菌30min。
实施例1：植物内芽孢杆菌GBW-F008的分离筛选与鉴定
1、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分离与筛选
从河北廊坊、山东济南、泰安、莱阳、淄博、聊城、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根部，装于医学检验样品袋内，4℃冷藏保存并及时分离，样品涉及丝瓜、甜瓜、尖椒、五彩椒、番茄、黄瓜等56种作物的根部。取样品2g，放入18mL无菌水中，于30℃、200rpm/min震荡提取30min，样液于75℃水浴20min，然后进行梯度稀释，取各个梯度稀释液100μl在NA平板上进行涂布，将涂布好的平板37℃倒置培养48h，用灭菌竹签挑去不同形态的单菌落，转接于NA斜面上，37℃培养48h后镜检确定产芽孢，筛选到72株芽孢菌，并将菌株于4℃保藏备用。
灭菌的48孔培养板内每孔装有1ml含有色氨酸Try诱导剂的改良LB培养基，灭菌后冷却，然后将所筛选到的72株芽孢菌分别接种于48孔板内，37℃200rpm/min震荡培养24h，经8000rpm离心5min，取无菌上清液200μl转移至96孔板内，按照Salkowski比色法原理，芽孢菌发酵液在色氨酸Try诱导下会产生吲哚乙酸IAA，IAA与Salkowski显色剂发生反应，产生红色，颜色越深说明IAA含量越高。筛选的72株芽孢菌产IAA能力定性比较如图1所示，C2孔内菌株的红色反应最深，说明其产IAA能力在72株菌中最强，该菌株来源于泰安市高新区房村镇朱家庄村11年番茄棚，分离自番茄根部，将其命名为GBW-F008。
所述菌株GBW-F008在NA培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图2所示，GBW-F008在NA培养基上的菌落如图2a，为白色，不透明，圆形，边缘整齐，表面湿润光泽，直径1-5mm；GBW-F008在24h的10×100倍油镜镜检结果如图2b，镜检菌体呈G+，菌体为圆柱状，直径2-3μm，芽孢近端生呈长椭圆形，周生鞭毛。
2、植物内芽孢杆菌GBW-F008的16S rRNA序列测定
以所述菌株GBW-F008的DNA为模板，使用16S rDNA通用引物进行扩增后并测定其序列，序列如SEQ ID No.1所示。将得到的菌株GBW-F008的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行Blast比对分析，结果显示菌株GBW-F008与Bacillus endophyticus的同源性最高，因此确定菌株GBW-F008为植物内芽孢杆菌。
3、植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-F008进行菌种保藏，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；植物内芽孢杆菌Bacillus endophyticus的保藏编号为：CGMCC No.20919。
实施例2：植物内芽孢杆菌GBW-F008的生长与生理生化特性
1、GBW-F008的生理生化特征
将植物内芽孢杆菌GBW-F008在改良NB培养基培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化检测方法，对该菌进行生理生化特性测定，结果如表1所示。植物内芽孢杆菌GBW-F008在20℃～42℃温度范围内能够生长繁殖，但其最适合生长温度在37℃，在pH 4.5～9.6的改良NB培养基内均能正常生长，最适生长pH范围为6.5～7.5，该菌最高可耐受10％NaCl，可产生脲酶、酪素，接触酶与氧化酶反应均为阳性，可利用柠檬酸盐；GBW-F008还可利用木糖、菊粉、葡萄糖、D-核糖、环糊精、古老糖、D-海藻糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、亮氨酸芳胺酶等。
表1.植物内芽孢杆菌GBW-F008的生理生化特性
2、GBW-F008的生长曲线
植物内芽孢杆菌GBW-F008可耐受20℃-42℃的温度范围，将活化纯化的GBW-F008接种至改良NB培养基中，在pH 7.2-7.4，分别在20℃与37℃恒温、200rpm/min震荡培养36h，其中每2-6h取样，在OD600nm下测定吸光值，绘制的生长曲线如图3所示，在37℃下，GBW-F008在前4h生长延滞，6-10h时菌量呈对数生长，12h-16h逐渐稳定，20h以后逐渐衰亡，最高OD值达2.68；在20℃下，GBW-F008的延滞期推迟至6h，8-12h时菌量呈持续缓慢增长，16h-20h逐渐稳定，24h以后逐渐衰亡，最高OD值仅为1.59；由此可见，20℃的菌株生长情况稍弱于其在37℃下的长势，可能因受到低温的影响而生长趋缓，但也说明植物内芽孢杆菌GBW-F008具有较强的温度耐受性，生长温度范围较广，有利于其在土壤20℃～23℃的环境中萌发、增殖。
实施例3：植物内芽孢杆菌GBW-F008在不同条件下产吲哚乙酸的能力比较
1、GBW-F008产IAA的定量测定方法比较
吲哚乙酸IAA标品购自Sigma公司，分子量为175.18g/moL，化学式为C10H9NO2。
以无水乙醇为溶剂，配置IAA浓度为10、20、30、40、50mg/L的标品，分别取100μlIAA标准溶液，等体积加入100μl Salkowski比色液。酶标仪分别测定0min和避光反应30min后的OD540nm吸光值。以两者的OD差值为横坐标，以IAA浓度为纵坐标，绘制比色法标准曲线(图4)，标准曲线线性良好，R2＝0.9999。
以甲醇为溶剂，配置IAA浓度为10、20、30、40、60mg/L的标品。参考NY 882-2004硅酸盐细菌菌种发酵液中植物激素的测定；流动相配制方式：乙腈：甲醇：水＝43:114:343；pH＝4.5；色谱柱：C18，4.6*150mm；检测器：紫外UV 254nm；进样量：20μL；流速：0.4ml/min。标准液过0.22μm有机滤膜，取20μL上机。根据不同浓度IAA标品峰面积的变化，确定IAA在该体系下的保留时间为17.093，以IAA浓度为横坐标，以RT为17.09附近的峰面积为纵坐标，绘制HPLC外标法标准曲线(图5)，标准曲线线性良好，R2＝0.9987。
样品培养过程：植物内芽孢杆菌GBW-F008接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，500ml挡板摇瓶装液量为100ml，在37℃恒温、200rpm/min震荡培养24h，经8000rpm离心5min，取无菌上清液进行后续试验。
比色法定量测定：取100μl上清液于96孔板中，加100μl Salkowski比色液,酶标仪分别测定0min和避光反应30min后的OD540nm吸光值。以两者的OD差值为横坐标，根据比色法标准曲线，计算IAA浓度。
HPLC法定量测定：取3ml上清液，加3ml乙酸乙酯，避光下200rpm震荡萃取1h，10000rpm/min离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤，取0.3ml经二氧化碳气体吹，再重溶于等量甲醇中。样品过0.22μm有机滤膜，成为样品上机液。100μl样品上机液与100μl 100mg/LIAA标品混合，作为样品加内标液。图6显示的是HPLC法测定菌株GBW-F008的IAA含量的过程，其中A线为样品上机液，显示该样品在17.088处有峰，而B线则显示样品加内标后，除17.09处的峰面积显著上升外，其他保留时间位置峰面积均减半，可以确定该发酵液中含有IAA，含量基于17.088处的峰面积，根据HPLC外标法确定IAA含量。
植物内芽孢杆菌GBW-F008的IAA含量在比色法下测定值为86mg/L，HPLC外标法测定值为8.61mg/L，两法结果相差较大的主要原因是比色法基于颜色变化反应，测定是吲哚乙酸及其衍生物，而HPLC法基于内标定位置，外标定量，是基于同物质在C18反相色谱柱上的保留时间一致，且浓度与峰面积正相关，因此使用HPLC外标法测定IAA含量更为准确。
2、诱导剂色氨酸Try浓度对GBW-F008产IAA量的影响
植物内芽孢杆菌GBW-F008接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，500ml挡板摇瓶装液量为100ml，在37℃恒温、200rpm/min震荡培养24h，按照HPLC外标法测定IAA含量。试验检测了诱导剂色氨酸Try的不同含量对GBW-F008产IAA含量的影响，每组测定3个重复，结果采用SPSS 17.0进行分析。结果如图7所示，当不含诱导剂色氨酸Try时，GBW-F008几乎不产IAA，当色氨酸浓度为1g/L和2g/L，IAA含量分别为8.76mg/L和9.15mg/L。当诱导剂色氨酸Try为5g/L，IAA含量可达12.65mg/L，显著高于其他两组，但此时应用成本较高。
色氨酸是IAA合成路径中第一种重要的前体物质，在依赖色氨酸途径中，IAA合成又包括四条路径，包括IPyA吲哚丙酮酸路径、吲哚乙酰胺路径IAM、吲哚乙腈路径IAN和色胺路径TAM。综合考虑色氨酸Try是芽孢杆菌产IAA的重要前体以及经济实用等因素，后续实验选择诱导剂色氨酸Try的浓度为1g/L。
3、GBW-F008在不同发酵时间下IAA含量检测
植物内芽孢杆菌GBW-F008接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，500ml挡板摇瓶装液量为100ml，在37℃恒温、200rpm/min震荡培养72h，按照HPLC外标法测定IAA含量。在诱导剂色氨酸Try浓度为1g/L时，检测植物内芽孢杆菌GBW-F008产IAA含量随时间的变化情况，每2-6h取样，每组测定3个重复，结果采用EXCEL求均值与偏差，进行比较分析。结果如图8所示，在前48h内，GBW-F008所产IAA含量逐渐上升，在48h处达到最大值12.58mg/L，几乎达到诱导剂色氨酸Try浓度5g/L时发酵24h的IAA浓度。
实施例4：植物内芽孢杆菌GBW-F008解磷解钾能力的检测
植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他7株芽孢杆菌，分别接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，500ml挡板摇瓶装液量为100ml，在37℃恒温、200rpm/min震荡培养48h。分别取2μl菌液点接至解有机磷、解无机磷、解钾三种固体培养基上，37℃恒温培养5d，然后测定水解圈直径。GBW-F008的解磷解钾能力与其水解圈直径正相关，与其菌体直径负相关，具体如下：解磷能力＝解磷圈直径/菌体直径；解钾能力＝解钾圈直径/菌体直径。植物内芽孢杆菌GBW-F008解磷解钾能力如表2与图9所示。如图9A所示，植物内芽孢杆菌GBW-F008解有机磷能力最强，解磷圈高达2.31，其次是地衣芽孢杆菌E023，说明这两株菌具有较强的解有机磷的能力；如图9B和9C所示，GBW-F008的解无机磷与解钾能力仍强于其他7株芽孢杆菌，说明GBW-F008具有较好的解无机磷与解钾的能力。将8株菌的解磷解钾能力进行相乘或相加后比较，植物内芽孢杆菌GBW-F008的解磷解钾能力均为最佳，其解磷解钾活性与其产吲哚乙酸等有机酸有一定关系。
表2植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他7株菌的解磷解钾能力比较
实施例5：植物内芽孢杆菌GBW-F008产酶能力检测
植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他5株芽孢杆菌，分别接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，500ml挡板摇瓶装液量为100ml，在37℃恒温、200rpm/min震荡培养48h。分别取2μl菌液点接至产淀粉酶、产木聚糖酶、产纤维素酶、产脂肪酶和产蛋白酶这5种分析固体培养基上，37℃恒温培养24h，分别处理后测定水解圈直径。在产淀粉酶分析培养基上滴加适量碘液，摇匀后，根据淀粉酶解圈直径确定菌株产淀粉酶能力；在产木聚糖酶分析培养基上滴加适量DNS显色液，摇匀后，根据木聚糖酶解圈直径确定菌株产木聚糖酶能力；在产纤维素酶分析培养基上滴加适量刚果红染液，摇匀后，再滴加1mol/L NaCl溶液冲洗，根据纤维素酶解圈直径确定菌株产纤维素酶能力；若菌株产脂肪酶，在具体周围会产生透明脂肪酶解圈；在产蛋白酶分析培养基上滴加适量酸性汞，摇匀后，根据蛋白酶解圈直径确定菌株产蛋白酶能力。
植物内芽孢杆菌GBW-F008的产酶能力与其水解圈直径正相关，与其菌体直径负相关，具体如下：产酶能力＝酶解圈直径/菌体直径。植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他菌相比较，产5种酶能力如表3与图10所示。如图10A所示，除GBW-H012外，其他5株菌均有较强的淀粉酶能力，其中GBW-F008能力最强；如图10B所示，多数芽孢菌都无法产木聚糖酶，而GBW-F008在菌体直径较小时却获得了较大的产木聚糖酶直径；如图10C所示GBW-F008与GBW-C031具有较强的产纤维素酶能力；如图10D所示GBW-F008在几株菌中产脂肪酶能力最强；如图10E所示GBW-F008与GBW-C031都具有较强的产蛋白酶能力，但GBW-F008产蛋白酶能力较GBW-C031更强。将6株菌的解磷解钾酶能力进行相乘或相加后比较，植物内芽孢杆菌GBW-F008的产酶能力均为最佳，这将有利于其在与有机肥、生物有机肥、复合微生物肥料、环境固体废弃物等配合应用时，对体系淀粉酶、木聚糖类、半纤维素类、纤维素类、脂肪类、蛋白类等物质的生物酶解，进而促进这些物质的进一步消化与利用。
表3植物内芽孢杆菌GBW-F008与其他5株菌的产酶能力比较
实施例6：植物内芽孢杆菌GBW-F008在营养钵体系下的促番茄生长能力测试
1、植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液的制备：将植物内芽孢杆菌GBW-F008在改良NB培养基活化后，以5％体积比接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，50升小罐装液量为30L，在35℃～38℃恒温、200rpm/min震荡培养46h～48h，得到植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液，发酵液菌含量不低于360×108CFU/ml。将植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液以空白的产吲哚乙酸发酵培养基稀释200～300倍后，得到菌量为1.2～1.8×108CFU/ml的稀释菌液，并用于后续的实验。
2、在营养钵体系下考察植物内芽孢杆菌GBW-F008的促生能力：将稀释菌液以培养介质10～20％的体积比给予植物苗灌根处理，每15天灌根一次，培养45天，共灌根3次。试验分为2个组，A组为培养基对照组，每次灌根使用50ml水和10ml空白产吲哚乙酸发酵培养基；B组为加菌试验组，每次灌根使用50ml水和10ml植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液。试验每组设置12个营养钵，每钵内含营养土300g，其养分含量为速效氮2450mg/kg、速效磷12.88mg/kg、速效钾1000mg/kg、有机质374mg/kg。每钵定植1棵夏之娇番茄苗，营养钵均置于光照培养箱中培养，28℃给光12h，21℃黑暗12h，循环往复培养45天。
试验结束后，分别测定番茄苗的株高、茎粗、干重等指标。株高：采用直尺测定根部到植株生长点；茎粗：采用游标卡尺测定番茄茎基底部最宽处的直径；地上干重：样品120℃杀青3h后称量；根干重：样品120℃杀青3h后称量；全株干重＝地上干重+根干重；壮苗指数＝茎粗/株高×全株干重。数据经EXCEL简单处理后，经SPSS 17.0进行配对T检验分析。番茄营养钵试验的番茄苗整体生长情况如图11所示，番茄苗的根部生长情况如图12所示，试验数据汇总如表4所示，加菌试验组的番茄苗根量明显增加，茎秆更粗壮，且具有较高的根干重、地上干重，壮苗指数得到增加，尤其茎粗、壮苗指数均与对照组之间存在显著差异(P<0.05)，说明植物内芽孢杆菌GBW-F008能够有效促进番茄苗的生长。
表4植物内芽孢杆菌GBW-F008的番茄营养钵试验的生长数据对比
实施例7：植物内芽孢杆菌GBW-F008在盆栽体系下的促番茄生长能力测试
在盆栽体系下考察植物内芽孢杆菌GBW-F008的促生能力。设置两个组，A组为培养基对照组；B组为加菌试验组。盆栽试验每组设置20盆盆栽，选择直径为26cm的花盆进行试验，每盆装土量5kg；每花盆定植1棵夏之娇番茄苗，周期共计2月，每月灌根1次，每次灌根加400ml水和100ml试验液，A组的试验液为100ml不接种菌株的空白产吲哚乙酸发酵培养基，B组的试验液为100ml实施例6中制备的植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液。
培养2个月后，分别测定株高、茎粗、干重、鲜果重等指标。株高：采用直尺测定根部到植株生长点；茎粗：采用游标卡尺测定番茄茎基底部最宽处的直径；地上干重：样品120℃杀青3h后称量；根干重：样品120℃杀青3h后称量；全株干重＝地上干重+根干重；鲜果重：收集试验组所有番茄果，称鲜重。数据经EXCEL简单处理后，经SPSS 17.0进行配对T检验分析。番茄的植物生长试验数据汇总如表5，根部对比如图13，结果显示，加菌试验组番茄的株高、根干重与全株干重显著增加(P<0.05)，茎粗极其显著增加(P<0.01)，鲜果重极其显著增加(P<0.01)，因此说明植物内芽孢杆菌GBW-F008具有显著促进番茄生长的能力，可以显著提高番茄的品质和果重，有利于提高番茄的经济收益。
表5植物内芽孢杆菌GBW-F008的番茄盆栽的植物生长数据对比
将釆集的土壤样品利用1mol/L KCL进行浸提，220rpm/min振荡30h后过滤，按照钼酸铵-酒石酸锑钾比色法测定土壤速效磷，按照火焰分光光度计法测定土壤速效钾，按照HPLC外标法测定土壤中IAA含量；滤液中的游离氨基酸含量用茚三酮比色法测定。统计分析后，番茄盆栽试验的土壤指标如表6，结果显示，加菌试验组的速效磷、速效钾、土中IAA含量、游离氨基酸含量相比于培养基对照组均显著增加。
表6.植物内芽孢杆菌GBW-F008的番茄盆栽试验的土壤指标对比
由此说明植物内芽孢杆菌GBW-F008能够有效的增加土壤中的可利用态磷、钾，进而给植物提供了更多的可用营养，也有利于植物胞壁的形成，增加的更多的游离氨基酸则有利于植物的大量与微量元素代谢，促进光合作用；吲哚乙酸IAA的增加有利于植物获得更多的生长刺激，促进根部、茎部细胞分裂与伸长，使得植物更加健壮，更易从土中吸收养分，更能抵抗病害侵扰，从而进入良性循环，因此使得开花结果率得到提高，获得更高的经济效益。
实施例8：植物内芽孢杆菌GBW-F008的番茄促生田间小区测试
在泰安市高新区房村镇朱家庄村11年番茄棚进行田间试验，试验采用温室大棚栽培底肥施入方式，每个处理做一畦(约30株番茄)，每个处理3个重复，按顺序循环排列。种苗为同批种苗，保证所有番茄苗大小基本一致，施入底肥后同时间定植，之后采用同种方式浇水、施肥、打药，收获时测定产量等相关指标。
在田间小区体系下考察植物内芽孢杆菌GBW-F008的促生能力。该大棚的常规施肥的肥料用量为腐熟有机肥300kg/亩，腐殖酸92kg/亩，草木灰8kg/亩。
在常规肥料的基础上，额外施加植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液或空白培养基，用量为55-60kg/亩。试验设置两个组，A组(培养基对照组)：使用不接种菌株的空白产吲哚乙酸发酵培养基；B组(加菌试验组)：使用实施例6中制备的植物内芽孢杆菌GBW-F008稀释菌液。
试验维期2月，分别测定定植3周后与6周后番茄的株高、茎粗、番茄果重、干重等指标。株高：直尺测定根部到植株生长点；茎粗：采用游标卡尺测定番茄茎基底部最宽处的直径；果重：收集试验组所有番茄果，称鲜重。数据经EXCEL简单处理后，经SPSS 17.0进行配对T检验分析。
番茄田间试验生长情况如图14，番茄田间试验的指标对比如表7，结果显示，在定植3周后，加菌试验组番茄的株高、茎粗显著增加(P<0.01)，株高涨幅10.9％，茎粗涨幅27.2％；定植6周后，加菌试验组株高虽仍显著高于对照(P<0.05)，但株高的涨幅为7.36％，差异逐渐缩小，茎粗涨幅25.7％，仍显著高于对照组(P<0.01)，加菌试验组的每棵番茄的平均果重也显著增加，涨幅为28.2％，说明植物内芽孢杆菌GBW-F008用于番茄种植能够显著促进番茄的生长以及果实的重量，因此可以显著提高番茄的经济效益。
表7植物内芽孢杆菌GBW-F008的番茄田间试验的指标对比
综上，本发明所述植物内芽孢杆菌GBW-F008分离自番茄根部，具有较强的产吲哚乙酸IAA能力，在诱导剂Try为1g/L时，在产吲哚乙酸发酵培养基上最高IAA含量在48h时达到，为12.58mg/L。所述GBW-F008可耐受20℃-42℃，耐受温度范围广，且可产淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶类，木聚糖酶水解比值达3.97，具有明显的分解有机磷、无机磷和钾等能力，解有机磷比值高达2.31。在营养钵、盆栽与田间不同级别试验体系中，植物内芽孢杆菌GBW-F008均表现出明显的促番茄生长的能力，还可促进土中速效磷、速效钾的释放，提高土壤游离氨基酸与吲哚乙酸含量，显著提高番茄茎粗、壮苗指数等，田间试验每棵番茄平均果重增幅能够达到28.2％，因此，植物内芽孢杆菌GBW-F008具有较好的促植物生长的效果，具有广阔的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛尚德生物技术有限公司
<120> 一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌GBW-F008及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> Bacillus endophyticus
<400> 1
tggcctgcgg tgctatacat gcagtcgagc ggagttttga aaagcttgct tttcaaaact 60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgccct tgagacgggg ataactccgg 120
gaaaccggag ctaataccgg ataacacata tcttcgcatg aggatatgtt agaaggtggc 180
ttttagctac cactcaagga tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagta cctgttaaat aagcaggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gttccttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagcggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagcaaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
ggacccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgcta cttctagaga tagaaggttc ccttcgggga cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattt agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggatggt acaaagggct gcaaaaccgc gaggttaagc caatcccata 1260
aaaccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagccg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttggag ccagccgccg 1440
aaggtgacaa gt 1452
Claims (6)
1.一株产吲哚乙酸的植物内芽孢杆菌GBW-F008，其特征在于，其分类命名为植物内芽孢杆菌（Bacillus endophyticus），保藏编号为CGMCC No. 20919。
2.权利要求1所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008在用于制备促进植物生长的微生物菌剂中的应用，其特征在于，所述植物为番茄。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在应用时，将所述植物内芽孢杆菌GBW-F008制备成菌含量为1.2×108~1.8×108 CFU/ml的稀释菌液，以55-60 kg/亩的用量与常规肥料混合后，于番茄苗定植前施加到种植土壤中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在应用时，将所述植物内芽孢杆菌GBW-F008制备成菌含量为1.2×108~1.8×108 CFU/ml的稀释菌液，以培养介质10~20%的用量给予番茄苗灌根处理，每15-30天灌根一次，共培养45-60天。
5.权利要求1所述的植物内芽孢杆菌GBW-F008在用于制备发酵生产吲哚乙酸的微生物制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在应用时，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液与浓度为1g/L的诱导剂色氨酸Try培养48h，或所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液与浓度为5g/L的诱导剂色氨酸Try培养24h，吲哚乙酸的产量大于8.0 mg/L；
所述植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液的制备步骤为：将活化的植物内芽孢杆菌GBW-F008以5%体积比接种至产吲哚乙酸发酵培养基中，35~38℃恒温，180-200rpm/min震荡培养46h~48h，得到植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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