CN112481164A - 一种凡纳滨对虾生长促进微生态制剂及其使用方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾生长促进微生态制剂及其使用方法与应用。本发明中的微生态菌剂含有光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、中性蛋白酶、淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰中的至少一种或其组合。含有该微生态菌剂的水产生长促进制剂能促进凡纳滨对虾的生长并提高凡纳滨对虾的免疫力，调节凡纳滨对虾肠道的微生态平衡，并能在水环境中发挥良好的净化水质的效果，在水产养殖中具有广阔的应用前景。

Description

一种凡纳滨对虾生长促进微生态制剂及其使用方法与应用
技术领域
本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一种凡纳滨对虾生长促进微生态制剂及其使用方法与应用。
背景技术
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾，具有适温范围广(6-39℃)，盐度适应能力强(0.5-50‰)，生长速度快，抗病力强，肉质鲜美等特点，已成为中国和世界范围内的三大对虾养殖种类之一。
但随着对虾养殖业规模的不断扩大，病害及环境恶化对其产量的影响也变得日益显著。如对虾的白斑综合征(WSD)、急性肝胰腺坏死(AHPND)、病毒性偷死病(VCMD)、黄头病(YHD)、传染性肌坏死(IMN)、桃拉综合征(TS)、肠孢虫病(EHP)和传染性皮下及造血组织坏死(IHHN)等病毒性传染病及各种细菌性疾病，给对虾养殖业带来严重的经济损失。但处于对经济效益的追求，养殖密度越来越大，养殖水体残饵、粪便积累越来越严重，这些有机物在微生物的作用下分解产生了大量氨氮、亚硝酸盐和硫化氢等对凡纳滨对虾产生胁迫或毒害作用的物质，造成虾体机能下降，种质退化，病害严重，大量抗生素和其他化学类药物被用于其疾病预防和治疗中。长此以往，细菌对抗生素产生了耐药性，治疗效果大打折扣，为了及时有效的阻止病害的发生不得不加大用量，使得养殖成本增加，形成了恶性循环。
同时，水产养殖使用抗生素，其药物残留和养殖废水的大量排放，也会对周围生态环境和人类健康也产生了巨大的危害，引发了生态环境和食品安全等其他方面的问题。因此，寻找一种既能促进凡纳滨对虾生长，由可以起到抗生素的替代作用的微生态制剂，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生态菌剂；
本发明的另一目的在于提供一种水产生长促进制剂；
本发明的另一目的在于提供一种促进凡纳滨对虾生长的方法；
本发明的另一目的在于提供上述水产生长促进制剂在凡纳滨对虾养殖中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述微生态菌剂在水体净化中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种微生态菌剂，该微生态菌剂含有光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、中性蛋白酶、淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰中的至少一种。
本发明微生态菌剂中的丁酸梭菌可以帮助修复对虾肠黏膜，其代谢产物丁酸是肠上皮组织细胞的前体物质，可以帮助修改肠黏膜，从而有效地预防治疗肠炎。本发明的微生态菌剂便于储存，应用范围广，在温度20-35℃、pH为5.32-9.16的水环境中均能发挥良好的净化水质的效果。而且，本发明微生态菌剂对水产养殖动物无毒害，对养殖环境无污染，不存在药物残留问题，也不会给水体造成二次污染，在水产养殖中具有广阔的应用前景。
进一步地，上述光合细菌选自球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)或沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)中的一种或其组合。
进一步地，上述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌或乳酸片球菌中的一种或其组合。
更进一步地，上述乳酸菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，菌株保藏编号为CICC 23609。
进一步地，上述谷氨酸棒状杆菌选自谷氨酸棒杆菌Ⅰ型(Corynebacteriumglutamicum)，菌株保藏编号为CICC 10031，或谷氨酸棒杆菌，菌株保藏编号为CICC 10058。
当然，可以根据实际使用需求，合理采用任意商品化或市面可售的光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌菌种替代上述光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌菌种。
进一步地，上述光合细菌的菌含量为1×108-9×108个/g，乳酸菌的菌含量为1×107-1×108个/g，海洋红酵母的菌含量为1×108-9×108个/g，谷氨酸棒状杆菌的菌含量为1×108-5×108个/g，丁酸梭菌的菌含量为1×108-5×108个/g，枯草芽孢杆菌的菌含量为1×108-9×109个/g，地衣芽孢杆菌的菌含量为1×108-9×109个/g，凝结芽孢杆菌的菌含量为1×108-9×109个/g，中性蛋白酶含量为1000-3000U/g。
进一步地，上述淀粉的含量为150-250mg/g，蔗糖的含量为120-240mg/g，硫酸镁的含量为10-25mg/g，硫酸锰的含量为10-25mg/g。
更进一步地，以每克微生态菌剂计，上述光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的细菌含量比为(1-9)：(0.1-1)：(1-10)：(1-8)：(1-5)：(10-90)：(10-90)：(10-90)；上述淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰的质量比为(100-300)：(90-270)：(7.5-25)：(7.5-25)，且每克微生态菌剂中，淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰的总含量为400-500mg。
更进一步地，上述淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰的质量比为(200-300)：(100-200)：(10-20)：(10-20)。
更进一步地，上述淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰的质量比为(200-300)：(100-200)：15：15。
进一步地，上述微生态菌剂还含有生物表面活性剂；
其中，上述生物表面活性剂包括海藻糖脂、鼠李糖脂、纤维二糖脂中的一种或多种。
更进一步地，以每克上述微生态菌剂计，上述生物表面活性剂的添加量为10-20mg。
本发明的第二个方面，提供：
一种水产生长促进制剂，该水产生长促进制剂含有上述微生态菌剂。
进一步地，上述水产包括虾；
更进一步地，上述虾为凡纳滨对虾。
本发明的第三个方面，提供：
一种促进凡纳滨对虾生长的方法，包括以下步骤：
将上述水产生长促进制剂施用在水产养殖区域内。
其中，上述水产生长促进制剂的施加量为每亩水体100g-400g/次，施加频率为每12-25天施加1次。
当然，可以根据水体的温度、溶氧状况等情况，合理调整上述水产生长促进制剂的施加量及施加频率。
使用上述水产生长促进制剂时，可以将上述水产生长促进制剂直接均匀抛洒或用海水稀释后均匀抛洒至整个养殖池塘，抛洒完毕后开启增氧机增氧2小时。
本发明的第四个方面，提供：
上述水产生长促进制剂在凡纳滨对虾养殖中的应用。
本发明中的水产生长促进制剂能促进凡纳滨对虾的生长并提高凡纳滨对虾的免疫力，调节凡纳滨对虾肠道的微生态平衡，其效果显著优于现有技术中的微生态制剂或采用单一任意菌株的使用效果。
本发明的第五个方面，提供：
上述微生态菌剂在水体净化中的应用。
本发明中的还能有效改善养殖水环境，其效果显著优于现有技术中的微生态制剂或采用单一任意菌株的使用效果。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的微生态菌剂便于储存，应用范围广，在温度20-35℃、pH为5.32-9.16的水环境中均能发挥良好的净化水质的效果，有效改善养殖水环境。
2.本发明中的微生态菌剂对水产养殖动物无毒害，对养殖环境无污染，不存在药物残留问题，也不会给水体造成二次污染，可作为抗生素在水厂养殖中的有效替代品，在水产养殖中具有广阔的应用前景。
3.本发明中的水产生长促进制剂能促进凡纳滨对虾的生长并提高凡纳滨对虾的免疫力，调节凡纳滨对虾肠道的微生态平衡，其效果显著优于现有技术中的微生态制剂或采用单一任意菌株的使用效果。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验试剂
用于测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse,SOD)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、一氧化氮合酶(Total NitricOxide Synthase,TNOS)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)、溶菌酶(Lysozyme,LSZ)酶活的试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
复合菌菌种的选择
本发明中，选择球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、乳酸乳球菌(CICC 23609)、海洋红酵母(Rhodotarula benthica)、谷氨酸棒状杆菌(CICC 10031或CICC10058)、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌制备微生态菌剂，在此基础上，进一步验证各菌株之间是否存在拮抗情况。
具体步骤如下：
分别挑取球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、乳酸乳球菌(CICC23609)、海洋红酵母(Rhodotarula benthica)、谷氨酸棒状杆菌(CICC 10031或CICC10058)、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的单菌落在营养琼脂培养基上交叉十字划线，将划线的平板置于28℃条件下，培养24h后，观察实验菌株的生长情况。
结果表明：本发明的各菌株之间不存在拮抗作用。
微生态菌剂的制备
本实施例中的微生态菌剂由沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)、乳酸乳球菌、海洋红酵母(Rhodotarula benthica)、谷氨酸棒状杆菌(CICC 10031)、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、淀粉、蔗糖、中性蛋白酶、硫酸镁、硫酸锰、海藻糖脂，将上述各组分加入湿法混合制粒机，再加入质量相当于干粉物料总重量的20％的自来水，混合1min后开始下料制粒，得均匀的短杆状颗粒。
其中，以微生态菌剂的质量计，每g微生态菌剂中，含有1.0×108-9×108个沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)，1.0×107-1.0×108个乳酸乳球菌，1.0×108-1.0×109个海洋红酵母，1.0×108-8.0×108个谷氨酸棒状杆菌，1.0×108-5.0×108个丁酸梭菌的菌含量，1.0×109-9.0×109个枯草芽孢杆菌，1.0×109-9.0×109个地衣芽孢杆菌，1.0×109-9.0×109个凝结芽孢杆菌，200mg淀粉，180mg蔗糖，2000U中性蛋白酶，15mg海藻糖脂，15mg硫酸镁、15mg硫酸锰。
微生态菌剂效果验证实验
本实验设计了1个对照组和1个实验组，其中，第一组为实验组，投喂基础饲料，并拌服上述实施例中制备得到的微生态菌剂(微生态制剂的添加量为基础饲料质量的0.5％)，第二组对照组，只投喂基础饲料；每组分别设4个重复，每个重复分别放养100尾凡纳滨对虾。
实验于2018年5月12日开始，在广州海鸥岛试验基地进行，将实验用凡纳滨对虾养殖在400L白色塑料桶中。对虾购买运回时养殖用水盐度为17‰。
首先，进行驯化暂养阶段，暂养时间为10天。暂养期间保持合适充氧，定时测定水温，定时投喂适量基础饲料，并且将养殖用水的盐度每天提升2‰，逐渐驯化直到盐度升至养殖用水的自然盐度31‰。驯化暂养结束后稳定两天，准备进行正式实验。
正式实验：先将实验用虾饥饿一天，然后选取规格相近，无病无伤、健康活泼的凡纳滨对虾分轮次随机放入8个相同规格的400L塑料桶中，每次放入对虾10尾，共放10轮即每个养殖桶中共放凡纳滨对虾100尾，在放虾过程中称量并记录每个重复中虾的总重量。然后进行45天的养殖实验。养殖过程中，使水温保持27℃左右，溶氧高于5mg/L，养殖用水盐度31‰，酸碱度8.0±0.1。每天于上午8:30及下午5：00定时投喂，每天的投喂量以对虾体重3％-5％为准。每次投喂前分别收集养殖桶底部的残饵、粪便，同时换水1/3～2/3。
养殖实验结束后，在养殖条件不变的情况下，将取样后剩余的虾正常饲喂稳定后，进行攻毒实验。每个处理组3个重复，每个重复15尾虾。稳定饲喂3天后，开始向每个处理组养殖桶中泼洒副溶血弧菌(所用副溶血弧菌来自海大集团微生物实验室)。
副溶血弧菌用海水重悬泼洒到各处理养殖桶，保证各处理养殖桶中副溶血弧菌的终浓度为1×108cfu/mL。攻毒实验持续两周，攻毒期间养殖条件不变。每天观察记录对虾的活动、摄食及死亡情况。
1.微生态菌剂对凡纳滨对虾生长的影响：
养殖实验开始前，测量记录实验用虾的初总体重、初均重、初均长、对虾的总数。45天的养殖之后，将实验用虾进行24h的饥饿处理，统计存活的数量，计算均增重、体重增长率、特定生长率等，其中，体重增长率如下所示：
Figure BDA0002809985770000061
实验结果见表1。
表1 两个处理组的对虾生长状况
Figure BDA0002809985770000062
由表1可以看出，添加本发明的微生态菌剂后实验组的对虾生长速度显著高于对照组，说明本发明的微生态制剂能促进凡纳滨对虾的生长和体重增长率。
2.微生态菌剂对凡纳滨对虾免疫能力的影响
通过检测凡纳滨对虾的肌肉组织、血清等样品，测定并分析体生化组成、能量收支、腺苷酸、及血清非特异免疫酶，获得凡纳滨对虾免疫能力数据。
具体实验步骤如下：
对实验组和对照组各随机取样3份，用于饲料成分的分析。
实验开始前，对投喂时间内饲料的溶失率进行测定，用于校正溶失造成的摄食量计算中的误差。残饵在投喂后1h用虹吸法及时收集，每次在投喂前和投喂后1.5h用虹吸法收集粪便和虾壳，再分别装入对应烧杯，在70℃下烘干至恒重后在-20℃下保存。实验结束时，对虾停食24h，然后对每个桶的虾分别称重，样品在70℃下烘干至恒重后在-20℃下保存。
养殖周期结束后，对虾饥饿处理一天。使用一次性无菌注射器(1mL)在对虾腹部血窦中缓慢抽取血淋巴置于1.5mL无菌离心管中，并置于4℃的冰箱过夜。次日用无菌针头捣碎离心管中的血凝块，在4℃环境下，3000r/min的条件下离心10min，使用灭菌枪头将血清转移至新的无菌离心管中，之后需保存到-80℃冰箱中备用。
对虾肌肉组织经液氮迅速冷冻后于-80℃超低温冰箱保存，用于肌肉组织腺苷酸的测定。
(1)生化组成和能值的测定
将实验虾样品放入烘箱70℃下烘干至恒重，得到干物质含量；然后以马福炉(HRMF-7000，热博特有限公司)550℃灼烧6h灰化至恒重，得到灰分含量；使用元素分析仪(Vario ELⅢ，元素分析系统公司)测得N含量后，再计算得到蛋白质含量(6.25×N)；然后再以脂肪抽提仪(BUCHI36680，力辰仪器有限公司)测定虾体脂肪含量(乙醚为抽提剂)。
虾体组织能值以氧弹热量仪(PARR6400，Parr仪器公司)测得。
对虾的摄食、生长、呼吸、粪便、排泄和蜕壳的能量符合下列关系：
C＝G+R+F+U+E
其中，C为摄入的饵料能量，G为生长能，R为代谢能，F为粪能，U为排泄能，E为蜕壳能。其中，C、G、F和E所含的能值用PARR 6400型氧弹热量仪测定，排泄能以下式计算：
U＝(CN-GN-FN-EN)×24.83
其中，CN为摄食食物中所含的氮，GN为虾体中积累的氮，FN和EN为粪便和蜕壳损失的氮，24.83为每克氨氮的能值(KJ)。这里假定氨是唯一的氮排泄物。
结果如表2和表3所示
表2 两个处理组的对虾体生化组成和体能量
Figure BDA0002809985770000071
表3 两个处理组的对虾能量收支状况
Figure BDA0002809985770000072
Figure BDA0002809985770000081
通常情况下，能量的消耗与对虾的种类、盐度、生理状态和生活习性等密切相关，当虾免疫能力较强时，将有更多的能量可用于生长。而当环境较差时，对虾为了维持正常的生理功能，会消耗较多的能量用来抵御外界环境的干扰，使机体蛋白质和脂肪储备减少，生长减缓。由表2和表3可以看出，实验组对虾体蛋白质含量显著高于对照组，实验组生长能占摄食能的比例显著高于对照组，说明添加本发明的微生态制剂后，提高了饲料能量的利用率，凡纳滨对虾摄食的饲料能量可以更多地用于生长。
(2)腺苷酸含量的测定
腺苷酸含量采用Agilent 1100高效液相色谱仪(HPLC，Agilent Corp)进行测定。适量冷冻肌肉组织样品加入9倍体积的冰冷高氯酸(0.9mol/L)溶液进行匀浆。匀浆液于7000g、4℃下离心5min，收集上清液并以3.75mol·L-1K2CO3中和至pH 6.5。中和后的溶液于7000g、4℃下离心10min，收集上清液用于测定相应组织中腺苷酸含量。组织样品经0.45μm微孔滤膜过滤后用于测定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)含量。
层析柱为UltimateTM AQ-C18柱(4.6×250mm)，柱温为35℃，洗脱时间为24min，流速为1.0ml.min-1，检测波长为254nm。以磷酸缓冲液(40mmol·L-1KH2PO4和60mmol·L- 1K2HPO4，pH 6.50)作为流动相。根据测得的峰面积和标准曲线计算腺苷酸含量(微摩尔每克组织，μmol/g)。
标准曲线选择已知浓度的ATP(0-0.8mmol·L-1)、ADP(0-1.2mmol·L-1)和AMP(0-1.5mmol·L-1)溶液制作而成。
回归曲线方程、总腺苷酸(TAN)含量计算公式如下：
TAN＝[ATP]+[ADP]+[AMP]
其中，[ATP]、[ADP]和[AMP]分别表示ATP、ADP和AMP浓度。
ATP的回归曲线方程为：
y＝14.045x+9.374
R2＝1.000。
其中，ADP的回归曲线方程为：
y＝18.11x-25.053
R2＝0.9998。
其中，ATP的回归曲线方程为：
y＝18.32x-31.33
R2＝0.9998。
其中，y表示峰面积，x表示浓度。
实验结果如表4所示。
表4 两个处理组的对虾ATP含量情况
Figure BDA0002809985770000091
由表4可以看出，实验组对虾肌肉组织ATP含量显著高于对照组，肌肉组织AMP/ATP和ADP/ATP显著低于对照组。
(3)血清非特异免疫酶的测定
使用试剂盒测定超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶、溶菌酶酶活，测定方法按照试剂盒说明书操作。
超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定公式：
Figure BDA0002809985770000092
或
Figure BDA0002809985770000093
其中，所述稀释倍数为反应体系稀释倍数。
碱性磷酸酶(AKP)酶活测定公式：
Figure BDA0002809985770000094
其中，所述酚标准品浓度为0.1mg/mL。
酸性磷酸酶(ACP)酶活测定公式：
Figure BDA0002809985770000101
其中，所述酚标准品浓度为0.1mg/mL。
溶菌酶(LZM)的检测步骤如下所示：
以菌粉、菌粉溶剂配制贮备菌液，将贮备菌液和菌粉溶剂按照1:19配制应用菌液；配制标准品应用液。将待检测的样本、应用菌液和标准应用液均放进37℃水里，并使预温的时间超过5分钟；按照编号，在试管中加入0.2ml需测样本，其中，应用菌液加入的速度要快，同时混匀计时。测其530nm的吸光值，20秒的数据时作为T0，2分20秒时的数据作为T2，计算得到前后透光度之差。公式为：
Figure BDA0002809985770000102
一氧化氮合酶(NOS)的检测步骤如下所示：
在NOS的催化反应下，分子氧与L-Arg发生作用，可得到一氧化氮，在亲核性物质的作用下，一氧化氮与之反应形成有色物质，并于530nm处测得的吸光度数值得出一氧化氮合酶的活性。
各酶酶活的检测结果如表5所示。
Figure BDA0002809985770000103
超氧化物歧化酶是一种源于生命体的活性物质，能防治生物分子损伤、防疫机体衰老以及清除体内的自由基。磷酸酶广泛的存在于机体组织中，参与并调节机体内的多种代谢过程，具有非常重要的生理功能，血清中磷酸酶活性的升高可总结为以下两个原因，一方面，机体组织中向外释放的磷酸酶的量增加；另一方面，机体内增加了含磷酸酶微生物的数量，具体原因不确定；而AKP则与胞外营养物质的吸收有关，吸收的程度可以体现肠道上皮的吸收能力，及机体的营养状态。酸性磷酸酶在消化道中发挥作用，代表消化水平。而且，ACP是噬菌细胞中关键的一种溶菌酶，可以消化非己的异物，对应激反应敏感。细胞免疫属于非特异性免疫的一种，可吞噬、溶解异物；溶菌酶作为吞噬细胞杀菌的物质基础，可通过水解G+的细胞壁实现细胞死亡。由表5可以看出，实验组的对虾血清超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、总一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶均显著高于对照组，说明本发明的微生态制剂能显著提高对虾的免疫力。
表6为14天攻毒实验累计死亡率情况。
表6 两个处理组14天攻毒实验对虾累计死亡率
Figure BDA0002809985770000111
由表6可以看出，本发明的微生态制剂能显著提高对虾的免疫力，降低死亡率。
综上，由表1-6可以看出，通过添加本发明的微生态制剂可以显著提高凡纳滨对虾生长指标(增重率、蛋白质比例、生长能等)以及免疫力。
3.微生态菌剂对水体质量的影响
实验于广州海鸥岛试验基地进行，选择一组凡纳滨对虾养殖池塘进行实验：每个养殖池塘面积为两亩，气温在25-32℃之间，水温在27-28℃之间，日投喂饲料量为10kg/亩，投喂饲料为凡纳滨对虾全价饲料(采购自广东海大集团生产容川品牌精养凡纳滨对虾饲料，蛋白含量大于等于42％，粗灰分含量小于等于15％)。
第1组为实验组，使用本发明实施例中所制得的微生态菌剂，使用量为每亩水体使用200g；第2组为空白对照组，正常投喂不添加任何微生态菌剂或水质改良剂；每组设置4个重复。分别在实验开始前和实验开始后第5天测量水体溶氧、COD、pH、NH4-N、NO2-N，实验结果见表7。
表7 实验开始5天后池塘水质变化
Figure BDA0002809985770000121
由表7可以看出，本发明的微生态菌剂能在养殖池塘中有效改善水质，降低氨氮含量，提高溶氧。
效果对比实验
设置对比实验，验证微生态菌剂各组分间的协同增益效果。
制备实验所用的降解液：将采购的对虾饲料研成细粉(对虾饲料采购自广东海大集团生产容川品牌精养凡纳滨对虾饲料，蛋白含量大于等于42％，粗灰分含量小于等于15％)，加入灭菌陈海水1000mL，浸泡48h后离心取上清，加亚硝酸钠0.06g，调pH 7.8，分装成100mL/瓶，于121℃，灭菌20min。
试验分为11组进行，每个组4个重复，试验组分组如下：
表8 对比实验分组
Figure BDA0002809985770000122
Figure BDA0002809985770000131
其中，各组分浓度固定为：光合细菌的菌含量为5×108个/g，乳酸菌的菌含量为5.0×107个/g，海洋红酵母的菌含量为5.0×108个/g，谷氨酸棒状杆菌的菌含量为2.0×108个/g，丁酸梭菌的菌含量为5.0×108个/g，枯草芽孢杆菌的菌含量为5.0×109个/g，地衣芽孢杆菌的菌含量为5.0×109个/g，凝结芽孢杆菌的菌含量为5.0×109个/g，淀粉的含量为240mg/g，蔗糖的含量为150mg/g，中性蛋白酶含量为2000U/g，海藻糖脂的含量为10mg/g，硫酸镁含量为15mg/g、硫酸锰含量为15mg/g。
将11个实验组分别在28±1℃、160r/min下震荡培养5d，每天定时取样，测定样品液中的氨氮(NH4-N)、亚硝酸氮(NO2-N)和硝酸氮(NO3-N)含量。结果如表9所示。
表9 11个实验组于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)
Figure BDA0002809985770000132
Figure BDA0002809985770000141
其中，第9组和第10组对氨氮(NH4-N)、亚硝酸氮(NO2-N)和硝酸氮(NO3-N)无降解。
由上述实验结果可见，单独使用光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌，丁酸梭菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌的效果明显弱于使用同剂量的本发明的微生态制剂，单独使用中性蛋白酶或生物表面活性剂(期间不去除水体中的沉降物前提下)不会降低水体中的氨氮、NO2-N、NO3-N含量(第9组、第10组的氨氮、NO2-N、NO3-N含量几乎无下降)。
组分效果验证实验
设置验证实验，验证微生态菌剂各组分的必要性。
制备实验所用的降解液：将采购的对虾饲料研成细粉(对虾饲料采购自广东海大集团生产容川品牌精养凡纳滨对虾饲料，蛋白含量大于等于42％，粗灰分含量小于等于15％)，加入灭菌陈海水1000mL，浸泡48h后离心取上清，加亚硝酸钠0.06g，调pH 7.8，分装成100mL/瓶，于121℃，灭菌20min。
试验分为11组进行，每个组4个重复，试验组分组如下：
表10 验证实验分组
组别 组分
第1组 1mg本发明的微生态菌剂+100mL饵料降解液
第2组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加球形红假单胞菌菌粉)+100mL饵料降解液
第3组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加乳酸乳球菌菌粉)+100mL饵料降解液
第4组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加海洋红酵母)+100mL饵料降解液
第5组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加谷氨酸棒状杆菌)+100mL饵料降解液
第6组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加丁酸梭菌粉)+100mL饵料降解液
第7组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加枯草芽孢杆菌)+100mL饵料降解液
第8组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加地衣芽孢杆菌)+100mL饵料降解液
第9组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加凝结芽孢杆菌)+100mL饵料降解液
第10组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加中性蛋白酶)+100mL饵料降解液
第11组 1mg本发明的微生态菌剂(不添加海藻糖脂)+100mL饵料降解液
其中，各组分浓度固定为：光合细菌的菌含量为5×108个/g，乳酸菌的菌含量为5.0×107个/g，海洋红酵母的菌含量为5.0×108个/g，谷氨酸棒状杆菌的菌含量为2.0×108个/g，丁酸梭菌的菌含量为5.0×108个/g，枯草芽孢杆菌的菌含量为5.0×109个/g，地衣芽孢杆菌的菌含量为5.0×109个/g，凝结芽孢杆菌的菌含量为5.0×109个/g，淀粉的含量为240mg/g，蔗糖的含量为150mg/g，中性蛋白酶含量为2000U/g，海藻糖脂的含量为10mg/g，硫酸镁含量为15mg/g、硫酸锰含量为15mg/g。
将11个实验组分别在28±1℃、160r/min下震荡培养5d，每天定时取样，测定样品液中的氨氮(NH4-N)、亚硝酸氮(NO2-N)和硝酸氮(NO3-N)含量。结果如表11所示。
表11 11个实验组于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)
Figure BDA0002809985770000151
Figure BDA0002809985770000161
Figure BDA0002809985770000171
由上述实验结果可见，未添加光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌，丁酸梭菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌的组效果均弱于使用同剂量的本发明的微生态菌剂，其中，未添加谷氨酸棒状杆菌丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的组降低水体中的氨氮、NO2-N、NO3-N含量的效果明显弱于使用同剂量的本发明的微生态菌剂，而未添加中性蛋白酶或生物表面活性剂(期间不去除水体中的沉降物前提下)不会明显影响降低水体中的氨氮、NO2-N、NO3-N含量的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微生态菌剂，其特征在于，所述微生态菌剂含有光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、中性蛋白酶、淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的微生态菌剂，其特征在于，所述光合细菌的菌含量为1×108-9×108个/g，乳酸菌的菌含量为1×107-1×108个/g，海洋红酵母的菌含量为1×108-9×108个/g，谷氨酸棒状杆菌的菌含量为1×108-5×108个/g，丁酸梭菌的菌含量为1×108-5×108个/g，枯草芽孢杆菌的菌含量为1×108-9×109个/g，地衣芽孢杆菌的菌含量为1×108-9×109个/g，凝结芽孢杆菌的菌含量为1×108-9×109个/g，中性蛋白酶含量为1000-3000U/g。
3.根据权利要求1所述的微生态菌剂，其特征在于，所述淀粉的含量为150-250mg/g，蔗糖的含量为120-240mg/g，硫酸镁的含量为10-25mg/g，硫酸锰的含量为10-25mg/g。
4.根据权利要求1所述的微生态菌剂，其特征在于，以每克所述微生态菌剂计，所述光合细菌、乳酸菌、海洋红酵母、谷氨酸棒状杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的细菌含量比为(1-9)：(0.1-1)：(1-10)：(1-8)：(1-5)：(10-90)：(10-90)：(10-90)；所述淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰的质量比为(100-300)：(90-270)：(7.5-25)：(7.5-25)，且每克微生态菌剂中，淀粉、蔗糖、硫酸镁和硫酸锰的总含量为400-500mg。
5.根据权利要求1所述的微生态菌剂，其特征在于，所述微生态菌剂还含有生物表面活性剂；
其中，所述生物表面活性剂包括海藻糖脂、鼠李糖脂、纤维二糖脂中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的微生态菌剂，其特征在于，以每克所述微生态菌剂计，所述生物表面活性剂的添加量为10-20mg。
7.一种水产生长促进制剂，其特征在于，所述水产生长促进制剂含有权利要求1-6任一项所述微生态菌剂。
8.一种促进凡纳滨对虾生长的方法，包括以下步骤：将权利要求7所述水产生长促进制剂施用在水产养殖区域内；
其中，所述水产生长促进制剂的施加量为每亩水体100g-400g/次，施加频率为每12-25天施加1次。
9.权利要求7所述水产生长促进制剂在凡纳滨对虾养殖中的应用。
10.权利要求1-6任一项所述微生态菌剂在水体净化中的应用。
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