CN112472716A - 一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料,包括纳米硒复合颗粒,纳米硒复合颗粒为将甘露糖改性的壳聚糖包覆至硒纳米颗粒和β‑内酰胺类抗生素两者复合体的外表面所获得,纳米硒复合颗粒呈球型结构,内部为硒纳米颗粒和β‑内酰胺类抗生素,外表面为甘露糖改性的壳聚糖,纳米硒复合颗粒的平均粒径为40‑80nm,表面甘露糖改性的壳聚糖外壳的厚度为小于或等于5nm。本发明还提供了一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料,和在纳米抗菌材料中的应用。本发明制备的纳米抗菌材料抑制多重耐药细菌的药物外排泵的表达和β‑内酰胺酶的活性,利用壳聚糖包埋硒纳米粒子和抗生素,有利于提高纳米材料的分散性和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域,具体涉及一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
由于临床滥用青霉素而导致的细菌耐药性产生严重影响了其临床疗效,设计新药或寻找新方法对抗青霉素介导的耐药性是临床上最大的挑战。
药物外排泵的激活和β-内酰胺酶的过度表达是大肠杆菌对青霉素耐药的主要机制。积累的研究证实了细菌外排泵系统AcrAB-TolC可以被非致死浓度的抗生素产生的活性氧激活,另一方面,β-内酰胺酶可以水解青霉素的β-内酰胺环,破坏药物结构并使青霉素失去抗菌活性。尽管,已有将β-内酰胺酶抑制剂与青霉素联合治疗的临床案例,但即使有效抑制了β-内酰胺酶诱导的药物分解,活化的药物外排泵仍然有效,并且仍需要更高的剂量的青霉素才能发挥作用,不仅加大了肝肾毒性,还将促使细菌对青霉素更加耐药,导致恶性循环。基于上述内容,我们提出一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料及其制备方法和应用,以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
本发明提供了一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料,包括纳米硒复合颗粒,所述纳米硒复合颗粒为将甘露糖改性的壳聚糖包覆至硒纳米颗粒和β-内酰胺类抗生素两者复合体的外表面所获得。
作为上述发明的进一步优化方案,所述纳米硒复合颗粒呈球型结构,内部为硒纳米颗粒和β-内酰胺类抗生素,外表面为甘露糖改性的壳聚糖,所述纳米硒复合颗粒的平均粒径为40-80nm,表面甘露糖改性的壳聚糖外壳的厚度为小于或等于10nm。
本发明还提供了一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料在纳米抗菌材料中的应用。
本发明还提供了一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤S1:将D-甘露糖和三乙酰基硼氢化钠溶解于纯水中制得溶液,向该溶液中滴加壳聚糖溶液形成混合溶液,透析、冷冻干燥后获得甘露糖改性壳聚糖;
步骤S2:将所述甘露糖改性壳聚糖溶于乙酸溶液中,再向该溶液中缓慢加入含有亚硒酸钠、抗坏血酸、β-内酰胺类抗生素的三聚磷酸钠溶液,搅拌得到橙色溶液,橙色溶液经过离心洗涤、冷冻干燥后获得反应产物;
步骤S3:将步骤S2中所述反应产物溶于乙酸溶液中,再向溶液中加入含有三羧基苯硼酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的甲醇溶液,搅拌得到混合溶液,混合溶液经过离心洗涤、冷冻干燥后获得纳米硒复合颗粒。
作为上述发明的进一步优化方案,所述步骤S1中壳聚糖溶液制作步骤为:将壳聚糖置于体积浓度1%乙酸溶液中,超声搅拌直至完全溶解,获得壳聚糖溶液。
作为上述发明的进一步优化方案,所述步骤S1中的壳聚糖脱乙酰度大于等于95%,粘度为100-200mpa.s。
作为上述发明的进一步优化方案,所述步骤S1中的透析包括:将混合溶液加入透析袋中,同时给与150rpm的缓慢搅拌,采用超纯水透析72h,每隔24h更换一次纯水。
作为上述发明的进一步优化方案,所述透析袋截留分子量为8-14kDa。
作为上述发明的进一步优化方案,所述步骤S2中的橙色溶液制作步骤为:将含有亚硒酸钠、抗坏血酸、β-内酰胺类抗生素的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度为1.5mL/min。
作为上述发明的进一步优化方案,所述步骤S3中混合溶液的制作步骤为:将三羧基苯硼酸和N-羟基琥珀酰亚胺溶于甲醇溶液中,在室温下搅拌30min得到混合物,然后将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到混合物中搅拌,然后将该混合物加入到反应产物溶液中在室温下搅拌24h。
本发明的有益效果在于:本发明制备的纳米抗菌材料抑制多重耐药细菌的药物外排泵的表达和β-内酰胺酶的活性,利用壳聚糖包埋硒纳米粒子和抗生素,有利于提高纳米材料的分散性和稳定性。甘露糖与细菌菌毛FimH凝集素相互识别,有利于提高纳米药物的靶向识别细菌的能力。本发明的纳米抗菌材料是一种低成本、高安全性、优良的抗菌活性和不易产生耐药性的抗菌材料,提高了纳米材料在医学领域的应用范围,能够实现医用抗菌材料的可持续开发利用。
附图说明
图1:(A)壳聚糖的扫描电镜图;(B)甘露糖改性后壳聚糖的扫描电镜图;(C)纳米硒的透射电镜图;(D)纳米硒复合材料的透射电镜图。
图2:(A)傅里叶红外光谱(a壳聚糖;b甘露糖;c甘露糖改性的壳聚糖;d纳米硒;e氨苄西林;f三羧基苯硼酸;g纳米硒复合材料);(B)紫外可见光分光光谱;(C)实施例1中纳米硒复合材料的元素分析;(D)实施例1中纳米硒复合材料的Zeta电位。
图3:(A)实施例1中纳米硒复合材料的热力学稳定性;(B)实施例1中纳米硒复合材料的动力学稳定性。
图4:(A)各产物与氨苄西林(30μg/mL)处理后对大肠杆菌和耐药大肠杆菌的菌落形成单位的影响。(B)评估各产物与氨苄西林(30μg/mL)对大肠杆菌和耐药大肠杆菌的抑制效果。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述,有必要在此指出的是,以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明,不能理解为对本申请保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
本发明一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤S1:将10mM-50mMD-甘露糖和10mM-50mM三乙酰基硼氢化钠溶解于10-50mL纯水中,将500mg-1g壳聚糖置于30mL-50mL体积浓度1%乙酸溶液中,超声搅拌直至完全溶解,将在乙酸中的壳聚糖缓慢加入到甘露糖溶液中,室温搅拌48h形成混合溶液,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,同时给与150rpm的缓慢搅拌,采用超纯水透析72h,每隔24h更换一次纯水,并通过冷冻干燥,获得甘露糖改性壳聚糖;
步骤S2:将80mg-200mg甘露糖改性壳聚糖溶于40mL-100mL体积浓度1%乙酸溶液中,并将10mg-30mg的三聚磷酸钠溶于15mL纯水中,然后,将1mL的10mM-40mM亚硒酸钠、1mL的50mM-150mM抗坏血酸和50mg-150mgβ-内酰胺类抗生素添加到三聚磷酸钠溶液中,并搅拌10min,然后将含有亚硒酸钠、抗坏血酸、β-内酰胺类抗生素的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度为1.5mL/min,获得橙色溶液,橙色溶液通过离心30min收集反应产物,离心参数为4℃、12000rpm,再用纯水洗涤3次,并通过冷冻干燥,获得反应产物;
步骤S3:将500mg-1g反应产物溶解在50mL-100mL体积浓度1%乙酸溶液中,称取100mg-500mg三羧基苯硼酸和200mg-300mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于50mL-100mL甲醇溶液中,在室温下搅拌30min得到混合物,将300mg-500mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到混合物中搅拌,然后将该混合物加入到反应产物溶液中在室温下搅拌24h得到混合溶液,混合溶液通过离心10min收集最终产物,离心参数为4℃、12000rpm,离心后用甲醇和纯水洗涤3次并通过冷冻干燥获得纳米硒复合颗粒。
实施例1
(1):将20mMD-甘露糖和20mM三乙酰基硼氢化钠溶解于20mL纯水中,将500mg壳聚糖置于30mL体积浓度1%乙酸溶液中,超声搅拌直至完全溶解,将在乙酸中的壳聚糖缓慢加入到甘露糖溶液中,室温搅拌48h形成混合溶液,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,同时给与150rpm的缓慢搅拌,采用超纯水透析72h,每隔24h更换一次纯水,并通过冷冻干燥,获得甘露糖改性壳聚糖;
(2):将80mg甘露糖改性壳聚糖溶于40mL体积浓度1%乙酸溶液中,并将18mg的三聚磷酸钠溶于15mL纯水中,然后,将1mL的20mM亚硒酸钠、1mL的80mM抗坏血酸和55mg氨苄西林添加到三聚磷酸钠溶液中,并搅拌10min,然后将含有亚硒酸钠、抗坏血酸、氨苄西林的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度为1.5mL/min,获得橙色溶液,橙色溶液通过离心30min收集反应产物,离心参数为4℃、12000rpm,再用纯水洗涤3次,并通过冷冻干燥,获得反应产物。
(3):将500mg反应产物溶解在50mL体积浓度1%乙酸溶液中,称取225mg三羧基苯硼酸和230.2mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于50mL甲醇溶液中,在室温下搅拌30min得到混合物,将383.4mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到混合物中搅拌,然后将该混合物加入到反应产物溶液中在室温下搅拌24h得到混合溶液,混合溶液通过离心10min收集最终产物,离心参数为4℃、12000rpm,离心后用甲醇和纯水洗涤3次并通过冷冻干燥获得产物四。
对比例1
(1):将20mMD-甘露糖和20mM三乙酰基硼氢化钠溶解于20mL纯水中,将500mg壳聚糖置于30mL体积浓度1%乙酸溶液中,超声搅拌直至完全溶解,将在乙酸中的壳聚糖缓慢加入到甘露糖溶液中,室温搅拌48h形成混合溶液,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,同时给与150rpm的缓慢搅拌,采用超纯水透析72h,每隔24h更换一次纯水,并通过冷冻干燥,获得甘露糖改性壳聚糖;
(2):将80mg甘露糖改性壳聚糖溶于40mL体积浓度1%乙酸溶液中,并将18mg的三聚磷酸钠溶于15mL纯水中,然后,将1mL的20mM亚硒酸钠、1mL的80mM抗坏血酸添加到三聚磷酸钠溶液中,并搅拌10min,然后将含有亚硒酸钠、抗坏血酸的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度为1.5mL/min,获得橙色溶液,橙色溶液通过离心30min收集反应产物,离心参数为4℃、12000rpm,再用纯水洗涤3次,并通过冷冻干燥,获得反应产物。
(3):将500mg反应产物溶解在50mL体积浓度1%乙酸溶液中,称取225mg三羧基苯硼酸和230.2mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于50mL甲醇溶液中,在室温下搅拌30min得到混合物,将383.4mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到混合物中搅拌,然后将该混合物加入到反应产物溶液中在室温下搅拌24h得到混合溶液,混合溶液通过离心10min收集最终产物,离心参数为4℃、12000rpm,离心后用甲醇和纯水洗涤3次并通过冷冻干燥获得产物一。
对比例2
(1):将20mMD-甘露糖和20mM三乙酰基硼氢化钠溶解于20mL纯水中,将500mg壳聚糖置于30mL体积浓度1%乙酸溶液中,超声搅拌直至完全溶解,将在乙酸中的壳聚糖缓慢加入到甘露糖溶液中,室温搅拌48h形成混合溶液,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,同时给与150rpm的缓慢搅拌,采用超纯水透析72h,每隔24h更换一次纯水,并通过冷冻干燥,获得甘露糖改性壳聚糖;
(2):将80mg甘露糖改性壳聚糖溶于40mL体积浓度1%乙酸溶液中,并将18mg的三聚磷酸钠溶于15mL纯水中,然后,将1mL的20mM亚硒酸钠、1mL的80mM抗坏血酸和55mg氨苄西林添加到三聚磷酸钠溶液中,并搅拌10min,然后将含有亚硒酸钠、抗坏血酸的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度为1.5mL/min,获得橙色溶液,橙色溶液通过离心30min收集反应产物,离心参数为4℃、12000rpm,再用纯水洗涤3次,并通过冷冻干燥,获得反应产物二。
对比例3
(1):将80mg壳聚糖溶于40mL体积浓度1%乙酸溶液中,并将18mg的三聚磷酸钠溶于15mL纯水中,然后,将1mL的20mM亚硒酸钠、1mL的80mM抗坏血酸和55mg氨苄西林添加到三聚磷酸钠溶液中,并搅拌10min,然后将含有亚硒酸钠、抗坏血酸的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度为1.5mL/min,获得橙色溶液,橙色溶液通过离心30min收集反应产物,离心参数为4℃、12000rpm,再用纯水洗涤3次,并通过冷冻干燥,获得反应产物;
(2):将500mg(1)反应产物溶解在50mL体积浓度1%乙酸溶液中,称取225mg三羧基苯硼酸和230.2mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于50mL甲醇溶液中,在室温下搅拌30min得到混合物,将383.4mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到混合物中搅拌,然后将该混合物加入到反应产物溶液中在室温下搅拌24h得到混合溶液,混合溶液通过离心10min收集最终产物,离心参数为4℃、12000rpm,离心后用甲醇和纯水洗涤3次并通过冷冻干燥获得产物三。
图1中A为壳聚糖的扫描电镜图,壳聚糖表现出块状结构,B为甘露糖改性后壳聚糖的扫描电镜图,甘露糖和壳聚糖之间的共价偶联形成的内聚链,使得甘露糖改性的壳聚糖表现出片层装结构;图1中C透射电镜成像表明,纳米硒的直径小于20nm,图1中D透射电镜成像表明,最终的纳米硒复合颗粒具有50nm的平均直径,有利于细菌细胞渗透;氨苄青霉素从中心到表面随机散布在纳米硒中,表面可见甘露糖改性的壳聚糖和三羧基苯硼酸,厚度约为10nm。
图2中A傅里叶红外光谱图用于确认壳聚糖和甘露糖之间的相互作用,如图2中A所示,壳聚糖在1595cm-1处表现出–NH2拉伸振动,另一个在3423cm-1处的能带为胺对称振动,并且2885cm-1处的峰显示出典型的C-H振动,在甘露糖改性的壳聚糖的情况下,在1560cm-1处仲胺的N-H弯曲和1410cm-1处的C=N拉伸揭示了Schiff碱(R-CH=NR键)的形成,证实了甘露糖配体和壳聚糖的胺末端之间形成了一个连接;氨苄青霉素在1774cm-1处具有C=O的拉伸振动,三羧基苯硼酸在770cm-1和1550cm-1处的吸收带分别是硼酸和苯环的特征吸收峰,特征峰都反映在纳米硒复合颗粒中,表明三羧基苯硼酸修饰的甘露糖改性的壳聚糖已成功包覆了氨苄青霉素和硒纳米粒子;图2中B为紫外可见光谱图,硒纳米粒子和氨苄青霉素分别在300nm和240nm处具有特征峰,与纳米硒复合颗粒观察到结果相似;图2中C所示,元素分析进一步用于分析纳米硒复合颗粒的元素组成,结果表明,纳米硒复合颗粒中的硒(36.5%)和硼(11.4%)有很强的信号,分别来自纳米硒和三羧基苯硼酸,元素N(5.6%)的存在表明纳米硒复合颗粒中含有大量的氨苄青霉素,结果表明,本发明的制备方法成功制备了多功能纳米硒复合颗粒;图2中D所示,溶于PBS缓冲液中的硒纳米粒子的Zeta电位约为-21.8mV,产物二的Zeta电位变为+14.2mV,电位的变化是由于甘露糖改性的壳聚糖中氨基暴露在产物表面,纳米硒复合颗粒的Zeta电位为-10.5mV,Zeta电位变为负值,因为三羧基苯硼酸的成功连接,导致羧基暴露于纳米硒复合颗粒表面,电位交替显示每个步骤的修改成功。
图3A为实施例1中纳米硒复合颗粒的热力学稳定性;B为实施例1中纳米硒复合颗粒的动力学稳定性,通过检查纳米硒复合颗粒的聚集和沉降特性,表明了它们的热力学和动力学稳定性;如图3A所示,由于纳米硒复合颗粒的高热力学稳定性,其大小在72小时内没有实质性变化,同时,如图3B所示,纳米硒复合颗粒的透射率变化小于5%,因此它具有很高的动力学稳定性,几乎没有颗粒沉降,优异的稳定性有利于纳米硒复合颗粒的生物学应用。
图4中A为各产物与氨苄西林(30μg/mL)处理后对大肠杆菌和耐药大肠杆菌的菌落形成单位的影响;B为评估各产物与氨苄西林(30μg/mL)对大肠杆菌和耐药大肠杆菌的抑制效果。本发明采用菌落形成单位(CFU)方法评价了纳米硒复合颗粒诱导的体外抗菌活性:如图4A所示,氨苄青霉素显着抑制了大肠杆菌的生长,但对耐药大肠杆菌没有明显生长抑制作用,但是,纳米硒复合颗粒显著抑制了大肠杆菌和耐药大肠杆菌的生长;产物二和产物三在大肠杆菌和耐药大肠杆菌之间表现出显着的抗菌差异,表明三羧基苯硼酸抑制β-内酰胺酶实现了协同抗菌活性;如图4B所示,通过抑菌圈试验用于评估纳米硒复合颗粒诱导的抗菌活性,结果与CFU结果相似,纳米硒复合颗粒具有最大的抑菌圈,表明其具有最优异的抑菌活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料,其特征在于,包括纳米硒复合颗粒,所述纳米硒复合颗粒为将甘露糖改性的壳聚糖包覆至硒纳米颗粒和β-内酰胺类抗生素两者复合体的外表面所获得。
2.根据权利要求1所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料,其特征在于,所述纳米硒复合颗粒呈球型结构,内部为硒纳米颗粒和β-内酰胺类抗生素,外表面为甘露糖改性的壳聚糖,所述纳米硒复合颗粒的平均粒径为40-80nm,表面甘露糖改性的壳聚糖外壳的厚度为小于或等于10nm。
3.一种如权利要求2所述的克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料在纳米抗菌材料中的应用。
4.一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1:将D-甘露糖和三乙酰基硼氢化钠溶解于纯水中制得溶液,向该溶液中滴加壳聚糖溶液形成混合溶液,透析、冷冻干燥后获得甘露糖改性壳聚糖;
步骤S2:将所述甘露糖改性壳聚糖溶于乙酸溶液中,再向该溶液中缓慢加入含有亚硒酸钠、抗坏血酸、β-内酰胺类抗生素的三聚磷酸钠溶液,搅拌得到橙色溶液,橙色溶液经过离心洗涤、冷冻干燥后获得反应产物;
步骤S3:将步骤S2中所述反应产物溶于乙酸溶液中,再向溶液中加入含有三羧基苯硼酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的甲醇溶液,搅拌得到混合溶液,混合溶液经过离心洗涤、冷冻干燥后获得纳米硒复合颗粒。
5.根据权利要求4所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中壳聚糖溶液制作步骤为:将壳聚糖置于体积浓度1%乙酸溶液中,超声搅拌直至完全溶解,获得壳聚糖溶液。
6.根据权利要求4所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中的壳聚糖脱乙酰度大于等于95%,粘度为100-200mpa.s。
7.根据权利要求4所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中的透析包括:将混合溶液加入透析袋中,同时给与150rpm的缓慢搅拌,采用超纯水透析72h,每隔24h更换一次纯水。
8.根据权利要求7所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述透析袋截留分子量为8-14kDa。
9.根据权利要求4所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的橙色溶液制作步骤为:将含有亚硒酸钠、抗坏血酸、β-内酰胺类抗生素的三聚磷酸钠溶液在室温下滴加甘露糖改性壳聚糖溶液中,搅拌速度为300-500rpm,滴加速度1.5mL/min。
10.根据权利要求4所述的一种克服多重耐药细菌感染的硒纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中混合溶液的制作步骤为:将三羧基苯硼酸和N-羟基琥珀酰亚胺溶于甲醇溶液中,在室温下搅拌30min得到混合物,然后将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到混合物中搅拌,然后将该混合物加入到反应产物溶液中在室温下搅拌24h。
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