CN112462066A - Fam3c蛋白及其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应用、试剂盒及其应用 - Google Patents

Fam3c蛋白及其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应用、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤诊断标志物，具体公开了FAM3C蛋白及其特异性抗体作为生物标志物在制备鼻咽癌检测试剂盒的应用，所述试剂盒可为酶联免疫检测试剂盒或免疫组化试剂盒。根据血清或组织样品中FAM3C蛋白的表达水平诊断是否患有鼻咽癌，并进一步评判临床分期和肿瘤转移，有利于鼻咽癌的早期诊断和有效治疗。

Description

FAM3C蛋白及其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应 用、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物诊断领域，更具体地，涉及一种FAM3C蛋白及其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应用、鼻咽癌检测试剂盒以及该试剂盒在检测鼻咽癌中的应用。
背景技术
鼻咽癌起源于鼻咽粘膜上皮，是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一，已成为国人生命健康安全的巨大威胁。颈部淋巴结转移早、远处转移率高是鼻咽癌重要的临床特征，也是导致患者死亡的主要原因。鼻咽癌的早期症状无明显特点，绝大多数患者首次就诊时就已处于局部区域晚期。随着诊断和放疗技术的改进，早中期鼻咽癌患者仅接受单纯放疗其5年生存率可达90％以上，而局部晚期患者即使接受根治性治疗，仍有20％会发生远处转移而导致治疗失败。因此，鼻咽癌早期诊断和有效治疗对于鼻咽癌的防治具有至关重要作用。
恶性肿瘤在发生发展过程中会分泌出细胞因子、蛋白水解酶等多种蛋白质，以维持肿瘤细胞自身生长、侵袭和转移所必需。这些分泌蛋白质可进入患者血液、组织间隙液、尿液等体液中，易于检测，在肿瘤早期诊断、进展监测、寻找潜在肿瘤药物靶点中发挥着重要作用。本课题组从肿瘤分泌蛋白入手，采用定量蛋白质组学方法发现FAM3C为鼻咽癌转移相关分泌蛋白质，并进一步在临床鼻咽癌病人血清、组织样品中证实，相较于健康对照组，FAM3C蛋白在鼻咽癌中的表达明显上调(P<0.05)，且其表达水平与临床分期(P<0.05)和淋巴结转移密切有关(P<0.05)。
人FAM3C基因(Gene ID：10447)位于染色体7q31.31区域，全长47519bp，包含12个外显子。人FAM3C蛋白(UniProt ID：Q92520)由227个氨基酸组成，分子量24680Da，又称为白介素样上皮-间充质转化诱导因子(ILEI)。FAM3C是一种分泌蛋白，属于FAM3蛋白家族成员，其含有信号肽及4个保守的半胱氨酸，后者能形成两对二硫键。FAM3C的正常表达在骨骼分化、阿尔兹海默症以及肝脏糖、脂质代谢等病理生理过程中发挥重要作用。近年来研究发现，FAM3C作为一种新型上皮-间充质转化的调控分子，在肿瘤进展和转移过程中发挥重要作用，但其在鼻咽癌中的表达和功能尚无报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种鼻咽癌相关诊断标志物，并提供了该标志物及其特异性抗体在制备鼻咽癌试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了FAM3C蛋白或其特异性抗体作为鼻咽癌相关诊断标志物在制备检测鼻咽癌的试剂或试剂盒中的应用。
进一步地，所述试剂盒可为酶联免疫检测试剂盒或免疫组化试剂盒。
进一步地，本发明发现了FAM3C蛋白在鼻咽癌中的表达与临床分期和淋巴结转移有关，因此，所述试剂盒可实现对具有鼻咽癌转移潜能的鼻咽癌的检测。
第二方面，本发明提供了一种鼻咽癌的检测试剂盒，该试剂盒为免疫组化试剂盒，该试剂盒包括FAM3C蛋白的一抗和二抗，所述二抗上标记有生物素。
进一步地，所述检测试剂盒还包括枸橼酸盐缓冲液、PBS洗涤液、过氧化物酶阻断剂、山羊血清、链霉素抗生素-过氧化物酶、DAB溶液、苏木素液。
第三方面，本发明提供了一种鼻咽癌检测试剂盒，该试剂盒为酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括生物素标记的FAM3C抗体、标准液、HRP-抗生物素蛋白、TMB底物、洗涤缓冲液和终止液。
第四方面，本发明提供了FAM3C蛋白或其特异性抗体制成的试剂或试剂盒在检测鼻咽癌中的应用。
进一步地，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒或免疫组化试剂盒。
进一步地，所述鼻咽癌为具有鼻咽癌转移潜能的鼻咽癌。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了以FAM3C蛋白及其特异性抗体作为生物标志物在制备鼻咽癌检测试剂盒的应用，以FAM3C蛋白及其特异性抗体作为鼻咽癌诊断与预后的生物标志物，根据分析血清或组织样品中FAM3C蛋白的表达水平诊断是否患有鼻咽癌，并进一步评判临床分期和肿瘤转移，有利于鼻咽癌的早期诊断和有效治疗。
本发明为有效诊断人鼻咽疾病及评判疾病进程提供了新的科学依据。
附图说明
图1为蛋白质组学质谱鉴定结果的火山图及差异倍数分析；
图2为Metascape富集分析鼻咽癌差异分泌蛋白所参与的信号传导途径；
图3为鼻咽癌差异分泌蛋白生物信息学分析结果；
图4为Western blot检测FAM3C在鼻咽癌细胞中的表达和分泌情况；
图5为免疫组化方法分析FAM3C在鼻咽癌组织和正常鼻咽粘膜上皮组织中的表达情况；其中，A图为正常鼻咽粘膜组织染色，B图为无转移鼻咽癌组织染色，C图为有转移鼻咽癌组织染色，D图为临床分期Ⅰ期的鼻咽癌组织染色，E图为临床分期Ⅱ期的鼻咽癌组织染色，F图为临床分期Ⅲ期的鼻咽癌组织染色；
图6为酶联免疫法检测FAM3C在鼻咽癌患者血清和正常健康人血清中的表达情况。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获取得到。
实施例1
本实施例的目的在于说明定量蛋白质组学方法筛选发现FAM3C在高转移鼻咽癌细胞系中表达上调：
发明人采用体内稳定同位素标记(Stable isotope labeling with amino acidsin cell culture,SILAC)的定量蛋白质组学方法筛选发现，FAM3C分泌蛋白在高转移潜能鼻咽癌细胞(5-8F)的培养上清中的表达显著高于无转移潜能鼻咽癌细胞(6-10B)，结果提示FAM3C蛋白表达上调可能与鼻咽癌细胞的转移潜能有关。具体实验方案如下：
1)SILAC技术标记细胞：将稳定同位素重链K8R10-‘heavy’(88209，89990，Thermo公司)、轻链K0R0-‘light’(89987，89989，Thermo公司)分别加入不同转移潜能的鼻咽癌细胞系(5-8F、6-10B)中进行体内标记，采用10％透析型血清(89986，Thermo公司)的条件培养基(89984，Thermo公司)传代培养6-8代。
2)分泌蛋白富集：状态良好的细胞长至70-80％密度时，采用1000g离心10分钟收集上清，经0.22μm滤器(Millipore公司)进行过滤后，再将上清转移到3kD超滤离心管中(15mL，Millipore公司)，4000g离心60分钟，收集标记好的鼻咽癌细胞分泌蛋白并用2DQuant Kit定量(80-6483-56，GE Healthcare公司)。
3)差异蛋白筛选：采用液相色谱分析结合质谱鉴定技术分析鉴定分泌蛋白质，生物信息学方法确定筛选倍数并对差异蛋白进行GO富集度、聚类以及信号通路等分析，以初步探究这些分泌蛋白在鼻咽癌进展过程中的变化规律。分析结果如图1-3所示。
图1所示为质谱鉴定结果的火山图及差异倍数分析；图2所示为Metascape富集分析鼻咽癌差异分泌蛋白所参与的信号传导途径；图3所示为鼻咽癌差异分泌蛋白生物信息学分析结果，其中，A图为生物学过程，B图为分子功能，C图为KEGG信号通路，D图为细胞组成；表1所示为5-8F高转移鼻咽癌细胞系中表达上调和下调的差异分泌蛋白质。
表1鼻咽癌细胞转移相关分泌蛋白质列表
Figure BDA0002814420950000051
实施例2
本实施例目的在于说明FAM3C蛋白在鼻咽癌细胞系中的表达和分泌情况。
采用Western blot验证FAM3C分别在鼻咽癌细胞总蛋白及分泌蛋白中的表达差异，具体操作流程如下：
1)样品蛋白准备：收集已培养好鼻咽癌细胞(5-8F、6-10B)，用预冷的0.01M PBS洗涤细胞3遍后，加入细胞RIPA裂解液(碧云天)冰上裂解60分钟，12000rpm离心40分钟后收集上清即为细胞总蛋白。分泌蛋白的富集方法同实施例1，采用BCA法(诺唯赞)测定蛋白浓度。
2)SDS-PAGE电泳：取蛋白样品(20μg)与2×上样缓冲液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，200mM DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)等体积混匀，95℃煮沸5分钟后快速置于冰上使之冷却10分钟，短暂离心后采用12％的SDS-PAGE胶上样。电泳时，首先设置60V电压作用30分钟，观察指示带从积层胶进入分离胶后，此时将电压改为100V继续电泳分离，注意观察指示带距离分离胶底部大约1厘米处时停止电泳。
3)转膜：先用无水甲醇浸泡PVDF膜10分钟，再用纯水浸泡5分钟，然后将PVDF膜、滤纸和凝胶一起用预冷的转膜缓冲液(39mM/L甘氨酸，48mM/L Tris碱，0.037％SDS，20％甲醇)浸泡10分钟制成“三明治”。采用100V恒压转膜“三明治”50分钟，蛋白即可从凝胶成功转印至PVDF膜上。
4)抗体孵育：采用5％脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1小时，根据目的蛋白分子量剪开PVDF膜，分别用FAM3C特异性抗体(Thermo公司，PA5-80614)和Actin内参抗体(sigma公司，A5441)于4℃冰箱中孵育过夜，并于次日分别用羊抗兔(KPL公司，04-15-06)、羊抗鼠(KPL公司，04-18-06)二抗室温孵育1小时。
5)化学发光：配制适量ECL发光液，BIORID凝胶成像仪显影。
6)使用SPSS统计软件处理数据并平均值±SEM表示，学生t检验进行组间差异比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。*P＜0.05；**P＜0.01。
图4显示Western blot验证FAM3C在鼻咽癌细胞中的表达和分泌情况。结果显示，FAM3C在5-8F高转移潜能鼻咽癌细胞总蛋白和分泌蛋白中表达均高于6-10B无转移潜能鼻咽癌细胞(P＜0.05)。
实施例3
本实施例用于说明免疫组化方法分析FAM3C蛋白在鼻咽癌组织样品中表达的临床意义。
以FAM3C特异性抗体(proteintech公司，60282-1-1g)联合S-P免疫组化分析试剂盒(福建迈新)组成诊断试剂盒，按试剂盒操作步骤进行：
a.烤片：将准备好的石蜡组织切片置于切片架上，放入60℃烤箱烤片1小时。
b.脱蜡：烤好的切片立刻依次放入100％二甲苯中脱蜡，每次20分钟，共脱蜡2次。
c.水化：脱蜡后的切片依次采用梯度酒精(100％、95％、75％、50％)进行水化，每次5分钟，然后用0.01M PBS液洗3次，每次5分钟。
d.抗原修复：将0.01M枸橼酸盐缓冲液加入切片盒中加热至沸腾，轻轻放入水化好的切片，95℃煮沸15分钟，之后待液体温度自然冷却至室温，用0.01M PBS液洗涤3次，每次5分钟。
e.用滤纸轻轻吸干组织周边的液体后，于每片组织表面上加一滴试剂A(过氧化物酶阻断剂)以完全盖住组织，室温下孵育10分钟后，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。
f.用滤纸轻轻吸去PBS液，于每片组织上滴加一滴试剂B(山羊血清)，室温下孵育10分钟。
g.轻轻吸去组织上血清，加入预冷稀释好的FAM3C一抗(1:200)，将切片置入湿盒盖紧，4℃冰箱中孵育过夜。
h.次日取出湿盒常温下孵育30分钟，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。
i.每片组织表面加一滴试剂C(生物素标记的二抗)，室温下孵育10分钟后，0.01MPBS液洗涤3次，每次5分钟。
j.每片组织表面滴加一滴试剂D(链霉素抗生物素-过氧化物酶)，室温下孵育10分钟后，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。
k.用滤纸轻轻吸去组织液体，每片组织加适量新配的DAB溶液，低倍显微镜下仔细观察，掌握染色程度。双蒸水洗涤3次，每次2分钟。
l.每片组织表面滴加一滴苏木素液复染5-8分钟，新配的1％盐酸酒精分色约3秒后，流水中返蓝15分钟。
m.返蓝后的组织切片经梯度酒精(50％、75％、95％、100％)依次脱水，100％二甲苯透明5分钟，风干30分钟，60℃温箱烤片10分钟后，滴加中性树胶并封片保存。
n.免疫组化分析采用双盲法，通过积分法计算，即以显微镜下组织染色强度、阳性细胞比例进行综合计分。每张组织切片随机选取至少10个视野(×200)进行评分。染色强度计分：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。计算阳性细胞比例：无着色计0分；＜30％比例计1分；30％-60％比例计2分；≥60％比例计3分。染色强度与阳性细胞比例相加计量：0-2分为弱阳性(+)；3-4分为阳性(++)；5-6分为强阳性(+++)。染色结果采用SPSS软件进行统计分析，统计方法为卡方检验，P＜0.05为有统计学意义。
免疫组化结果如图5所示，其中A图正常鼻咽粘膜上皮组织，B图为无转移的鼻咽癌组织，C图为有转移的鼻咽癌组织，D图为临床分期I期的鼻咽癌组织，E图为临床分期II期的鼻咽癌组织，F图为临床分期III期的鼻咽癌组织。由图5(A-C)可知，FAM3C蛋白在有转移鼻咽癌组织中的表达明显高于无转移鼻咽癌组织中的表达，而且两者均较正常鼻咽癌粘膜组织高。另外，由图5(D-F)显示结果可知，鼻咽癌临床分期越晚，FAM3C表达越强。
表2-3分别为FAM3C在鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中的表达情况以及FAM3C与鼻咽癌病人临床病理特征之间的关系。根据表2-3结果显示，FAM3C蛋白在鼻咽癌中的表达显著高于正常鼻咽粘膜组织(P＜0.0001)；FAM3C在鼻咽癌组织中的表达与其临床分期密切相关(P＜0.05)，临床分期越晚，表达越强；FAM3C在有淋巴结转移鼻咽癌组织中的表达明显高于无淋巴结转移鼻咽癌组织(P＜0.05)；FAM3C在鼻咽癌组织中的表达与患者年龄、性别、有无肿瘤复发无关(P＞0.05)。
表2 FAM3C蛋白在鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中的表达
Figure BDA0002814420950000091
表3 FAM3C蛋白表达与鼻咽癌病人临床病理特征之间的关系
Figure BDA0002814420950000092
Figure BDA0002814420950000101
实施例4
本实施例用于说明酶联免疫实验检测FAM3C在健康人群和鼻咽癌患者血清中表达情况，以FAM3C Elisa试剂盒(武汉华美公司)构建诊断试剂盒，实验操作步骤如下：
1)实验前试剂配制
①生物素抗体(1x)：在打开前离心小瓶，生物素抗体需要100倍稀释。建议的100倍稀释度是10μL生物素抗体+990μL生物素抗体稀释剂。
②HRP-抗生物素蛋白(1x)：在打开前离心小瓶，HRP-亲和素需要稀释100倍。建议的100倍稀释度是10μL HRP-抗生物素蛋白+990μL HRP-抗生物素蛋白稀释剂。
③洗涤缓冲液(1x)：如果浓缩液中形成了晶体，需加热至室温并轻轻混合直至晶体完全溶解。将20mL洗涤缓冲液浓缩液(25x)稀释到去离子水或蒸馏水中，以制备500mL洗涤缓冲液(1x)。
④标准品：将标准样品瓶在6000-10000rpm下离心30秒。用1mL样品稀释液重新配置标准液制成4000pg/mL的储备溶液。移取250μL样品稀释液到每个试管中(S0-S6)，使原液产生2倍稀释系列(如表4)，在下次移取之前，将各管彻底混合。未稀释的标准液作为高标准液(4000pg/mL)，样品稀释液用作零标准品(0pg/mL)。
表4
Figure BDA0002814420950000102
2)具体实验步骤
①按照上述“1)实验前试剂配制”的说明准备所有试剂、工作标准液和血清样品；
②96孔微孔板中每孔加入100μL标准液和鼻咽癌患者血清样品或者正常人血清样品，用提供的胶带覆盖孔口，在37℃下孵育2小时；
③清除每个孔中的液体，勿洗涤；
④向每个孔中添加100μL生物素抗体(1x)，盖上新的封口胶带，在37℃下孵育1小时(1x生物素抗体可能会出现浑浊，预热至室温并轻轻混合至溶液均匀为止)。
⑤吸出每个孔并洗涤，重复该过程两次，共清洗3次，最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去所有剩余的洗涤缓冲液，翻转板，并用干净的纸巾将其吸干。
⑥向每个孔中加入100μL HRP-抗生素蛋白(1x)，用新的封口胶带覆盖空口，37℃下孵育1小时。
⑦按步骤6重复5次吸取/冲洗过程。
⑧向每个孔中加入90μL TMB底物，在37℃下避光孵育30分钟。
⑨向每个孔中添加50μL 2M H2SO4终止液，轻轻敲打板以确保充分混合。
⑩使用设置为450nm的酶标仪，在5分钟内确定每个孔的光密度，如果可以进行波长校正，则设置为540nm或570m，从450nm的读数中减去540nm或570nm的读数。将每个标准品和样品的重复读数取平均值，然后减去平均零标准品光密度，通过使用能够生成四参数对数(4-PL)曲线拟合的计算机软件以减少数据来建立标准曲线，或者通过在x轴上绘制每种标准品的平均吸光度对应y轴上的浓度来绘制标准曲线，并通过图中的点绘制最佳拟合曲线。
3)数据分析
使用SPSS统计软件处理数据并平均值±SEM表示，学生t检验进行组间差异比较。P＜0.05的值被认为具有统计学意义，*P＜0.05；**P＜0.01。
分析结果如图6所示。如图6，酶联免疫实验结果显示，FAM3C蛋白在鼻咽癌患者血清中的表达明显高于健康人群(P＜0.01)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.FAM3C蛋白或其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒或免疫组化试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以FAM3C蛋白或其特异性抗体作为生物标志物，检测FAM3C蛋白或其特异性抗体在鼻咽癌组织中的相对表达量。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述鼻咽癌为具有鼻咽癌转移潜能的鼻咽癌。
5.一种鼻咽癌检测试剂盒，所述试剂盒为免疫组化试剂盒，其特征在于，包括FAM3C蛋白的一抗和二抗，所述二抗上标记有生物素。
6.根据权利要求5所述的鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，还包括枸橼酸盐缓冲液、PBS洗涤液、过氧化物酶阻断剂、山羊血清、链霉素抗生素-过氧化物酶、DAB溶液和苏木素液。
7.一种鼻咽癌检测试剂盒，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括生物素标记的FAM3C抗体、标准液、HRP-抗生物素蛋白、TMB底物、洗涤缓冲液和终止液。
8.FAM3C蛋白或其特异性抗体制成的试剂或试剂盒在检测鼻咽癌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒或免疫组化试剂盒。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述鼻咽癌为具有鼻咽癌转移潜能的鼻咽癌。
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龚朝建;黄宏斌;徐柯;梁芳;李小玲;熊炜;曾朝阳;李桂源;: "microRNAs与TP53基因调控网络研究进展" *

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