CN112439079B - 有机溶剂法制备载药笼状蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了有机溶剂法制备笼状蛋白包载药物。本发明包载药物的笼状蛋白的制备方法，包括以下步骤：步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；和步骤(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液。本发明工艺通过非变性和非解聚的方式，避免笼状蛋白发生蛋白变性或者出现笼状蛋白结构缺损，载药效果稳定，通过本发明的方法获得的产品均一，稳定，成药性好。

Description

有机溶剂法制备载药笼状蛋白
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种利用有机溶剂进行笼状蛋白载药的制备方法。
背景技术
笼状蛋白是通过蛋白质组装形成的中空的蛋白粒子，天然笼状蛋白包括铁蛋白、病毒衣壳蛋白、小热休克蛋白和网格蛋白有被小泡等。其中，铁蛋白是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的天然铁贮存蛋白，具有独特的球形空壳结构和可逆自组装特性。
本发明人研究团队相继发现铁蛋白可以用于肿瘤的体外诊断(《NatureNanotechnology》,2012)、肿瘤的体外诊断、体内治疗(《PNAS》，2014)、体内肿瘤多模成像(《ACS Nano》,2016)和穿越血脑屏障作为靶向治疗脑恶性脑瘤(《ACS Nano》，2018)，极大的拓宽了铁蛋白在诊断和治疗领域的应用潜力。
以铁蛋白来包载药物，除了铁蛋白自身具备肿瘤特异性靶向功能和穿越血脑屏障的优越性能外，与未包载的药物相比，铁蛋白包载药物还具有能够定点释放、降低药物副作用、减少药物用量、延长药效等优点。且铁蛋白自身热稳定好，因此铁蛋白包载药物稳定性高、药效稳定。另外，铁蛋白属于天然蛋白载体，其具有更好的生物相容性，其不会引发机体的免疫反应，且不会增加机体的代谢负担。
现有技术的方法中，含脲的包被体系容易造成铁蛋白变性；高压包药的方式则对包被设备、成本的要求高，且限制了对高压敏感的药物的应用；通过pH剧烈变化进行包药，容易导致重新组装后的铁蛋白部分不完整，有缺损。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：现有方法或者过于剧烈，导致笼状蛋白变性，包被的后铁蛋白药物缺损，质量无法保障；或者包被成本高、工艺复杂，不容易产业化；或者包被后的药物不稳定，不利于成药。
本发明人为解决上述技术问题发现，通过在包药溶液中添加一定浓度的有机溶剂，使得笼状蛋白氨基酸分子间作用力被破坏，蛋白通道松散，从而使得药物更快进入笼状蛋白的空腔中，增加药物包载效率。有机溶剂的处理不会导致铁蛋白解聚，不会造成铁蛋白损失或者破损，是一种以温和方式兼顾包药效率/品质的新方法。在包药完成后，通过去除包药系统中的有机溶剂，笼状蛋白结构能够恢复其包药前的高级结构状态，从而实现温和自然、无损高效、均质稳定、低成本的包药。
具体来说，本发明提出了如下技术方案：
一种包载药物的笼状蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；
和步骤(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液；
任选地，还包括步骤(c)：去除笼状蛋白笼外的游离药物和有机溶剂；
优选地，步骤(a)采用混合或者溶液置换的方式；
所述溶液置换采用如下一种或两种以上的工艺进行：
工艺A：通过透析的方式将笼状蛋白的溶液笼外溶液置换成为含有有机溶剂的溶液；
工艺B：通过离心过滤的方式；优选地，所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤，进一步优选地，所述超滤离心管截留分子量为50-150KD，优选100KD；
工艺C：通过凝胶过滤层析的方式；优选地，所述凝胶过滤层析的方式是使用Superdex 75pg凝胶柱过滤层析。
本发明的有益效果包括：
1.本发明工艺通过非变性和非解聚的方式，避免笼状蛋白发生蛋白变性或者出现笼状蛋白结构缺损，载药效果稳定。
2.通过本发明的方法获得的产品均一，稳定，成药性好。
下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。
附图说明
图1为未包载DOX的HFn的TEM照片，图中标尺为50nm。
图2为实施例1制备得到的HFn-DOX的TEM照片，图中标尺为50nm。
图3为未包载DOX的HFn的紫外吸收光谱图。
图4为实施例1制备得到的HFn-DOX的紫外吸收光谱图。
图5为实施例1中制备得到的HFn-DOX与Trf1的结合活性结果。
图6为未包载DOX的HFn、实施例1制备得到的HFn-DOX和游离阿霉素(图中DOX)的药物活性结果图。
具体实施方式
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。
在本说明书和下面的权利要求书中，术语被定义为具有以下含义:
铁蛋白：“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径12nm，内径8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”，未特别指明时，本文所述“铁蛋白”包括了“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选动物铁蛋白，进一步优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白(Fn)和马脾铁蛋白(HSF)。本文所述铁蛋白包括野生型铁蛋白、铁蛋白突变体、铁蛋白衍生物或重组铁蛋白；任选地，所述铁蛋白来源包括人、动物、植物、细菌；优选所述人来源的铁蛋白选自人H型铁蛋白和/或人L型铁蛋白；所述动物来源铁蛋白优选马脾铁蛋白；所述细菌来源铁蛋白优选激烈火球菌铁蛋白。
真核生物铁蛋白通常包括重链H亚基和轻链L亚基。在不同的种属和同一种属体内不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。例如HSF是从马脾中提取的铁蛋白，马脾铁蛋白的H亚基和L亚基的比值为1/9。通过重组方式，也可以获得仅由24个H亚基组装成的“H铁蛋白(HFn)”或仅由24个L亚基组装成的“L铁蛋白(LFn)”。
在本发明中，HFn和LFn指由全由人24个H型亚基或全由人24个L型亚基组成的铁蛋白。人H型亚基的序列可参考GenBank Acession No:AAH66341.1，人L型亚基的序列可参考GenBank Acession No:NP_000137.2。
本发明所述的真核生物铁蛋白还包括植物体铁蛋白，所述的原核生物铁蛋白包括细菌、真菌的铁蛋白，如激烈火球菌铁蛋白。
笼状蛋白：“笼状蛋白”是指由氨基酸形成的具有内部中央空腔的三维蛋白结构，即笼状结构。笼状蛋白可以具有对称结构，也可以具有非对称结构，笼状蛋白包含铁蛋白、小热休克蛋白(sHsp)、病毒衣壳蛋白或网格蛋白有被小泡等。
铁蛋白突变体：指在铁蛋白氨基酸序列的基础上，进行氨基酸氨基酸的置换、截短、延长等操作，但仍具有与铁蛋白相同包载功能的蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白突变体包含至少一个与GenBank Acession No:AAH66341.1和/或GenBank Acession No:NP_000137.2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％氨基酸序列相同性的H亚基序列和/或L亚基。
铁蛋白衍生物：指包含经过人工改造的(经修饰的)铁蛋白亚基的铁蛋白。本领域已知多种经人工改造的铁蛋白亚基，该衍生物适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。人工改造(经修饰)的形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
小热休克蛋白(small Heat Shock Proteins，sHsp)：小热休克蛋白是热休克蛋白中的成员，是在进化中高度保守的一系列分子量较小(介于15-30kD)的蛋白质，由十几个到二十几个亚基构成的球状笼形空心结构。
病毒衣壳蛋白：包围在病毒核酸外的一层蛋白质。由一定数目的壳粒组成，壳粒是一种形态亚单位，电镜下壳粒呈对称性排列。
网格蛋白有被小泡：网格蛋白由相对分子质量为180kDa的重链和相对分子质量为35～40kDa的轻链组成二聚体，三个二聚体形成包被的基本结构单位——三联体骨架(triskelion)，称为三腿蛋白(three-legged protein)。许多三腿再组装成六边形或五边形网格结构，即包被亚基，然后由这些包被亚基组装成网格蛋白有被小泡。
ddH2O：双蒸水，指经过2次蒸馏而得的水。
溶液置换：指以水或新的溶液置换笼状蛋白的笼外溶液的过程。
DOX：阿霉素(Doxorubicin)，一种广谱抗肿瘤药物，适用于急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。
如上所述，本发明的目的在于提供一种温和地包载药物的方法，避免蛋白发生变性或者蛋白回收率降低等问题。本发明还涉及由该包载药物的方法制备获得的产品，以及该产品在制备药物中的应用。
本发明优选的技术方案中，提供了有机溶剂法制备包载药物的笼状蛋白的方法步骤，包括步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；
和(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液；
任选地，包括(c)：去除笼状蛋白笼外的游离药物和有机溶剂。
当笼状蛋白、有机溶剂和药物存在于同一系统时，在有机溶剂的作用下，笼状蛋白结构变得松散，药物得以进入到笼内。
本发明优选的技术方案中，步骤(a)采用以下方式：
方式(1)通过混合的方式获得含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；或
方式(2)通过溶液置换的方式获得含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；
进一步优选地，方式(1)采用如下混合工序的一种：
工序(i)将有机溶剂、药物和笼状蛋白同时混合，制备混合溶液；
工序(ii)先制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白中的两种物质的的混合溶液，而后再加入第三种物质，获得含有三者的混合溶液；
工序(iii)先制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白中的一种物质的的溶液，而后再加入另外两种物质，获得含有三者的混合溶液；本发明优选的技术方案中，方式(2)采用如下一种或两种以上的工艺进行溶液置换：
工艺A：通过透析的方式将笼状蛋白的笼外溶液置换成为含有有机溶剂的溶液；
工艺B：通过离心过滤的方式将笼状蛋白的笼外溶液置换成为有机溶剂；优选地，所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤，进一步优选地，所述超滤离心管截留分子量为50-150KD，优选100KD；
工艺C：通过凝胶过滤层析的方式将含有笼状蛋白的笼外溶液置换成有机溶剂；优选地，所述凝胶过滤层析的方式是使用Superdex 75pg凝胶柱过滤层析；任选地，步骤(a)所述混合溶液还含有辅料；优选的辅料选自甘油、蔗糖、异丙醇、葡萄糖、海藻糖和乳糖的一种或两种以上。其中加入甘油等辅料可以增加蛋白质的稳定性，降低缓冲溶液的极性，从而防止蛋白疏水聚集，也可以减少蛋白样品处理过程中的非特异性吸附。
本发明优选的技术方案中，其中，步骤(a)中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、氯仿、甲醇和异丙醇中的一种或两种以上；优选地，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇和/或氯仿；进一步优选地，所述有机溶剂选自二甲基亚砜。
本发明优选的技术方案中，其中，步骤(a)中所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为5-30％，优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为5-25％，进一步优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-20％，进一步优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-15％，进一步优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-10％。
本发明优选的技术方案中，其中，步骤(a)所述混合溶液含有水、Tris-HCl、HEPES-NaCl缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液、丙烯酰胺缓冲液中的一种或两种以上；优选地，所述缓冲溶液选自Tris-HCl；
进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为10-100mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为25-75mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为40-75mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为45-55mmol/L，进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为50mmol/L。
本发明优选的技术方案中，其中，所述笼状蛋白选自铁蛋白、小热休克蛋白(sHsp)病毒衣壳蛋白或网格蛋白有被小泡；优选地，所述笼状蛋白选自铁蛋白；
进一步优选地，所述铁蛋白含有L亚基和/或H亚基，进一步优选地，所述铁蛋白含有L亚基和H亚基的数量比为0-24:24-0，进一步优选数量比为9:1，24:0或0:24。
本发明优选的技术方案中，其中，所述铁蛋白选自野生铁蛋白、铁蛋白突变体、铁蛋白衍生物和/或重组铁蛋白；优选地，所述铁蛋白来源包括人、动物、植物和/或细菌；进一步优选地，人来源的铁蛋白选自人H型铁蛋白和/或人L型铁蛋白；动物来源的铁蛋白选自马脾铁蛋白；细菌来源的铁蛋白选自激烈火球菌铁蛋白。
本发明优选的技术方案中，其中，所述步骤(a)所述混合溶液中笼状蛋白的浓度为1-20mg/mL；优选为2-8mg/mL，进一步优选为2-6mg/mL。
本发明优选的技术方案中，其中，所述药物选自氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、卡铂、草酸铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤、培美曲塞、5-FU、FT-207、卡培他滨、6-巯基嘌呤、6-TG、羟基脲、阿糖胞苷、吉西他滨、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、氯醌、心得安、戊烷脒、表阿霉素、癌霉素、盐酸阿霉素、THP-阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素、道诺霉素、伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱、紫杉醇、多西他赛、长春花碱、去甲长春花碱、鬼臼碱类、高三尖杉酯碱、门冬酰胺酶、三苯氧胺、托瑞米芬、依西美坦、氨苯乙哌啶酮、福美司坦、来曲唑、阿那曲唑、甲孕酮、甲地孕酮、甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮、己烯雌酚、阿托品、多巴胺、毛果芸香碱、蒽胺、苯海索、苯扎托品、丙环定、麦角碱类衍生物、氟它氨、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和贝伐珠单抗中的一种或两种以上；
优选地，所述药物选自柔红霉素、阿霉素、氯醌、心得安、戊烷脒、表阿霉素、癌霉素、盐酸阿霉素、THP-阿霉素、盐酸伊立替康、阿替洛尔、盐酸川穹嗪、马钱子碱、盐酸左氧氟沙星、左旋多巴、盐酸洛拉曲克和米托蒽醌中的一种或两种以上；
进一步优选地，所述药物选自阿霉素、表阿霉素、盐酸阿霉素和THP-阿霉素中的一种或两种以上。
本发明优选的技术方案中，步骤(a)所述混合溶液中药物的浓度为0.1-1.5mg/mL，优选地，药物的浓度为0.2-1mg/mL，进一步优选地，药物的浓度为0.25-0.75mg/mL，进一步优选地，药物的浓度为00.5-0.75mg/mL。
本发明的技术方案中，所述笼状蛋白包括经过预处理的笼状蛋白，经过预处理的笼状蛋白具备笼状蛋白包载药物的活性和功能，优选的，所述经过预处理的笼状蛋白为铁蛋白。预处理的方法包括用含铵盐和/或脂肪胺盐的溶液处理笼状蛋白；优选地，所述铵盐选自(NH4)2SO4，CH3COONH4，NH4EDTA，(NH4)3PO4，(NH4)2·HPO4，葡萄糖醛酸铵和枸橼酸铵中的一种或两种以上，所述脂肪胺盐(CH3NH3)2SO4、(CH3CH2NH3)2SO4、[(CH3CH2)2NH2]2SO4、(CH3CH2CH2NH3)2SO4和[CH3(CH2)4NH3]2SO4中的一种或两种以上。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(b)包括如下工序：
将步骤(a)制得的含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液放置于25-70℃，优选放置于37-65℃，更优选放置于40-60℃，再优选为50℃-60℃；进一步优选地，放置1h以上，进一步优选放置1-24h；当温度选择25℃-50℃，优选孵育时间为10-20h，更优选12-15h；当温度选择55℃-60℃时，优选孵育时间0.5-5h，更优选1-3h。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(c)包括如下去除方式中的一种或两种以上的任意组合：
去除方式1：向步骤(b)制得的含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液中加入缓冲溶液进行透析；
去除方式2：向步骤(b)制得的含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液中加入生理缓冲溶液离心过滤；优选地，所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤，进一步优选地，所述超滤离心管截留分子量为2-5KD，优选3KD；
去除方式3：将步骤(b)制得的含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液装载于层析柱中，向所述层析柱中加入缓冲溶液层析过滤；
优选地，所述生理缓冲溶液选自水、Tris-HCl、HEPES-NaCl缓冲液、NH4AC、NaAC、Bis-Tris-HCl缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液、丙烯酰胺缓冲液中的一种或两种以上；进一步优选地，所述缓冲溶液选自Tris-HCl或HEPES-NaCl缓冲液或Bis-Tris-HCl缓冲液；
进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为10-100mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为25-75mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为40-75mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为45-55mmol/L，进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为50mmol/L；
进一步优选地，所述HEPES-NaCl缓冲液中HEPES浓度为5-50mM，优选5-20mM，更优选7-15mM；NaCl浓度为50-250mM，优选75-200mM，更优选75-150mM；
进一步优选地，所述Bis-Tris-HCl、NH4AC和NaAC的浓度为10-150mM，优选30-100mM，更优选50mM。
本发明优选的技术方案中，步骤(a)所述有机溶剂选自二甲基亚砜。
本发明优选的技术方案中，任选地，步骤(a)所述混合溶液，以及步骤(c)所述的缓冲溶液还含有辅料；所述辅料优选自甘油、蔗糖、异丙醇、葡萄糖、海藻糖和乳糖的一种或两种以上；
任选地，所述混合溶液中的甘油或异丙醇的体积百分比浓度为5-20％，优选地，体积百分比浓度为5-15％，更优选10-15％；
任选地，蔗糖、乳糖或海藻糖的质量百分比浓度为5-20％，优选地，蔗糖的质量百分比浓度为5-15％，更优选10-15％。
另一方面，本发明还涉及根据所述的制备方法制备获得的产品，该产品以上述任何一种方式制备获得，所述产品中，笼状蛋白单体含量大于60％，优选大于70％，更优选大于80％，最优选大于90％。
再一方面，本发明还涉及使用本发明所述的制备方法获得的产品在制备药物中的应用。所述制备可以是以本发明的产品为主要活性成分的，添加本领域已知的药物辅料后获得药物制剂；也可以是将本发明的产品作为活性成分之一，与一种以上的其他药物制备成为药物组合物。
下面通过具体实施例来说明本发明的有机溶剂法制备包药铁蛋白。
以下实施例中所用到各试剂和仪器来源如下表1所示，本文未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容：
表1实施例所用试剂和仪器
H铁蛋白制备实施例
以下实施例中，H铁蛋白(HFn)均通过如下制备方法制备得到：
根据人H铁蛋白的野生型氨基酸序列(参考GenBank:AAH66341.1)的序列，在上述核苷酸序列前加Nde1酶切位点，在该序列之后加终止密码子和BamH1酶切位点序列，通过全基因合成，测序正确后，连接至pET22b表达质粒载体中，IPTG诱导表达、纯化获得H铁蛋白，保存在pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液中备用。
实施例1
考察在存在DMSO的包药体系下，使用不同辅料对HFn-DOX包载效果的影响。
1.工艺参数
HFn：4mg/mL阿霉素(DOX)：0.75mg/mL
DMSO浓度(在包药混合溶液中的浓度)：7％、10％、20％(v/v)
孵育温度：42℃
孵育时间：15h
孵育缓冲溶液：pH 8.0 50mM Tris-HCl
辅料：15％(v/v)甘油、15wt％蔗糖
2.工艺流程(10mL体系)
2.1样品准备及制备
首先将保存在pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液中的HFn浓缩至约20mg/mL备用，准确称取7.5mg的DOX，向其中加入1mL DMSO使得DOX完全溶解，后加入甘油，补加适量pH 8.050mM Tris-HCl缓冲溶液，后充分震荡混合均匀并于42℃水浴下预热3min，最后加入40mgHFn，并用pH8.050mM Tris–HCl缓冲溶液定容至10mL。
使用振荡器将样品混合30s，然后置于42℃水浴锅中孵育15h。
2.2样品处理
提前开启AKTA avant 150蛋白纯化系统，选择Superdex 75pg脱盐柱，先使用去离子水清理系统及柱子，后用含15％甘油的pH:8.0 50mM Tris–HCl缓冲溶液平衡柱子(约3CV)，以及润洗上样环。将上述2.1部分中孵育好的样品先冷却至室温后过0.22μm滤器，注入上样环中开始进样，用含15％甘油的pH:8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液洗脱，脱去游离DOX、DMSO等，A280紫外吸收条件下收集蛋白部分的洗脱液，即为HFn-DOX成品。
2.3样品测定及方法
2.3.1包载后样品表征
透射电镜(TEM)实验方法：将未经有机溶剂处理，以及经过本实施例2.2部分所述的有机溶剂包药处理的H铁蛋白-DOX样品(20μL,0.1mg/mL)滴加到处理后的铜网中，用1％的乙酸铀酰染色1分钟,然后用JEM-1400 80kv TEM(JEOL，Japan)成像。如图1和图2所示铁蛋白在12nm左右，图2显示经过处理后的H铁蛋白-DOX仍旧保留完整的笼状结构。
2.3.2 HFn-DOX包载量测定和计算方法：
HFn的紫外最大吸收峰对应波长为280nm，DOX的紫外最大吸收峰对应波长为485nm。
A：用NANODROP分光光度计测定样品在485nm处的吸光值，根据浓度曲线(配制不同浓度的DOX标准品并测定A485 nm吸光度值，做曲线)，获得对应样品中DOX的浓度。
B:测定样品的A280的数值(记为数值1)，并根据A中得出的DOX浓度，配制该浓度的DOX溶液，测定其A280值(记为数值2)。数值1减去数值2后，获得的数值除以蛋白的消光系数0.897(各实施例处理数据中所有HFn浓度均使用0.897消光系数)，得到HFn-DOX中HFn的浓度。
分别根据A，B的浓度结果，结合DOX和HFn的分子量(HFn分子量为504000、DOX分子量为579.99)，计算出摩尔浓度，然后根据DOX/HFn摩尔比，计算得到单位HFn分子中DOX的包载量(具体包载结果参见第3部分)。
2.3.3 HFn-DOX包载进笼内以及HFn单体比例测定：
使用高效液相色谱-体积排除色谱(HPLC-SEC)的方法测定DOX是否包载在HFn笼内，以及测定HFn-DOX单体比例。
仪器：agilent 1260ⅡHPLC系统；分析柱：柱子：TSK-gel G4000SWXL分析柱，8μm，7.8×300mm；流速：0.5mL/min；温度：25℃时间：30min；压力设置：35bar；进样体积10μL；流动相：含15％甘油的pH7.0 50mM Tris-HCl。
具体操作：
单体比例测定。用流动相以0.5mL/min的流速平衡SEC分析柱3-5个柱体积，同时设定检测波长280nm、485nm，待柱子完全平衡后，自动进样10μL，依旧用流动相以0.5mL/min的流速运行30min，后按照SEC峰面积积分法得出单体峰面积比例，即为单体比例(具体测试结果参见本实施例第3部分)。
内包载DOX确定。以未包载DOX的HFn作为对照，测定HFn和HFn-DOX在280nm和485nm下的吸收峰。结果如图3-4所示：HFn(图3)在280nm条件下检测到峰，而在485nm条件下未检测到峰。HFn-DOX(图4)在280nm和485nm条件下均检测到峰，证明HFn包载了DOX。
2.3.4 HFn-DOX中载体HFn活性测定：
采用酶联免疫吸附法(ELISA)法测定HFn-DOX结合人端粒结合蛋白Trf1的活性，使用未包载DOX的HFn做阳性对照，不结合Trf1的LFn作为阴性对照，牛血清蛋白BSA和包被液作为系统参照。实验步骤：
(1)包被：使用包被液(碳酸缓冲液，pH9.0)将各组铁蛋白稀释到20μg/ml，将稀释的样品混匀后，按照实验设计加入到酶标板中，100μL/孔，每个样品三个复孔，覆上密封带，放入湿盒中，放至4℃冰箱，过夜。
(2)洗板：拿出洗板：将酶标板用PBST洗3次，PBS洗2次。注意每次洗板时水流应沿着孔侧壁加入。
(3)封闭：取封闭液(5％脱脂奶粉)，加入封闭液300μL/孔，覆上密封带，37℃培养箱中孵育2h。
(4)洗板：将酶标板用PBST洗3次，PBS洗2次。
(5)孵育TFR1：提前将TFR1(人源)用蛋白稳定剂(购自湖州英创生物科技有限公司PR-SS-002)稀释至2μg/mL(1：100)，混匀，100μL/孔，覆上密封膜，37℃培养箱中孵育2h。
(6)洗板：将酶标板用PBST洗3次，PBS洗2次。
(7)孵育一抗：提前将anti-TFR1抗体(鼠源)(购买自北京义翘神州科技有限公司11020-MM02)用蛋白稳定剂稀释至1μg/mL(1:1000)，混匀，100μL/孔，覆上Sealing Tape，37℃培养箱中孵育1h。
(8)洗板：将酶标板用PBST洗3次，PBS洗2次。
(9)孵育HRP酶标二抗：提前将anti-mouse IgG用HRP偶联稳定剂稀释(1:5000)，混匀，100μL/孔，覆上密封膜，37℃培养箱中孵育1h。
(10)洗板：将酶标板用PBST洗3次，PBS洗3次。
(11)显色：加入TMB一步显色液，注意避光，100μL/孔，立即用酶标仪测定OD652nm。
(12)结果分析：用Graphpad 6.0软件分析原始数据，选取时间点30分钟做成柱状图，纵坐标为吸收652nm值，横坐标为不同的测试样品。
结果如图5所示，用本实施方法获得的HFn-DOX与Trf1的结合不受影响，即其仍旧可以保留靶向性。
2.3.5 HFn-DOX中DOX活性测定：
通过测定样品在人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)上的杀伤作用查看DOX的活性，使用CCK-8试剂盒进行细胞杀伤实验，并以本实施例2.2部分制备的HFn-DOX以及等浓度的游离DOX进行对比，以获得HFn-DOX中的DOX活性。
实验步骤：
(1)加药刺激细胞
细胞培养24h后，分别用药物刺激，HFn/HFn(Dox)/Dox/Blank，按照表2配置一系列浓度梯度每个浓度三个复孔。配置的浓度以盐酸阿霉素药物含量的浓度计算。样品作用浓度以DOX浓度计，作用时间：72h。
表2
药物 系列浓度
HFn-Dox 10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04μM
Dox 10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04μM
HFn 10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04μM
Blank 不加入药品
(2)存活率测定
药物刺激72h后CCK-8试剂盒测定细胞存活率，OD 450读数。细胞存活率(100％)＝A(加药)/A(0加药)；其中，A(加药)为存在细胞及药物处理时的吸光度；A(0加药)为存在细胞未进行药物处理时的吸光度。
(3)实验结果
实验结果如图6所示，可以看出，药物孵育72小时后，HFn-DOX表现出了明显的细胞杀伤活性，且具有明确的量效关系，证明包药成功。
3.不同工艺参数条件下的测试结果
3.1不同DMSO浓度、甘油共孵育条件下的HFn-DOX包载
调整本实施例2.1部分的实验参数，辅料为15％甘油、缓冲体系为pH8.050mMTris-HCl、孵育时间15h。
结果显示:20％内的DSMO条件下均可包载DOX，其中10％的浓度包载较为稳定。
3.2溶液置换缓冲溶液中不同的辅料对HFn-DOX包载的影响
按照下表调整2.1部分的实验参数，DMSO浓度为10％、缓冲体系为pH8.0 50mMTris-HCl、孵育温度42℃，孵育时间15h、HFn浓度4mg/mL、DOX浓度0.75mg/mL。
结果显示：缓冲溶液中是否添加辅料以及不同辅料对最终HFn-DOX成品影响不大。
3.3不同孵育温度和时间对HFn-DOX包载的影响
按照下表调整2.1部分的实验参数，添加剂为15％甘油、缓冲体系为pH8.0 50mMTris-HCl、10％DMSO。
温度可以提高HFn包载DOX的速度，同时利于稳定HFn包载DOX工艺的体系。
3.4不同浓度缓冲溶液对HFn-DOX包载影响
按照下表调整本实施例2.1部分的实验参数，添加剂为15％甘油、缓冲体系为pH8.0 Tris-HCl、10％DMSO。
结果表明，不同浓度的Tris-HCl均可包载，但盐浓度越高越利于HFn-DOX的稳定，但盐浓度越高，HFn包载DOX的量降低。
3.5添加异丙醇对HFn-DOX包载影响
按照下表调整2.1部分的实验参数，添加剂为15％甘油和下表中的异丙醇、缓冲体系为pH8.0 50mM Tris-HCl、10％DMSO、42℃孵育15h。
异丙醇的浓度越高利于降低HFn的聚体的形成，但是随着异丙醇的浓度的提高会降低HFn包载DOX的量。
实施例2
加入有机溶剂甲醇-氯仿的体系下，含甘油条件的HFn-DOX包载工艺：
1.工艺参数
HFn：2.4mg/mL DOX：0.25mg/mL
甲醇-氯仿浓度：20％(v/v)甲醇：氯仿＝4:1
孵育温度：42℃、24℃
孵育时间：15h
孵育缓冲溶液：pH8.0 50mM Tris-HCl
辅料：15％甘油
2.工艺流程(10mL体系)
2.1样品准备及制备
将保存在pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液中的HFn浓缩至48mg/mL；使用甲醇：氯仿＝4:1的混合有机溶剂体系配制1.25mg/mL的DOX溶液。
用50mL离心管取1.5mL甘油，向其中加入2mL甲醇-氯仿体系的饱和DOX溶液，放入微小磁力转子在磁力搅拌器上最大转速(1500转/min)搅拌10min使其充分混合，将其置于42℃水浴下，后逐滴滴加6mL pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液并充分搅拌，最后逐滴滴加0.5mL HFn浓缩液，高速(1000转/min)搅10min，使得最终HFn浓度为2.4mg/mL，DOX浓度为0.25mg/mL。
使用振荡器将样品混合30s，然后置于42℃水浴锅中开始孵育15h。
2.2样品处理
提前开启AKTA avant 150蛋白纯化系统，选择Superdex G75脱盐柱，先使用去离子水清理系统及柱子，后用含15％甘油的pH:8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液平衡柱子(约3CV)，以及润洗上样环。孵育好的样品先冷却至室温后过0.22μm滤器，注入上样环中开始进样，用含15％甘油的pH:8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液洗脱，脱去游离DOX、DMSO等，A280紫外吸收条件下收集蛋白部分的洗脱液，即为HFn-DOX成品。
2.3样品测定及方法
2.3.1 HFn-DOX包载量测定：
按照实施例1中2.3.2部分相同的操作方法，用NANODROP测定样品在485nm处的吸光值，根据浓度曲线获得对应样品中DOX的浓度，测定样品的A280的数值，并扣除已测得的浓度的DOX A280值，除以蛋白的消光系数0.897即为HFn-DOX中HFn的浓度，计算出DOX/HFn摩尔比即为单位HFn分子中DOX的包载量(具体包载结果参见本实施例第3部分)。
2.3.2 HFn-DOX单体比例测定：
使用HPLC-SEC的方法测定HFn-DOX的单体比例，仪器：agilent 1260ⅡHPLC系统；分析柱：柱子：Agilent SEC-5 300A 8μm，7.8×300mm；流速：0.5mL/min；温度：25℃时间：30min；压力设置：50bar；进样体积10μL；流动相：含15％甘油的pH7.0 50mM Tris-Hcl。
具体操作与实施例1中2.3.3部分相同(具体测试结果参见本实施例第3部分)。
2.3.3 HFn-DOX中载体HFn活性测定：
按照实施例1中2.3.4部分相同的操作方法，采用ELISA法测定HFn的活性，与未包载DOX的HFn做参照，查看包载后HFn的活性，结果显示包载后的HFn-DOX与Trf1的结合不受影响。
2.3.4 HFn-DOX中DOX活性测定：
按照实施例1中2.3.5部分相同的操作方法，通过测定样品在HT-29细胞上的杀伤作用查看DOX的活性，使用CCK-8试剂盒进行细胞杀伤实验，并以HFn-DOX以及等浓度的游离DOX进行对比，以获得HFn-DOX中的DOX活性，结果显示包载后的HFn-DOX与游离DOX一样具备细胞杀伤活性。
3.不同工艺参数条件下的测试结果
按照下表调整2.1部分的实验参数，不同孵育温度下，甲醇-氯仿体系HFn-DOX包载。
结果显示：42℃下包载量微高于24℃，但单体比例低于后者。对于包载药物来说，相对于药物包载量而言，更重要的是单体比例，该实施例中下单体比例比较理想，药物包载量也在可接受范围内。
实施例3
加入有机溶剂甲醇的体系下，HFn-DOX包载工艺
1.工艺参数
HFn：4mg/mL、8mg/mL
DOX：1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL
甲醇浓度：10％、20％(v/v)
孵育温度：42℃
孵育时间：15h
孵育缓冲溶液：pH8.0 50mM Tris-HCl
辅料：15％(v/v)甘油、15％蔗糖
2.工艺流程(10mL体系)
2.1样品准备及制备
用5mL PE管称取不同量的DOX，分别加入对应量的甲醇和少量缓冲溶液混匀，后加入对应量的保存在pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液中的HFn定容至10mL，使得溶液中各成分浓度达到所设置的浓度。使用振荡器将混合样品震荡30s，然后置于42℃水浴锅中孵育15h。
2.2样品处理
提前开启AKTA avant 150蛋白纯化系统，选择Superdex G75脱盐柱，先使用去离子水清理系统及柱子，后用含15％甘油的pH:8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液平衡柱子(约3CV)，以及润洗上样环。孵育好的样品先冷却至室温后过0.22μm滤器，注入上样环中开始进样，脱去游离DOX、甲醇等，A280紫外吸收条件下收集蛋白部分的洗脱液，即为HFn-DOX成品。
2.3样品测定及方法
2.3.1 HFn-DOX包载量测定：
按照实施例1中2.3.2部分相同的操作方法，用NANODROP测定样品在485nm处的吸光值，根据浓度曲线获得对应样品中DOX的浓度，测定样品的A280的数值，并扣除已测得的浓度的DOX A280值，除以蛋白的消光系数0.897即为HFn-DOX中HFn的浓度，计算出DOX/HFn摩尔比即为单位HFn分子中DOX的包载量。
2.3.2 HFn-DOX单体比例测定：
使用HPLC-SEC的方法测定HFn-DOX的单体比例，仪器：agilent 1260ⅡHPLC系统；分析柱：柱子：Agilent SEC-5 300A 8μm，7.8×300mm；流速：0.5mL/min；温度：25℃时间：30min；压力设置：50bar；进样体积10μL；流动相：含15％甘油的pH7.0 50mM Tris-Hcl。
具体操作与实施例1中2.3.3部分相同(具体测试结果参见本实施例第3部分)。
2.3.3 HFn-DOX中载体HFn活性测定：
按照实施例1中2.3.4部分相同的操作方法，采用ELISA法测定HFn的活性，与未包载DOX的HFn做对比，查看包载后HFn的活性，结果显示包载后的HFn-DOX与Trf1的结合不受影响。
2.3.4 HFn-DOX中DOX活性测定：
按照实施例1中2.3.5部分相同的操作方法，通过测定样品在HT-29细胞上的杀伤作用查看DOX的活性，使用CCK-8试剂盒进行细胞杀伤实验，并以HFn-DOX以及等浓度的游离DOX进行对比，以获得HFn-DOX中的DOX活性，结果显示包载后的HFn-DOX与游离DOX一样具备细胞杀伤活性。
3.不同工艺参数条件下的测试结果
3.1不同甲醇浓度下的HFn-DOX包载
调整2.1部分的实验参数，不同甲醇浓度下，甲醇体系HFn-DOX包载。
总结：随着甲醇浓度增加，单体比例降低。
3.2不同HFn/DOX浓度配比下的HFn-DOX包载
调整2.1部分的实验参数，不同HFn和DOX浓度下，甲醇体系HFn-DOX包载。
总结：相同甲醇浓度下，DOX的浓度越高，包载量越高。但较高浓度的DOX会引起体系状态变浑浊。
3.3不同溶液置换缓冲溶液对HFn-DOX包载的影响
DMSO浓度为10％、缓冲体系为pH8.0 50mM Tris-HCl、孵育温度42℃，孵育时间15h、HFn浓度4mg/mL、DOX浓度0.75mg/mL。
结果显示：溶液置换缓冲溶液中是否添加辅料以及辅料种类对最终HFn-DOX成品影响不大。
实施例4
经DMSO前处理后的HFn在15％甘油条件下的HFn-DOX包载工艺
1.工艺参数
HFn：4mg/mL DOX：1.0mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL
DMSO浓度：5％、15％、25％(v/v)
孵育温度：42℃
孵育时间：15h
孵育缓冲溶液：pH8.0 50mM Tris-HCl
添加剂：15％(v/v)甘油
2.工艺流程(2mL体系)
2.1样品准备及制备
将浓缩后的HFn取2mL，向其中加入DMSO至终浓度为15％，后用含15％DMSO的pH8.050mM Tris-HCl溶液稀释至10mL，搅拌2h，超滤至2mL取出继续用含25％DMSO的pH8.0 50mMTris-HCl溶液稀释至10mL，搅拌2h，超滤至1mL取出过滤后测蛋白浓度备用，其中超滤具体处理条件为：15mL超滤管以3700r/min在台式离心机上超滤离心，超滤管截留分子量为100KD。
用5mLPE管分别取DOX和DMSO加入到上述溶液混匀，使DOX按2mL体积计算终浓度为1.0mg/mL、0.75mg/mL和0.5mg/mL；DMSO按2mL体积计算浓度为5％和15％，后根据上述测定的HFn浓度，计算需要补足的HFn量，加入对应量的保存在pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液中的HFn并定容至2mL。使用振荡器将混合样品震荡30s，然后置于42℃水浴锅中孵育15h。
2.2样品处理
提前开启AKTA avant 150蛋白纯化系统，选择Superdex G75脱盐柱，先使用去离子水清理系统及柱子，后用含15％甘油的pH:8.0 50mM Tris-HCl缓冲溶液平衡柱子(约3CV)，以及润洗上样环。孵育好的样品先冷却至室温后过0.22μm滤器，注入上样环中开始进样，用含15％甘油的pH:8.050mM Tris-HCl缓冲溶液洗脱，脱去游离DOX、DMSO及脲，A280紫外吸收条件下收集蛋白部分的洗脱液，即为HFn-DOX成品。
2.3样品测定及方法
2.3.1 HFn-DOX包载量测定：
按照实施例1中2.3.2部分相同的操作方法，用NANODROP测定样品在485nm处的吸光值，根据浓度曲线获得对应样品中DOX的浓度，测定样品的A280的数值，并扣除已测得的浓度的DOX A280值，除以蛋白的消光系数0.897即为HFn-DOX中HFn的浓度，计算出DOX/HFn摩尔比即为单位HFn分子中DOX的包载量(具体包载结果参见本实施例第3部分)。
2.3.2 HFn-DOX单体比例测定：
使用HPLC-SEC的方法测定HFn-DOX的单体比例，仪器：agilent 1260ⅡHPLC系统；分析柱：柱子：Agilent SEC-5 300A 8μm，7.8×300mm；流速：0.5mL/min；温度：25℃时间：30min；压力设置：50bar；进样体积10μL；流动相：含15％甘油的pH7.0 50mM Tris-Hcl。
具体操作与实施例1中2.3.3部分相同(具体测试结果参见本实施例第3部分)。
2.3.3 HFn-DOX中载体HFn活性测定：
按照实施例1中2.3.4部分相同的操作方法，采用ELISA法测定HFn的活性，与未包载DOX的HFn做对比，查看包载后HFn的活性，结果显示包载后的HFn-DOX与Trf1的结合不受影响。
2.3.4 HFn-DOX中DOX活性测定：
按照实施例1中2.3.5部分相同的操作方法，通过测定样品在HT-29细胞上的杀伤作用查看DOX的活性，使用CCK-8试剂盒进行细胞杀伤实验，并以HFn-DOX以及等浓度的游离DOX进行对比，以获得HFn-DOX中的DOX活性，结果显示包载后的HFn-DOX与游离DOX一样具备细胞杀伤活性。
3不同工艺参数条件下的测试结果
3.1 DMSO前处理HFn对DMSO体系HFn-DOX的影响
调整2.1部分的实验参数，HFn浓度为4mg/ml，DOX浓度为0.75mg/ml，采用15％甘油体系。
总结：DMSO处理组和未处理组所得到的HFn-DOX包载差异不大。
3.2孵育时不同浓度DMSO及不同HFn/DOX浓度比例对DMSO前处理后的HFn包载DOX的影响
调整本实施例2.1部分的实验参数，不同DMSO和DOX浓度下孵育，DMSO体系HFn-DOX包载。
总结：15％DMSO条件下，包载效果较25％DMSO条件下更好；相同DMSO浓度下，DOX浓度越高，包载量越高，综合，0.75mg/mL DOX时包载效果较优。

Claims (38)

1.一种包载药物的笼状蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；
步骤(a)中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇或甲醇和氯仿混合有机溶剂；
步骤(a)所述混合溶液含有Tris-HCl，所述Tris-HCl的浓度为10-100mmol/L，pH为8.0；
所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-20％；
所述步骤(a)所述混合溶液中笼状蛋白的浓度为1-20mg/mL；
步骤(a)所述混合溶液中药物的浓度为0.1-1.5mg/mL；
和步骤(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液；
所述步骤(b)包括如下工序：
将步骤(a)制得的含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液放置于25℃-50℃，孵育时间为10-20h；或将步骤(a)制得的含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液放置于55℃-60℃，孵育时间为1-3h；
还包括步骤(c)：去除笼状蛋白笼外的游离药物和有机溶剂；
步骤(a)采用混合或者溶液置换的方式；
所述溶液置换采用如下一种或两种以上的工艺进行：
工艺A：通过透析的方式将笼状蛋白的溶液笼外溶液置换成为含有有机溶剂的溶液；
工艺B：通过离心过滤的方式；
工艺C：通过凝胶过滤层析的方式；
所述步骤(c)包括如下去除方式中的一种或两种以上的任意组合：
去除方式1：通过透析的方式；
去除方式2：通过离心过滤的方式；
去除方式3：通过凝胶过滤层析的方式；
去除方式1-3使用缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl，所述Tris-HCl的浓度为10-100mmol/L，pH为8.0；
所述笼状蛋白选自铁蛋白，所述铁蛋白包括人H型铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，工艺B中所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述超滤离心管截留分子量为50-150KD。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述超滤离心管截留分子量为100KD。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，工艺C中所述凝胶过滤层析的方式是使用Superdex75pg凝胶柱过滤层析。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(a)中所述有机溶剂选自二甲基亚砜。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-15％。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-10％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(a)所述混合溶液含有Tris-HCl，所述Tris-HCl的浓度为25-75mmol/L。
10.根据权利要求9述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为40-75mmol/L。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为45-55mmol/L。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为50mmol/L。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(a)所述混合溶液中笼状蛋白的浓度为2-8mg/mL。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(a)所述混合溶液中笼状蛋白的浓度2-6mg/mL。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述药物选自氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、卡铂、草酸铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤、培美曲塞、5-FU、FT-207、卡培他滨、6-巯基嘌呤、6-TG、羟基脲、阿糖胞苷、吉西他滨、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、氯醌、心得安、戊烷脒、表阿霉素、癌霉素、盐酸阿霉素、THP-阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素、伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱、紫杉醇、多西他赛、长春花碱、去甲长春花碱、鬼臼碱类、高三尖杉酯碱、门冬酰胺酶、三苯氧胺、托瑞米芬、依西美坦、氨苯乙哌啶酮、福美司坦、来曲唑、阿那曲唑、甲孕酮、甲地孕酮、甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮、己烯雌酚、阿托品、多巴胺、毛果芸香碱、蒽胺、苯海索、苯扎托品、丙环定、麦角碱类衍生物、氟它氨、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和贝伐珠单抗中的一种或两种以上。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述药物选自柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、盐酸阿霉素、THP-阿霉素、盐酸伊立替康、阿替洛尔、盐酸川穹嗪、马钱子碱、盐酸左氧氟沙星、左旋多巴、盐酸洛拉曲克和米托蒽醌中的一种或两种以上。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，所述药物选自阿霉素、表阿霉素、盐酸阿霉素和THP-阿霉素中的一种或两种以上。
18.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(a)所述混合溶液中药物的浓度为0.2-1mg/mL。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，所述药物的浓度为0.25-0.75mg/mL。
20.根据权利要求18所述的制备方法，其中，所述药物的浓度为0.5-0.75mg/mL。
21.根据权利要求1所述的制备方法，其中，去除方式2中所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其中，所述超滤离心管截留分子量为2-5KD。
23.根据权利要求21所述的制备方法，其中，所述超滤离心管截留分子量为3KD。
24.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为25-75mmol/L。
25.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为40-75mmol/L。
26.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为45-55mmol/L。
27.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述Tris-HCl的浓度为50mmol/L。
28.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(a)所述混合溶液，以及步骤(c)所述的缓冲溶液还含有辅料。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其中，所述辅料选自甘油、蔗糖、异丙醇、葡萄糖、海藻糖和乳糖的一种或两种以上。
30.根据权利要求28所述的制备方法，其中，所述混合溶液中的甘油或异丙醇的体积百分比浓度为5-20％；和/或，蔗糖、乳糖或海藻糖的质量百分比浓度为5-20％。
31.根据权利要求30所述的制备方法，其中，所述甘油或异丙醇的体积百分比浓度为5-15％。
32.根据权利要求30所述的制备方法，其中，所述甘油或异丙醇的体积百分比浓度为10-15％。
33.根据权利要求30所述的制备方法，其中，所述蔗糖的质量百分比浓度为5-15％。
34.根据权利要求30所述的制备方法，其中，所述蔗糖的质量百分比浓度为10-15％。
35.根据权利要求1-34任一项所述的制备方法制备获得的产品。
36.权利要求35所述的产品在制备药物中的应用。
37.权利要求36所述的应用，其中，所述药物包括权利要求35所述的产品和药物辅料。
38.权利要求36所述的应用，其中，所述药物包括含有权利要求35所述的产品的药物组合物。
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