CN112439073A - 一种大分子铂类前药及制备方法和应用 - Google Patents

一种大分子铂类前药及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大分子铂类前药及制备方法和应用，向透明质酸水溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5～4小时后加入3,3'‑二硫代二丙酰肼，再继续搅拌8～36小时后进行透析和冷冻干燥，获得酰肼化透明质酸；将酰肼化透明质酸制成酰肼化透明质酸水溶液，然后将酰肼化透明质酸水溶液与铂类药物溶液混合0.5～8小时，经透析和冷冻干燥得到所述的大分子铂类前药。该大分子铂类前药具有制备工艺简单、反应条件温和、载药效率高、适用多种铂类抗肿瘤药物等优点，可广泛用于各种肿瘤的治疗。

Description

一种大分子铂类前药及制备方法和应用
技术领域
本发明属于前药制剂技术领域，具体涉及一种大分子铂类前药及制备方法和应用。
背景技术
铂类抗肿瘤药物是临床肿瘤化疗的常用药物，具有抗肿瘤谱广、效率好、可与其他药物协同抗癌等特点，广泛用于肺癌、肝癌、胃癌等的化疗或联合治疗，其涉及约三分之一的肿瘤化疗方案。然而，临床所用铂类抗肿瘤药物多为游离态药物，存在体内代谢寿命短、肿瘤组织积累效应差、毒副作用大、易产生耐药等问题，极大限制着其使用剂量，严重制约了其临床应用范围和治疗效果。
近年来研究表明，化疗药物若能制成大分子前药或纳米药物，可显著延长药物机体内循环时间、改善其疗效和降低毒副作用，如阿霉素和紫杉醇等的大分子前药或纳米药物已在临床广泛使用，可通过肿瘤组织的“EPR效应”显著提高抗肿瘤效果。然而，铂类抗肿瘤药物因具有一定的水溶性和缺乏形成可逆化学键的功能基团，其大分子前药和纳米化的研究一直是难以攻克的技术难题。顺铂是最早应用于临床的铂类抗肿瘤药物，时至今日已发展出四代铂类抗肿瘤药物，但仍未见可用于临床的铂类大分子前药或纳米药物。目前，大分子铂类药物的研究主要集中于顺铂，因为其含有的铂元素与羧基经配位作用结合形成配位物，可制成前药或实现纳米化，所用材料主要为聚谷氨酸、聚天冬氨酸或其羧基化改性后的共聚物。然而，这种方法的载药时间通常需要2至3天的时间，效率较低，降解性能不好，且冻干后的粉体不易复溶。同时，大部分铂类药物很难制备出大分子前药和纳米药物。
发明内容
针对游离态铂类抗肿瘤药物剂量限制性毒性、肿瘤组织有效积累差、易产生耐药性等问题，本发明的目的是提供一种大分子铂类前药及制备方法和应用。这种前药制备方法适用于多种铂类抗肿瘤药物，对高表达CD44或透明质酸结合蛋白的肿瘤细胞具有主动靶向功能，可在中性条件下稳定存在并可响应肿瘤微环境的酸性和还原性特点实现肿瘤特异性药物释放，从而提高铂类药物的抗肿瘤效果和避免对正常组织的严重的毒副作用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种大分子铂类前药的制备方法，包括如下步骤：
(1)向透明质酸水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5～4小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，再继续搅拌8～36小时后进行透析和冷冻干燥，获得酰肼化度为5％～60％的酰肼化透明质酸；
(2)将酰肼化透明质酸制成酰肼化透明质酸水溶液，然后将酰肼化透明质酸水溶液与铂类药物溶液混合0.5～8小时，经透析和冷冻干燥得到所述的大分子铂类前药。
本发明进一步的改进在于：所述步骤(1)中的透明质酸的分子量为3000Da～100kDa，透明质酸水溶液的质量浓度为0.5％～10％。
本发明进一步的改进在于：所述步骤(1)中的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量是酰肼化度的1.1倍，N-羟基琥珀酰亚胺物质的量是酰肼化度的1.3～1.7倍，3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量是酰肼化度的4～20倍。
本发明进一步的改进在于：所述步骤(2)中的铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂或洛铂。
本发明进一步的改进在于：所述酰肼化透明质酸水溶液的质量浓度为0.2％～5％，铂类药物溶液的浓度为0.2～26mg/mL，酰肼化透明质酸水溶液和铂类药物水溶液的体积比为10:1～100:1。
本发明进一步的改进在于：所述的透析的条件是透析袋截留分子量为1000Da，对水透析2～12小时；所述的冷冻干燥条件是零下20摄氏度保持12～48小时。
一种根据上述的方法制备的大分子铂类前药。
一种如上述的大分子铂类前药在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
本发明进一步的改进在于：肿瘤为乳腺癌或肝癌。
一种如上述的大分子铂类前药在制备用于治疗高表达CD44受体或透明质酸结合蛋白1受体的乳腺癌和肝癌细胞的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)铂类药物通过酰肼-铂配位载于透明质酸分子上，其连接键中含有二硫键，它们分别具有响应酸性和还原性而断裂的特点，使得本发明的铂类前药具有响应肿瘤微环境酸性和还原性的双刺激响应性释放药物的功能，同时载体中的二硫键可消耗肿瘤细胞高表达的可使铂类药物耐药的谷胱甘肽，有利于克服铂类药物的耐药性。
(2)载体材料为透明质酸，生物相容性和生物可降解性优异，且无免疫原性，对高表达CD44或透明质酸结合蛋白的肿瘤具有主动靶向功能，结合肿瘤组织对大分子的“EPR效应”，可显著提高药物在肿瘤组织中的积累，从而提高疗效和降低毒副作用。
(3)适用于目前临床使用的各种铂类抗肿瘤药物，如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂等，载药量可在5％～30％范围内调节，可广泛用于多种肿瘤的治疗。
(4)铂类前药制备过程主要包括透明质酸酰肼化改性和酰肼化透明质酸/铂类药物溶液共混两步，反应均在水相室温下完成，具有工艺简单、反应条件温和、载药时间短等优点，临床转化前景好。
附图说明
图1是实施例1中透明质酸原料及酰肼化透明质酸的红外光谱，其中，a为透明质酸原料，b为酰肼化透明质酸。
图2是实施例1合成的酰肼化透明质酸的1H NMR谱图。a为透明质酸原料，b是实施例1合成的酰肼化透明质酸。
图3是实施例1制备的透明质酸-顺铂偶联物前药对肝癌(HepG2)细胞的杀伤效果，以游离顺铂作为对照。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于此。
本发明的一种大分子铂类前药，具体为由3,3'-二硫代二丙酰肼改性透明质酸得到的酰肼化透明质酸和铂类抗肿瘤药物经配位作用形成的配位物，其制备方法包括如下步骤：
(1)酰肼化透明质酸的合成：将透明质酸溶于水中制成质量浓度为0.5％～10％的溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5～4小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，再继续搅拌8～36小时后进行透析和冷冻干燥，获得酰肼化度为5％～60％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-铂类前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为0.2％～5％的水溶液，然后与质量浓度为0.2～26mg/mL的铂类药物溶液混合0.5～8小时，经透析和冷冻干燥获得所述的大分子铂类前药。
所述步骤(1)中的透明质酸的分子量为3000Da～100kDa。
所述步骤(1)中的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和3,3'-二硫代二丙酰肼的摩尔数分别是酰肼化度的1.1、1.3～1.7、4～20倍。
所述步骤(2)中的铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂或洛铂等。
所述步骤(2)中的酰肼化透明质酸水溶液和铂类药物水溶液的体积比为10:1～100:1。
所述的透析的条件是透析袋截留分子量为1000Da，对水透析2～12小时；所述的冷冻干燥条件是零下20摄氏度保持12～48小时。
一种大分子铂类前药，可用于各种肿瘤的治疗，尤其是高表达CD44受体或透明质酸结合蛋白1受体的乳腺癌和肝癌等肿瘤，其可特异性靶向高表达CD44受体或透明质酸结合蛋白1受体的乳腺癌和肝癌细胞。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为8000Da的透明质酸溶于水中制成质量浓度为3％的溶液；向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，它们的用量分别是酰肼化度的1.1、1.3、5倍；再继续搅拌36小时后进行透析(截留分子量为1000Da)12小时和零下20摄氏度冷冻干燥24小时，获得酰肼化度为20％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-顺铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为0.2％的水溶液，然后与质量浓度为1mg/mL的顺铂溶液混合5小时，酰肼化透明质酸水溶液和顺铂药物水溶液的体积比为10:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)6小时和零下20摄氏度冷冻干燥24小时，获得大分子顺铂前药。
图1中b是实施例1合成的酰肼化透明质酸的红外光谱图，与透明质酸原料的红外光谱图a相比，在1596cm-1处出现了一个新吸收峰，这是酰肼基团的特征峰，证明透明质酸已成功实现酰肼化改性。
图2中b是实施例1合成的酰肼化透明质酸的1H NMR谱图，与透明质酸原料的1H NMR谱图a相比，在化学位移2.53ppm和2.85ppm处多出两个质子峰，分别对应于3,3'-二硫代二丙酰肼中的两种亚甲基，证实酰肼化透明质酸的合成是成功了，与红外光谱的表征结果一致。
图3是实施例1制备的透明质酸-顺铂前药在浓度为20微克/毫升时杀伤肝癌HepG2细胞的效果。从图可以看出，对细胞用药后，随着培养时间增加，游离顺铂对照组和实验组中的细胞存活率均逐渐降低，并且游离顺铂对照组和实验组的杀伤效果的差异随时间增加显著降低。表明大分子顺铂发挥疗效的时间比游离顺铂有所推后，但仍具有与顺铂一致的疗效。
实施例2
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为100kDa的透明质酸溶于水中制成质量浓度为0.5％的溶液；向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，它们的用量分别是酰肼化度的1.1、1.5、10倍；再继续搅拌36小时后进行透析(截留分子量为1000Da)10小时和零下20摄氏度冷冻干燥40小时，获得酰肼化度为10％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-卡铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为0.5％的水溶液，然后与质量浓度为12mg/mL的卡铂溶液混合8小时，酰肼化透明质酸水溶液和卡铂水溶液的体积比为10:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)12小时和零下20摄氏度冷冻干燥24小时，获得所述的大分子卡铂前药。
实施例3
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为8000Da的透明质酸溶于水中制成质量浓度为7％的溶液；向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1.5小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，它们的用量分别是酰肼化度的1.1、1.4、6倍；再继续搅拌26小时后进行透析(截留分子量为1000Da)10小时和零下20摄氏度冷冻干燥38小时，获得酰肼化度为20％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-奈达铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为0.3％的水溶液，然后与质量浓度为8mg/mL的奈达铂溶液混合4小时，酰肼化透明质酸水溶液和奈达铂水溶液的体积比为15:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)10小时和零下20摄氏度冷冻干燥35小时，获得所述的大分子奈达铂前药。
实施例4
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为50kDa的透明质酸溶于水中制成质量浓度为1％的溶液；向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，它们的用量分别是酰肼化度的1.1、1.3、8倍；再继续搅拌35小时后进行透析(截留分子量为1000Da)6小时和零下20摄氏度冷冻干燥28小时，获得酰肼化度为30％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-洛铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为1％的水溶液，然后与质量浓度为12mg/mL的洛铂溶液混合0.5～8小时，酰肼化透明质酸水溶液和洛铂水溶液的体积比为15:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)9小时和零下20摄氏度冷冻干燥36小时，获得所述的大分子洛铂前药。
实施例5
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为3000Da的透明质酸溶于水中制成质量浓度为0.5％的溶液；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'-二硫代二丙酰肼的用量分别是酰肼化度的1.1、1.7、20倍；再继续搅拌20小时后进行透析(截留分子量为1000Da)6小时和零下20摄氏度冷冻干燥28小时，获得酰肼化度为60％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-洛铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为0.2％的水溶液，然后与质量浓度为26mg/mL的洛铂溶液混合0.5～8小时，酰肼化透明质酸水溶液和洛铂水溶液的体积比为25:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)2小时和零下20摄氏度冷冻干燥12小时，获得所述的大分子洛铂前药。
实施例6
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为100kDa的透明质酸溶于水中制成质量浓度为5％的溶液；向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'-二硫代二丙酰肼的用量分别是酰肼化度的1.1、1.5、4倍；再继续搅拌8小时后进行透析(截留分子量为1000Da)12小时和零下20摄氏度冷冻干燥28小时，获得酰肼化度为5％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-洛铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为0.2％的水溶液，然后与质量浓度为0.2mg/mL的洛铂溶液混合0.5～8小时，酰肼化透明质酸水溶液和洛铂水溶液的体积比为100:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)12小时和零下20摄氏度冷冻干燥48小时，获得所述的大分子洛铂前药。
实施例7
(1)酰肼化透明质酸的合成：将分子量为10kDa的透明质酸溶于水中制成质量浓度为10％的溶液；向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'-二硫代二丙酰肼的用量分别是酰肼化度的1.1、1.5、15倍；再继续搅拌36小时后进行透析(截留分子量为1000Da)2小时和零下20摄氏度冷冻干燥28小时，获得酰肼化度为30％的酰肼化透明质酸；
(2)透明质酸-洛铂前药的形成：将酰肼化透明质酸制成质量浓度为2％的水溶液，然后与质量浓度为26mg/mL的洛铂溶液混合0.5～8小时，酰肼化透明质酸水溶液和洛铂水溶液的体积比为10:1，经对水透析(截留分子量为1000Da)9小时和零下20摄氏度冷冻干燥36小时，获得所述的大分子洛铂前药。
本发明中酰肼化透明质酸和铂类抗肿瘤药物在水性介质中经配位作用形成配位物。本发明的大分子铂类前药在中性条件下具有很好的稳定性，而在肿瘤组织的弱酸性环境中会因酰肼基团的质子化作用促使配位作用消失，同时酰肼侧链中的二硫键会消耗肿瘤细胞中的谷胱甘肽而断裂，从而释放铂类药物并避免肿瘤细胞因谷胱甘肽造成的铂类药物耐药问题，提高铂类抗肿瘤药物的治疗效果。该大分子铂类前药具有制备工艺简单、反应条件温和、载药效率高、适用多种铂类抗肿瘤药物等优点，可广泛用于各种肿瘤的治疗。

Claims (10)

1.一种大分子铂类前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向透明质酸水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5～4小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，再继续搅拌8～36小时后进行透析和冷冻干燥，获得酰肼化度为5％～60％的酰肼化透明质酸；
(2)将酰肼化透明质酸制成酰肼化透明质酸水溶液，然后将酰肼化透明质酸水溶液与铂类药物溶液混合0.5～8小时，经透析和冷冻干燥得到所述的大分子铂类前药。
2.根据权利要求1所述的一种大分子铂类前药的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的透明质酸的分子量为3000Da～100kDa，透明质酸水溶液的质量浓度为0.5％～10％。
3.根据权利要求1所述的一种大分子铂类前药的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量是酰肼化度的1.1倍，N-羟基琥珀酰亚胺物质的量是酰肼化度的1.3～1.7倍，3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量是酰肼化度的4～20倍。
4.根据权利要求1所述的一种大分子铂类前药的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂或洛铂。
5.根据权利要求1所述的一种大分子铂类前药的制备方法，其特征在于：所述酰肼化透明质酸水溶液的质量浓度为0.2％～5％，铂类药物溶液的浓度为0.2～26mg/mL，酰肼化透明质酸水溶液和铂类药物水溶液的体积比为10:1～100:1。
6.根据权利要求1所述的一种大分子铂类前药的制备方法，其特征在于：所述的透析的条件是透析袋截留分子量为1000Da，对水透析2～12小时；所述的冷冻干燥条件是零下20摄氏度保持12～48小时。
7.一种根据权利要求1-6中任意一项所述的方法制备的大分子铂类前药。
8.一种如权利要求7所述的大分子铂类前药在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，肿瘤为乳腺癌或肝癌。
10.一种如权利要求7所述的大分子铂类前药在制备用于治疗高表达CD44受体或透明质酸结合蛋白1受体的乳腺癌和肝癌细胞的药物中的应用。
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